針對her2的雙特異性抗體的制作方法

針對her2的雙特異性抗體的制作方法【專利摘要】公開了雙特異性抗體，其包含結合人表皮生長因子受體2（HER2）的兩個不同表位的抗原結合區，以及相關的基于抗體的組合物和分子。還公開了包含所述抗體的藥物組合物以及制備和使用抗體的方法。【專利說明】針對HER2的雙特異性抗體發明領域[0001]本發明涉及針對人表皮生長因子受體2(HER2)的雙特異性抗體，和這類抗體的用途，特別是其在治療癌癥中的用途。[0002]發明背景[0003]HER2是一種185kDa的細胞表面受體酪氨酸激酶(cellsurfacereceptortyrosinekinase)和表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)家族的成員，所述家族包括四種不同的受體:EGFR/ErbB-l、HER2/ErbB_2、HER3/ErbB_3、和HER4/ErbB-4。所述EGFR家族的四種成員形成同二聚體和異二聚體，其中HER2是優選的且是其它ErbB受體的最強的二聚配偶體(Graus-Porta等人，EmboJ1997；16:1647-1655；Tao等人，JCellSci2008;121:3207-3217)。HER2可以通過過表達或通過與其它可以由配體結合而激活的ErbB的異二聚化而激活(Riese和Stern,Bioessaysl998；20:41-48)。對于HER2，還沒有鑒定出配體。HER2活化導致受體磷酸化，其通過多種信號途徑，如MAPK、磷酸肌醇3-激酶/AKT、JAK/STAT、和PKC，而觸發下游的信號級聯放大，其最終導致多種細胞功能的調節，如生長、存活、和分化(Huang等人，ExpertOpinBiolTher2009;9:97-110)。[0004]對HER2在腫瘤方面的關注很多集中在其在乳腺癌(breastcancer)中的作用，其中HER過表達在大約20%的病例中報道，且其與不良的預后有關聯(Reese等人，StemCellsl997;15:1-8;Andrechek等人，ProcNatlAcadSciUSA2000;97:3444-3449;和Slamon等人，Sciencel987;235:177-182)。除了乳腺癌以外，HER2表達還與其它人癌瘤種類關聯，包括前列腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、食管癌、和頭和頸的鱗狀細胞癌(GarciadePalazzo等人，IntJBiolMarkersl993;8:233-239;Ross等人,0ncologist2003；8:307-325；Osman等人，JUrol2005;174:2174-2177；Kapitanovic等人，Gastroenterology1997;112:1103-1113`;Turken等人，Neoplasma2003;50:257-261;和Oshima等人，IntJBiolMarkers2001;16:250-254)。[0005]曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin''(HerceptirT')).是一種重組的、人源化單克隆抗體，其針對HER2蛋白質的域IV，由此在高HER2過表達的細胞內阻斷配體非依賴性HER2同二聚化，并在較小的程度上還阻斷HER2與其它家族成員的異二聚化(Cho等人，Nature2003；421:756-760和Wehrman等人，ProcNatlAcadSciUSA2006；103:19063-19068)。在具有中等HER2表達水平的細胞中，發現了曲妥珠單抗抑制HER2/EGFR異二聚體的形成(Wehrman等人，(2006)，同上；Schmitz等人，ExpCellRes2009；315:659-670)。曲妥珠單抗介導抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)并阻止胞外域脫落(ectodomainshedding),否則其會導致在HER2過表達細胞中形成截短的組成型活性蛋白質。而且，還對于曲妥珠單抗報道了對高水平表達HER2的腫瘤細胞的體外和體內的增殖(在Nahta和Esteva,0ncogene2007;26:3637-3643中綜述)的抑制。nea'eplirT已被批準用于HER2過表達轉移性乳腺癌的一線治療和輔佐治療，無論是與化學療法組合還是在一種或多種化學療法之后的單劑。曲妥珠單抗被發現僅在20-50%的HER2過表達乳腺癌患者中有效，且許多初始反應者(responder)在幾個月后顯示了復發(Dinh等人，ClinAdvHematol0ncol2007;5:707-717)。還批準了與順鉬(cisplatin)和氟嘧唳(fIuoropyrimidine)(卡培他濱(capecitabine)或5-氟尿嘧唳(5-fIuorouracil))組合的Herccp丨inv用于治療患有HER2過表達的轉移性胃腺癌瘤或胃食管連接部(GE)腺癌瘤，且未接受過在先的對轉移性疾病的治療的患者。[0006]帕妥珠單抗(Pertuzumab)(Omnitarg?)是另一種人源化單克隆抗體。其針對HER2蛋白質的域II，導致對配體誘導的異二聚化的抑制(即HER2與已結合配體的ErbB家族的另一個成員的二聚化)；其據報道為不嚴格需要高HER2表達水平的機制(Franklin等人，CancerCell2004;5:317-328)。雖然帕妥珠單抗也介導ADCC，帕妥珠單抗的主要作用機制依賴其對二聚化的阻斷(Hughes等人，MolCancerTher2009;8:1885-1892)。此外，發現帕妥珠單抗通過抑制EGFR/HER2異二聚體的形成而增強EGFR內化(internalization)和下調，否則所述異二聚體在質膜表面將EGFR拘束(Hughes等人，2009，同上)。這一點與所觀察到的EGFR同二聚體比EGFR/HER2二聚體的內化更有效相關聯(Pedersen等人，MolCancerRes2009;7:275-284)。[0007]另一種提出的基于HER2的治療方法是將針對不同HER2表位的HER2抗體組合，在體外和體內腫瘤模型中都已經報道了其在降低腫瘤生長方面比單獨的HER2抗體更有效(Emde等人，0ncogene2011;30:1631-1642;Spiridon等人，ClinCancerres2002;8:1720-1730)。例如，據報道，當在患者中將兩者組合時，帕妥珠單抗和曲妥珠單抗的互補性機制導致增強的抗腫瘤作用和功效，所述患者是之前的曲妥珠單抗療法期間有進展的患者(Baselga等人，JClin0ncol2010;28:1138-1144)。在III期臨床試驗(CLEOPATRA)中已經在患者中顯示了帕妥珠單抗加曲妥珠單抗的抗體組合與多烯他賽一起導致了與曲妥珠單抗與多西他賽一起相比延長的無進展生存(prolongedprogression-freesurvival),所述患者患有之前未治療過的HER2陽性轉移性乳腺癌。[0008]改進靶向性的抗體療法的另一種途徑是通過向表達抗原的癌細胞特異性地遞送細胞毒性細胞或藥物。[0009]HER2抗體藥物綴合物(antibodydrugconjugate,ADC)現在正在臨床研發中。T-DMl由綴合至真菌毒素美登素(maytansine)的曲妥珠單抗所組成。在II期臨床試驗中，在接受重度預治療的患者組中報道了響應，所述預治療包括之前的曲妥珠單抗和/或拉帕替尼(Iapatinib)療法(Burris等人，2011，JClin0ncol29:398-405和LewisPhillips等人，CancerRes2008;68:9280-9290)。報道了來自在患者HER2陽性轉移性乳腺癌中確定T-DMl相對于曲妥珠單抗加多西他賽的功效和安全性的II期臨床試驗的初步數據，所述患者之前沒有對轉移性疾病進行化療(Perez等人，AbstractBA3,EuropeanSocietyforMedicalOncologymeeting2010)。正在患有HER2陽性的局部晚期乳腺癌或轉移性乳腺癌的患者中評估T-DMl相對于卡培他濱(capecitabine)+拉帕替尼的功效和安全性的III期臨床試驗(EMILIA)，所述患者接受過之前的曲妥珠單抗療法。在患有晚期HER2陽性乳腺癌的患者中的評估T-DMl用于一線治療的III期臨床試驗(MARIANNE)已經在2010年7月開始。[0010]雖然為HER2靶向性療法選擇合適抗體牽涉許多因素，但如果HER2抗體復合體在抗體結合后有效地內化，則對于ADC方式通常是一種優勢。對鼠類HER2抗體的研究已經顯示了抗體的某些組合會激發HER2的胞吞作用(Ben-Kasus等人，PNAS2009;106:3294-9)。已經報道了當結合至HER2抗原和結合相同的表位時，人HER2抗體F5和Cl相對較迅速地內化(W099/55367和W02006/116107)。然而，當與EGFR相比時，HER2的內化是受損。的確，EGFR同二聚體的內化比HER2同二聚體有效得多地(Dinh等人，IinAdvHematolOnco12007;5:707-717)。EGFR,以及HER3，可以分別通過形成EGFR/HER2和HER3/HER2異二聚體而提高HER2的胞吞作用(Baulida等人，JBiolCheml996;271:5251-5257;PedersenNM等人，MolCancerRes2009;7:275-84)。[0011]或者，可以通過將兩個不同的Fab臂在一種分子中組合而利用雙特異性抗體介導對靶細胞的殺滅:一個結合腫瘤細胞上的抗原的Fab臂，和一個結合細胞毒性T細胞(CTL)上的0)3的Fab臂。例如,所謂的三重功能性抗體(trifunctionalantibody),除了通過Fe區提供Fe受體結合外，還通過Fab臂提供雙特異性抗原結合。在雙特異性抗原結合后，將T細胞(⑶3)募集至腫瘤細胞(腫瘤抗原)，且還使得效應物細胞(effctorcells)結合至三重功能性抗體的Fe域。所形成的復合體導致腫瘤細胞的殺滅(Muller和Kontermann,BioDrugs2010;24:89-98)。厄妥索單抗(Ertumaxomab)是一種這類HER2xO)3三重功能性抗體，其在具有低HER2表達的細胞系中誘導細胞毒性(Jones等人，Lancet0ncol2009;10:1179-1187和Kiewe等人，ClinCancerRes2006;12:3085-3091)。或者，通過雙靶向性抗體片段(例如，雙靶向性單鏈抗體)形成T細胞和腫瘤細胞的復合體，導致腫瘤細胞的殺滅(Muller和Kontermann,BioDrugs2010;24:89-98，Baeuerle和Reinhardt2009,CancerResearch96:4941)。Blinatumomab(Bargou等人，Science2008,321:974-976)是名為BiTE的單鏈抗體構建體，其通過靶向⑶19和⑶3而誘導細胞毒性。還已經描述了其它基于抗體片段、使T細胞參與的雙特異性物(Moore等人2011，Bloodl17:4542-4551，Baeuerle等人，CurrentopinioninMolecularTherapeutics2009,11:22-30)。[0012]也已經將其它同時靶向HER2和EGFR家族的第二成員的雙特異性構建體作為提高HER2靶向性療法的功效和選擇性的潛在策略而討論。這類構建體的實例有HER2xEGFRAffibody(Friedman等人，BiotechnolApplBiochem.2009Aug21;54(2):121-31)和HER2xHER3串聯單鏈Fv，sMM-111`(Robinson等人，Br.J.Cancer2008;99:1415-25;TO2005/117973)。[0013]調節HER2的功能的復雜機制使得有必要針對這一原癌基因的新的和優化的治療策略進行進一步的研究。相應地，對于治療HER2相關疾病，如癌癥，的有效和安全的產品仍有需要。[0014]發明概述[0015]本發明的一個目標是提供包含來自兩種不同HER2抗體的抗原結合區的有效的雙特異性抗體，以及它們的醫療用途。如在本文中所示的，該雙特異性HER2xHER2抗體的特征在于相對于對應的單特異性HER2抗體，其具有更高的HER2下行性調節、更有效的對體內腫瘤生長的抑制、改善的內化和/或其它優勢。在一個方面，至少一種該單特異性HER2抗體展示與本領域中所描述的抗體不同的HER2結合特征或可變區序列。[0016]在優選的實施方案中，本發明的雙特異性抗體是從HER2抗體制備的，所述HER2抗體是完全人的或人源化的、結合至新表位、和/或在人患者中對于治療用途具有良好的特性。所述雙特異性抗體的每個Fab臂都可以進一步包含Fe區，任選地包含促進雙特異性抗體形成的修飾、影響Fe介導的效應物功能的修飾、綴合的藥物、或這些的任意組合，和/或本文中所描述的其它特征。[0017]本發明的這些方面和其它方面在下面進一步的描述。[0018]附圖簡述[0019]圖1:HuMab重鏈可變區(VH)序列與種系(germline)(參考)序列的比對(A-O)。在每個VH序列中，將在具體位置與在種系中的氨基酸不同的氨基酸凸顯。顯示了共有VH序列，其中“X”指示在該位置可能為另外的氨基酸(選自在每個位置所對準的那些氨基酸)。在每個VH序列中將CDRl、CDR2、和CDR3序列下劃顯示。共有CDR序列在表4中進一步定義。[0020]圖2=HuMab輕鏈可變區(VL)序列與種系(參考)序列的比對(A_H小圖)。在每個VL序列中，將在具體位置與在種系中的氨基酸不同的氨基酸凸顯。在圖2A中，所有VL序列都是衍生自相同的V-片段(IgKVl-12-Ol)，但是最接近的J-片段在不同抗體之間是不同的。顯示了共有VL序列，其中“X”指示在該位置可能為另外的氨基酸(選自在指示的位置所對準的那些氨基酸)。在每個VL序列中將⑶R1XDR2、和⑶R3序列下劃顯示。共有⑶R序列在表4中進一步定義。[0021]圖3:HER2抗體與(A、B、E)高(AU565)和(C、D、F)低(A431)HER2表達細胞系的結合曲線，其如在實施例12中所描述而確定。顯示的數據是每個細胞系的一個有代表性的實驗的平均突光強度(meanfluorescenceintensity,MFI)。EC5tl值表示表見親和力(apparentaffinity)。[0022]圖4:HER2抗體與在恒河猴上皮細胞上表達的HER2的結合。顯示的數據是在實施例13中描述的一個實驗的平均熒光強度(MFI)。[0023]圖5:HER2的鉻釋放(Chromium-release)(ADCC)測定法，顯示在與HER2抗體溫育后51Cr標記的SK-BR-3細胞的PBMC介導的裂解。所描述的值是平均最大百分比51Cr釋放土標準偏差，其來自一個有代表性的以SK-BR-3細胞進行的體外ADCC實驗。具體內容參見實施例15。[0024]圖6:HER2抗體對于AU565細胞的增殖的效果，如與未處理的細胞(設為100%)的比較。顯示的數據是AU565細胞與未處理的細胞比較的百分比增殖土標準偏差，其是在三個獨立的實驗中測量的。*顯著(P〈0.05)。具體內容參見實施例16。[0025]圖7:以Heregulin-βI刺激并以指示的HER2抗體處理的可存活的MCF7細胞的百分比，相比于僅以Heregulin-βI刺激的細胞。作為對照，顯示了未刺激的細胞的百分比增殖(無)。從三次獨立實驗獲得了數據土標準偏差。*對Heregulin-βI誘導的增殖的顯著抑制(Ρ〈0.05)。具體內容參見實施例17。[0026]圖8:ADC測定法，顯示通過抗kappa-ETA’綴合的HER2抗體對AU565細胞(A，B)或A431細胞(C，D)的殺滅。(A，B)顯示的數據是以未綴合的和以抗kappa-ETA’綴合的HER2抗體處理的AU565細胞進行的一個有代表性的實驗的熒光強度(FI)。(C，D)顯示的數據是以未綴合的和以抗kappa-ETA’綴合的HER2抗體處理的A431細胞進行的一個有代表性的實驗的熒光強度(FI)。具體內容參見實施例18。[0027]圖9:抗kappa-ETA’預溫育的HER2xHER2雙特異性抗體所誘導的對A431的殺滅。在與HER2抗體溫育3日后A431細胞的存活率，所述HER2抗體與抗kappa-ETA’預溫育。細胞存活率是使用Alamarblue定量的。所示的數據是以抗kappa-ΕΤΑ’綴合的HER2抗體和HER2XHER2雙特異性抗體處理的A431細胞的一個實驗的熒光強度(Fl)t^fStaurosporin用作陽性對照，而將同種型對照抗體用作陰性對照。[0028]圖10:HER2xHER2雙特異性分子誘導了HER2受體的下行性調節。在與10μg/mLmAb溫育3日后AU565細胞裂解物中的HER2表達水平的相對百分比。HER2的量是使用HER2特異性捕獲ELISA定量的，并作為相比于未處理的細胞的抑制百分比繪制。同種型對照是IgGl-3G8-QITL。所示數據是兩組實驗的平均值加上標準偏差，但是單特異性IgGl抗體的組合除外，其測試了一次。[0029]圖11:HER2xHER2雙特異性抗體(FITC)與溶酶體標志物LAMPl(Cy5)的共定位分析。對于多種單特異性HER2抗體和HER2xHER2雙特異性抗體的FITC像素強度與Cy5的重疊(A)。對于每種測試的抗體，對三張不同圖像的LAMP1/Cy5陽性像素中的FITC像素強度作圖。單特異物的LAMP1/Cy5陽性像素相比于雙特異物顯示出更低的FITC像素強度。(B)從三張不同圖像計算的每個LAMP1/Cy5陽性像素的FITC像素強度的平均值。總體而言，這些結果說明了在內化之后，相比于單特異性抗體更高水平的雙特異性抗體定位至Lampl/Cy5陽性泡囊。[0030]圖12:HER2單特異性和雙特異性抗體對增殖的抑制。將AU565細胞在存在10μg/mLHER2抗體或HER2xHER2雙特異性抗體的情況下接種于無血清的細胞培養基中。在三日后，將存活細胞的量以Alamarblue定量，并將細胞存活率表示為相對于未處理細胞的百分t匕。將一種同種型對照抗體(IgGl-bl2)用作陰性對照。所示的數據是存活AU565細胞相比于未處理細胞的百分比，其測量了五組實驗，并且土標準偏差。*指示僅描繪了一組數據點。[0031]圖13:抗體誘導的HER2的下調。在與10μg/mL抗體溫育3日后在AU565細胞裂解物中表達的HER2的相對百分比·。HER2的量是使用HER2特異性捕獲ELISA定量的并作為相比于未處理的細胞的百分比繪制的。顯示的數據是三次實驗的平均值土標準偏差。[0032]圖14:以溶酶體標志物LAMPl(Cy5)對HER2抗體(FITC)的共定位分析。FITC像素強度對于多個單特異性HER2抗體與Cy5重疊。對于每種抗體，對三個不同圖像的LAMPl/Cy5陽性像素中的FITC像素作圖。組3抗體098和153與抗體025和來自組2的帕妥珠單抗和來自組I的169和Herceptin相比顯示在LAMP1/Cy5陽性區室(compartments)中更高的FITC像素強度。[0033]圖15:HER2抗體與以不同HER2E⑶構建體轉染的CHO-S細胞的結合，其通過流式細胞術的平均值分析。HU-HER2=完全人HER2、Hu-HER2-ch(I)CRl=具有雞域I的hu_HER2、Hu-HER2-ch(II)=具有雞域II的hu_HER2、hu-HER2_ch(III)=具有雞域III的hu_HER2、且Hu-HER2-ch(IV)=具有雞域IV的hu_HER2。顯示的數據是一個具有代表性的抗體TH1014-153的平均熒光強度(MFI)。具體內容見實施例27。[0034]圖16:在雌性CB.17重度聯合免疫缺陷病(severecombinedimmunodeficiency,SCID)小鼠中的NC1-N87人胃癌瘤異種移植(xenograft)模型中的HER2_HuMab的體內效果。顯示的數據是每組的平均腫瘤大小土S.E.M.(每組n=10只小鼠)(A，C)和存活(B，D)。具體內容見實施例28。[0035]圖17:在Balb/C裸小鼠中的BT-474乳腺腫瘤異種移植物中HER2HuMab的體內效果。所顯示的數據是每組的平均腫瘤大小土S.Ε.Μ.(每組n=8只小鼠)(A)和存活(B)。具體內容見實施例29。[0036]圖18:抗體誘導的HER2表面表達的下行性調節。HER2表面表達是與終濃度為10μg/mL的、帶有或不帶阻斷再循環(recycling)的monensis的指示的抗體溫育3小時后確定的。受體表面表達是通過XJIFIKIT?:分析法定量的。相比于未處理的細胞，單特異性HER2抗體不影響存在于細胞表面上的HER2分子的數目。相比于兩種對應的單特異性親本抗體的組合，雙特異性HER2xHER2抗體導致HER2從表面的下行性調節。莫能菌素(Monensin)在所有的樣品中對表面表達都僅有較小的效果，表明內化的HER2分子僅有少數再循環回到表面。圖表示了平均數+/_標準偏差。[0037]圖19:HER2xHER2雙特異性抗體所致的的PBMC介導的對AU565細胞的細胞毒性。將雙特異性抗體(由圖例中的X所指示)的殺滅活性與親本單特異性抗體及其組合(由圖例中的+所指示)比較。在PBMC介導的細胞毒性測定法中，HER2抗體對AU565的劑量依賴性殺滅在雙特異性HER2xHER2中保留。分別將Herc印tin和IgGl-KLH(不相關抗體)用作陽性和陰性對照。對于IgGl-153-1TLxIgGl-153-K409R-N297Q，通過引入N297Q突變而使兩個Fe域之一失活導致了ADCC的喪失。[0038]圖20:HER2xHER2雙特異性抗體在SCID小鼠中的NC1-N87異種移植模型中抑制腫瘤生長的功效。在腫瘤接種后的第7、14和21日以飽和抗體劑量處理小鼠。顯示了每個處理組在第41日的平均腫瘤大小。兩種測試的HER2xHER2雙特異性抗體都展現了相比于它們的單特異性對應物和這兩種單特異性抗體的組合更好的體內功效。[0039]圖21:HER2xHER2雙特異性抗體在SCID小鼠中的NC1-N87異種移植模型中抑制腫瘤生長的功效。在(A)中，顯示了在腫瘤接種后第7和14日以飽和抗體劑量處理的小鼠中的腫瘤發展(平均值和SEM)，所述`小鼠具有NC1-N87S.c.異種移植物。Her2xHer2雙特異性IgGl-153-1TLxIgGl-169-K409R抗體展現了比它們的單特異性對應物和這兩種單特異性抗體的組合更好的體內功效。在(B)中，具有小于400mm3的腫瘤大小的小鼠的百分比在Kaplan-Meier圖中顯不。[0040]圖22:三重突變體(ITL)、二重突變體(IT,IL,TL)、和單突變體(L)人IgGl_2F8在生成雙特異性抗體中的比較，所述抗體是通過與人IgG4-7D8進行Fab臂交換而生成的。在人IgGl-2F8三重和二重突變體與具有CPSC鉸鏈(A)的野生型IgG4_7D8、或具有穩定化鉸鏈的突變型IgG4-7D8-CPPC(B)、或具有野生型CPPC或穩定化的CPPC鉸鏈的單突變體IgGl-2F8-F405L和IgG4_7D8(C)之間的2-MEA誘導的Fab臂交換后雙特異性抗體的生成通過ELISA確定。對于分別包括雙重突變型和單突變型的實驗，在ELISA中分析了0_20μg/mL或0-10μg/mL的濃度系列(總抗體)。與雙重突變體IgGl_2F8_IL和-TL的組合導致了與三重突變體IgGl-1TL相似的雙特異性EGFR/CD20結合。與IgGl_2F8_IT的組合不導致雙特異性產物。與單突變體IgGl-2F8-F405L的組合導致雙特異性EGFR/CD20結合。[0041]圖23:1gGl-2F8-1TL和IgGl_7D8_K409X突變體之間的2-MEA誘導的Fab臂交換。在IgGl-2F8-1TL和指示的IgGl_7D8_K409X突變體之間的2-MEA誘導的體外Fab臂交換后雙特異性抗體的生成是通過ELISA確定的。(A)分析了0-20μg/mL的濃度系列(總抗體)。陽性對照是純化的雙特異性抗體批次，其衍生自IgGl-2F8-1TLxIgG4_7D8_CPPC。(B)將交換表示為在20μg/mL的相比于陽性對照(黑色條)的雙特異性結合。深灰色條代表IgG4對照(IgG4-7D8xIgG4-2F8)之間、陰性對照(IgGl_2F8xIgGl_7D8_K409R)之間、和IgGl-2F8-1TL和IgG4_7D8_CPPC之間的雙特異性結合。淺灰色條代表來自同時進行的指示的IgGl-7D8-K409X突變體和IgGl_2F8_ITL之間的Fab臂交換的結果。[0042]圖24:2-MEA誘導的IgGl_2F8_F405X突變體和IgGl_7D8_K409R之間的Fab臂交換。2-MEA誘導的指示的gGl-2F8-F405X突變體和IgGl_7D8_K409R之間的體外Fab臂交換后雙特異性抗體的生成是通過ELISA測定的。(A)將0-20μg/mL的濃度系列(總抗體)在ELISA中分析。陽性對照是純化的雙特異性抗體批次，衍生自IgGl-2F8-F405LXIgGl-7D8-K409R。(B)將交換表示在20μg/mL的抗體濃度的相比于陽性對照(黑色條)的雙特異性結合。深灰色條代表1gG4對照(IgG4-7D8xIgG4_2F8)和陰性對照(IgGl-2F8xIgGl-7D8-K409R)之間的雙特異性結合。淺灰色條代表來自同時進行的指示的IgGl-2F8-F405X突變體和IgGl_7D8_K409R或對照之間的Fab臂交換的結果。[0043]圖25:2-MEA誘導的IgGl_2F8_Y407X突變體和IgGl_7D8_K409R之間的Fab臂交換。在2-MEA誘導的指示的IgGl-2F8-Y407X突變體和IgGl_7D8_K409R之間的體外Fab臂交換后生成的雙特異性抗體是通過ELISA測定的。(A)將0-20μg/mL的濃度系列(總抗體)在ELISA中分析。陽性對照是純化的雙特異性抗體批次，衍生自IgGl-2F8-F405LXIgGl-7D8-K409R。(B)將交換表示為在20μg/mL抗體濃度的相比于陽性對照(黑色條)的雙特異性結合。深灰色條代表1gG4對照(IgG4-7D8xIgG4_2F8)之間，和陰性對照(IgGl-2F8xIgGl-7D8-K409R)之間的雙特異性結合。淺灰色條代表來自同時進行的指示的IgGl-2F8-Y407X突變體和IgGl_7D8_K409R或對照之間的Fab臂交換的結果。[0044]圖26:在2-MEA誘導的指示的IgGl_2F8_L368X突變體和IgGl-7D8_K409R之間的體外Fab臂交換之后雙特異性抗體的生成使用0-20μg/mL的濃度系列(總抗體)通過ELISA確定(A)。陽性對照是純化的雙特異性抗體批次，衍生自IgGl-2F8-F405LxIgGl-7D8-K409R。(B)在20μg/mL的相比于陽性對照(黑色條)的雙特異性結合。深灰色條代表IgG4對照(IgG4-7D8xIgG4-2F8)之間和陰性對照(IgGl_2F8xIgGl_7D8_K409R)之間的雙特異性結合。淺灰色條代表來自同時進行的指示的IgGl-2F8-L368X突變體和IgGl-7D8-K409R之間的Fab臂交換的結果。[0045]圖27:2-MEA誘導的指示的IgGl-2F8_K370X突變體和IgGl-7D8_K409R之間的體外Fab臂交換之后雙特異性抗體的生成使用0-20μg/mL的濃度系列(總抗體)通過ELISA確定(A)。陽性對照是純化的雙特異性抗體批次，其衍生自IgGl-2F8-F405LxIgGl-7D8-K409R。⑶在20μg/mL的相比于陽性對照(黑色條)的雙特異性結合。深灰色條代表IgG4對照(IgG4-7D8xIgG4_2F8)之間和陰性對照(IgGl_2F8xIgGl_7D8_K409R)之間的雙特異性結合。淺灰色條代表同時進行的指示的IgGl-2F8-D370X突變體和IgGl-7D8-K409R之間的Fab臂交換的結果。[0046]圖28:2-MEA誘導的指示的IgGl_2F8_D399X突變體和IgGl_7D8_K409R之間的體外Fab臂交換后雙特異性抗體的生成使用0-20μg/mL的濃度系列(總抗體)通過ELISA確定(A)。(B)在20μg/mL抗體濃度的相比于陽性對照(黑色條)的雙特異性結合。深灰色條代表IgG4對照(IgG4-7D8xIgG4_2F8)之間和陰性對照(IgGl_2F8xIgGl_7D8_K409R)之間的雙特異性結合。淺灰色條代表來自同時進行的指示的IgGl-2F8-D399X突變體和IgGl-7D8-K409R之間的Fab臂交換的結果。[0047]圖29:2-MEA誘導的指示的IgGl_2F8_T366X突變體和IgGl_7D8_K409R之間的體外Fab交換之后的雙特異性抗體的生成使用0-20μg/mL的濃度系列(總抗體)通過ELISA確定㈧。⑶在20μg/mL抗體濃度相比于陽性對照(黑色條)的雙特異性結合。深灰色條代表IgG4對照(IgG4-7D8xIgG4_2F8)之間和陰性對照(IgGl_2F8xIgGl_7D8_K409R)之間的雙特異性結合。淺灰色條代表來自同時進行的指示的IgGl-2F8-T366X突變體和IgGl-7D8-K409R之間的Fab臂交換的結果。[0048]發明詳述[0049]定義[0050]當在本文中使用時，術語“HER2”(也稱作ErbB-2、NEU、HER-2、和CD340)，指人表皮生長因子受體2(SwissProtP04626)，且包括HER2的任何變體、同工型、和物種同源物，其由細胞-包括腫瘤細胞-天然地表達，或由以HER2基因或cDNA轉染的細胞表達。物種同源物包括恒河猴HER2(macacamulatta；Genbank登錄號G1:109114897)。[0051]術語“免疫球蛋白”指一類結構相關的糖蛋白，其由兩對多肽鏈組成，一對輕(L)低分子量的鏈和一對重(H)鏈，所有四條鏈是通過二硫鍵相互連接的。免疫球蛋白的結構已被充分地表征。參見例如FundamentalImmunologyCh.7(Paul,ff.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.(1989))。簡單來說，每條重鏈通常包含重鏈可變區(在本文中簡寫為Vh或VH)和重鏈恒定區。重鏈恒定區通常包含三個域，CHl、CH2dPCH3。每條輕鏈通常包含輕鏈可變區(本文中簡寫為VL或VL)和輕鏈恒定區。輕鏈恒定區通常包含一個域，Cl。Vj^PVl區可以進一步細分為高變的區域(regionsofhypervariability)(也叫高變區，其可以是序列上和/或結構上確定的環的形式上高度可變的)，也稱為互補決定區(complementaritydeterminingregion,CDR),其被更加保守、稱為框架區(frameworkregions,FR)的區域隔開。每個Vh和八通常是由三個⑶R和四個FR構成的，從氨基端到羧基端以以下的順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(亦參見Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另外聲明或與上下文沖突，否則本文中的CDR序列是根據IMGT規則鑒定的(BrochetX.，NuclAcidsRes.2008；36:W503-508和LefrancMP.,NucleicAcidsResearchl999；27:209-212;參見互聯網http地址imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&0ption=humanIg)。然而,對抗體序列中的氨基酸殘基的編號還可以根據由Kabat等人在SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)中所描述的方法進行(本文中的如“如在Kabat中的可變域殘基編號”、“Kabat位置”、和“根據Kabat”的短語指該編號系統)。特別地，對于在恒定區中的氨基酸的編號，可以使用EUindex編號系統(Kabat等人，同上)。對于給定的抗體可以如在Kabat等人，同上中所描述確定殘基的Kabat編號。[0052]除非與上下文矛盾，否則在本發明中對氨基酸位置的指代是根據EU-1ndex的，其如Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)所描述的。[0053]在本發明的上下文中的術語“抗體”(antibody，Ab)指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其任何一者的衍生物，其具有在通常生理條件下以顯著時間期間的半壽期特異性結合抗原的能力，所述半壽期如至少大約30分鐘、至少大約45分鐘、至少大約一小時、至少大約兩小時、至少大約四小時、至少大約8小時、至少大約12小時、至少大約48小時或更長，大約3、4、5、6、7或更多日，等等，或任何其它相關的功能定義的期間(如足以誘導、促進、增強、和/或調制與抗體結合抗原相關的生理反應的時間和/或足以使抗體募集(recruit)效應物活性的時間)。免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體(Ab)的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述組織或因子包括多種免疫系統的細胞(如效應細胞)和補體系統的組成成分，如Clq，其為補體活化的經典途徑的第一組成成分。HER2抗體還可以是多特異性抗體，如雙特異性抗體(bispecificantibody)、雙抗體(diabody)、或相似的分子(對雙抗體的描述例如見PNASUSA90(14),6444-8(1993))0的確，除了HER2的部分之外，本發明所提供的雙特異性抗體、雙抗體等還可以結合任何合適的靶物。如在上面所指示的，本文中所用的術語抗體，除非另外聲明或明顯與上下文矛盾，包括為抗原結合片段一即保留與抗原特異性結合能力一的抗體的片段。已經顯示了抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段進行。術語“抗體”所涵蓋的抗原結合片段的實例包括(i)Fab’或Fab片段-由\、VH、(^和ChI域所組成的單價片段，或在W02007059782(Genmab)中所描述的單價抗體；(ii)F(ab’)2片段-包含由鉸鏈區的二硫橋聯所連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)基本上由Vh和ChI域所組成的Fd片段；(iv)基本上由抗體的單個臂的\和Vh域所組成的Fv片段；(V)dAb片段(Ward等人，NatureMi,544-546(1989))，其基本上由Vh域組成并且也稱為域抗體(Holt等人；TrendsBiotechnol.2003Nov:21(11):484-90)；(vi)馬它類抗體(cameIid)或納米抗體(nanobody)(Revets等人；ExpertOpinBiolTher.2005Jan；5(I):111-24)；和(vii)分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個域，'和Vh是由不同的基因所編碼的，可以通過合成接頭(syntheticlinker)使用重組方法將它們聯結,所述合成接頭使得可以將它們做成單一的蛋白質鏈，其中'和Vh和區域配對以形成單價分子(稱作單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)，見例如Bird等人.,Science242,423-426(1988)和Huston等人，PNASUSA迎，5879-5883(1988))。這類單鏈抗體是涵蓋在術語抗體中的，除非另外注明或由上下文明顯地指示。雖然這類片段一般包括在抗體的含義中，但是它們作為總體和作為獨立個體都是本發明的獨特特征，呈現不同的生物學性質和效用。對在本發明的上下文中的這些和其它有用的抗體片段·，以及這類片段的雙特異性形式在本文中進一步討論。還應該理解，術語抗體，除非另外具體指明，還包括多克隆抗體；單克隆抗體(mAb);抗體樣多肽(antibody-likepolypeptide),如嵌合抗體和人源化抗體；和通過任何已知技術所提供的保留特異性結合抗原能力的抗體片段(抗原結合片段)，所述技術如酶切割、肽合成、和重組技術。所生成的抗體抗原具有任何同種型。[0054]在本發明上下文中的術語“雙特異性抗體”應理解為具有兩個不同抗原結合區(基于序列信息)的抗體。這可以意指不同的靶物結合，但是也包括與在一種靶物上的不同表位的結合。[0055]當在本文中使用時，除非與上下文矛盾，否則術語“Fab臂”或“臂”指一個重鏈-輕鏈對。[0056]當在本文中使用時，除非與上下文矛盾，否則術語“Fe區”指抗體區域，其包括至少鉸鏈區、CH2域、和CH3域。[0057]如在本文中所使用的，“同種型”指由重鏈恒定區基因所編碼的免疫球蛋白類別(例如，IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或IgM)。[0058]術語“單價抗體”在本發明的上下文中意指抗體分子，其能夠結合抗原的單個分子，且因此不能夠交聯抗原。[0059]“效應物功能上缺陷的抗體(antibodydeficientineffectorfunction)”或“效應物功能缺陷抗體(effector-function-deficientantibody)”指抗體，其一種或多種效應物機制顯著地降低或其沒有能力激活一種或多種效應物機制，所述機制如補體活化或Fe受體結合。因此，效應物功能缺陷抗體具有顯著降低的或不具有介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體介導的細胞毒性(CDC)的能力。此種抗體的一個實例是IgG4。另一個實例是在Fe區引入突變，所述突變可以強烈地降低與補體蛋白和Fe受體的相互作用。參見，例如，BoltS等人，EurJImmunol1993,23:403-411；0ganesyan,ActaCrys.2008，D64,700-704;和Shields等人，JBC2001,276:6591-6604。[0060]“HER2抗體”或“抗HER2抗體”是如以上所描述的抗體，其特異性結合抗原HER2。[0061]“HER2xHER2抗體”或“抗HER2xHER2抗體”是多特異性抗體，任選地是雙特異性抗體，其包含兩種不同抗原結合區，其二者都特異性結合抗原HER2，任選地結合不同的HER2表位。[0062]如在本文中所使用的術語“人抗體”意圖包括抗體，其具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區。本發明的人抗體可以包括氨基酸殘基，其不由人種系免疫球蛋白序列所編碼(例如，通過隨機或位點特異性誘變在體外或通過體細胞突變在體內引入的突變)。但是，如在本文中所使用的術語“人抗體”不意圖包括抗體，其中衍生自另一種哺乳動物物種-如小鼠-的種系的⑶R序列已經被移植至人框架序列上。[0063]如在本文中所使用的，如果抗體獲得自使用人免疫球蛋白序列的系統，則人抗體“衍生自”特別的種系序列，其例如通過免疫接種攜帶人免疫球蛋白基因的小鼠或通過篩選人免疫球蛋白基因文庫，且其中選擇的人抗體的氨基酸序列與由種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列具有至少90%、如至少95%、例如至少96%、如至少97%、例如至少98%、或如至少99%同一性。通常，在重鏈⑶R3以外，衍生自特別的人種系序列的人抗體與由種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列會顯示不超過20個氨基酸差異，例如，不超過10個氨基酸差異，如不超過9、8、7、6、或5個氨基酸差異，例如不超過4、3、2、或I個氨基酸差異。[0064]當在本文中使用時，術語“重鏈抗體”(“heavychainantibody”或“heavy-chainantibody”)指抗體，其僅僅由兩條重鏈組成且缺乏通常見于抗體中的兩條輕鏈。重鏈抗體，其天然存在于，例如，駝類(camelids)中，可以結合抗原，盡管其缺乏VL域。[0065]在一個優選的實施方案中，本發明的抗體是分離的。如在本文中所使用的術語“分離的抗體”意圖指抗體，其基本上不含其它具有不同抗原特異性的抗體(例如，特異性結合HER2的分離的抗體基本上不含特異性結合除了HER2之外的抗原的抗體)。然而，特異性結合HER2的表位、同工型或變體的分離的抗體具有與其它相關的抗原的交叉反應性，所述相關抗原例如來自其它物種(如HER2物種同源物)。此外,分離的抗體可以基本上不含其它細胞物質和/或化學品。在本發明的一個實施方案中，將兩種或更多種具有不同抗原結合特異性的“分離的”抗體在定義明確的組合物中組合。[0066]當在本文中在兩種或更多種抗體的上下文中使用時，術語“與…競爭”或“與…交叉競爭(cross-compete)”指示兩種或更多種抗體競爭對HER2的結合，例如，在實施例14中描述的測定法中競爭對HER2的結合。如果抗體與所述一種或多種其它抗體競爭，則抗體“阻斷”或“交叉阻斷”其它抗體與HER2的結合，其中所述競爭是25%或更多，其中25%-74%代表“部分阻斷”且75%-100%代表“完全阻斷”，優選使用如實施例14的測定法所確定。對于一些抗體對，只有當一種抗體涂覆于板上且另一種用于競爭-而非反過來-時，才能觀察到實施例的測定法中的競爭或阻斷。除非另外定義或上下文否認，否則當在本文中使用術語“與…交叉競爭”、“阻斷”、或“交叉阻斷”也意圖涵蓋這類的抗體對。[0067]術語“表位”意指蛋白質決定子(proteindeterminant),其能夠特異性與抗體結合。表位通常由分子的表面基團如氨基酸或糖側鏈組成，且通常具有特定的三維結構特征，以及特定的電荷特征。構象和非構象的表位是這樣區分的:與前者，而非后者的結合在變性溶劑的存在下丟失。表位可以包含直接參與結合的氨基酸殘基，和不直接參與結合的其它氨基酸殘基，如被特異性抗原結合肽覆蓋或被有效地阻斷的氨基酸殘基(換言之，該氨基酸殘基在特異性結合肽的足跡(footprint)中)。[0068]如在本文中所使用的術語“單克隆抗體”指單一分子組份的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物顯示對特別的表位的單一結合特異性和親和力。相應地，術語“人單克隆抗體”指顯示單一結合特異性的抗體，其具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區。人單克隆抗體可以通過雜交瘤生成，其包括將B細胞融合至永生化細胞，所述B細胞獲得自轉基因或轉染色體(transchromosomal)非人動物,如轉基因小鼠,其具有包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。[0069]如在本文中所使用的術語“結合”，在抗體與預定的抗原或表位結合的上下文中通常是下述結合，所述結合具有的親和力，當通過使用例如表面等離振子共振(surfacePlasmonresonance,SPR)技術在BIAcore3000設備中使用抗原作為配體且抗體作為分析物確定時，對應于大約10_7M或更低、如大約10_8M或更低、如大約10_9M或更低、大約ΙΟ,Μ或更低、或大約10_ηΜ或甚至更低的KD，且與其結合除了與預定的抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(例如，BSA或酪蛋`白)結合的親和力相比對應于至少低十倍、如至少低100倍、例如至少低1,000倍，如至少低10，000倍，例如至少低100，000倍的Kd的親和力結合于預定的抗原。親和力降低的量取決于抗體的KD，即當抗體的Kd很低時(即，抗體高度特異)，則對于抗原的親和力比非特異性抗原的親和力低的量可為至少10，000倍。[0070]如在本文中所使用的術語“kd”(sec-1)指特別的抗體-抗原相互作用的解離速率常數。所述值也稱作I^ff值。[0071]如在本文中所使用的術語“ka”(M-1Xsec-1)指特別的抗體_抗原相互作用的締合速率常數。[0072]如在本文中所使用的術語“KD”(M)指特別的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。[0073]如在本文中所使用的術語“KA”(Μ-1)指特別的抗體-抗原相互作用的締合平衡常數，且是通過將ka除以kd而獲得的。[0074]當在本文中使用時，術語“第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用”指在第一CH3/第二CH3異二聚體蛋白質中的第一CH3區和第二CH3區的相互作用。[0075]當在本文中使用時，術語“第一和第二CH3區之間的同二聚相互作用”指在第一CH3/第一CH3同二聚體蛋白質中的第一CH3區和另一個第一CH3區之間的相互作用，和在第二CH3/第二CH3同二聚體蛋白質中的第二CH3和另一個CH3區之間的相互作用。[0076]術語“還原性條件”或“還原性環境”指條件或環境，其中底物-在這里是抗體的鉸鏈區中的半胱氨酸殘基-更可能變成還原的而不是氧化的。[0077]如在本文中所使用的術語“抑制增殖”(例如，指細胞，如腫瘤細胞)意圖包括當與HER2抗體接觸時細胞增殖的實質性降低，其是與不與HER2抗體接觸的相同細胞的增殖相比的，例如，至少大約10%、至少大約20%、或至少大約30%的對細胞培養物的增殖的抑制，或至少與參考抗體-如曲妥珠單抗-相等的對細胞培養物的增殖的抑制，例如，如根據實施例例如，實施例16中的測定法所確定的。[0078]如在本文中所使用的術語“促進增殖”(例如，指細胞，如腫瘤細胞)意圖包括當與HER2抗體接觸時細胞增殖的任何的實質性提高，其是與不與HER2抗體接觸的相同細胞的增殖相比的，例如，至少大約10%、至少大約20%、或至少大約30%的對細胞培養物的增殖的促進，或至少與參考抗體-如F5-相等的對細胞培養物的增殖的抑制，例如，如根據實施例中的測定法所測定的。[0079]如在本文中所使用的術語“內化(internalization)”,當在HER2抗體的上下文中使用時，包括將抗體從細胞表面和/或從周圍培養基-例如，通過胞吞作用-內化進入HER2表達細胞的任何機制。抗體的內化可以使用測量內化的抗體的量的直接測定法(如，例如，在實施例19中描述的fab-CypHer5E測定法)，或測量內化的抗體_毒素綴合物的間接測定法(如，例如，實施例18的抗-kappa-ETA'測定法)而評估。[0080]本發明還提供抗體，其包含實施例的抗體的\區、Vh區、或一種或多種⑶R的功能性變體。在HER2抗體的上下文中使用的Vl區、Vh區、或一種或多種CDR的功能性變體依然允許抗體保留至少實質性比例的(例如，至少大約50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)親本抗體的親和力/親合力(affi`nity/avidity)和/或特異性/選擇性,并且在一些情況中此種HER2抗體可以以比親本抗體更強的親和力、選擇性和/或特異性締合。[0081]這類功能性變體通常保留與親本抗體的顯著的序列同一性。兩個序列之間的百分比同一性是序列之間具有的相同的位置的數目的函數(即，％同源性=相同位置的#/位置的總#χ100)，要考慮缺口(gap)的數目和每個缺口的長度，所述缺口是為了所述兩個序列的最優比對需要而引入的。兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性可以，例如，使用E.Meyers和ff.Miller,Comput.Appl.Biosci4,11-17(1988)的算法而確定，其已經被并入ALIGN程序(版本2.0)，其使用PAM120權重殘基表(PAM120weightresiduetable)、12的缺口長度罰分(gaplengthpenalty)和4的缺口罰分(gappenalty)。此外,兩個氨基酸序列之間的百分比同一性還可以使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)的算法而確定。[0082]例示性的變體包括在一個或多個“變體”氨基酸位置處與在圖1和圖2中所示的親本抗體VH和/或VL序列不同的那些，所述位置在對應的共有序列中表示為“X”。優選的變體是其中新氨基酸選自在圖1或2中的比對的序列之一的在對應位置的氨基酸的變體(對于⑶R序列變體的細節，見表4)。或者或此外，VH、VL或⑶R變體的序列可以主要通過保守取代而與親本抗體序列的VH、VL或CDR的序列不同；例如，變體中的至少10個，如至少9、8、7、6、5、4、3、2、1個取代是保守氨基酸殘基替換。[0083]在本發明的上下文中，保守取代可以定義為在下表中反映的氨基酸類別中的取代:[0084]對于保守取代的氨基酸殘基類別[0085]【權利要求】1.一種雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，所述第一和第二抗原結合區結合區結合人表皮生長因子受體2(HER2)上的不同的表位，且其中所述第一和第二抗原結合區都阻斷獨立選自下組的參考抗體與HER2，任選地可溶性HER2，的結合:a)包含VH區和VL區的抗體，其中所述VH區包含SEQIDNO:63的序列且所述VL區包含SEQIDNO:67的序列(153)b)包含可變重(VH)區和可變輕(VL)區的抗體，所述可變重區包含SEQIDN0:165的序列且所述可變輕區包含SEQIDNO:169的序列(005)c)包含VH區和VL區的抗體，其中所述VH區包含SEQIDNO:1的序列且所述VL區包含SEQIDNO:5的序列(169)，和d)包含VH區和VL區的抗體，其中所述VH區包含SEQIDNO:22的序列且所述VL區包含SEQIDNO:26的序列(025)。2.權利要求1的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區的至少一個阻斷(a)的抗體與可溶性HER2的結合。3.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區的至少一個阻斷(b)的抗體與可溶性HER2的結合。4.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區的至少一個阻斷(c)的抗體與可溶性HER2的結合。5.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區的至少一個阻斷(d)的抗體與可溶性HER2的結合。6.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其中(i)第一抗原結合區阻斷(a)的抗體與可溶性HER2的結合且第二抗原結合區阻斷(b)的抗體與可溶性HER2的結合，或反之亦然；(?)第一抗原結合區阻斷(a)的抗體與可溶性HER2的結合且第二抗原結合區阻斷(c)的抗體與可溶性HER2的結合，或反之亦然；(iii)第一抗原結合區阻斷(a)的抗體與可溶性HER2的結合且第二抗原結合區阻斷(d)的抗體與可溶性HER2的結合，或反之亦然；(iv)第一抗原結合區阻斷(b)的抗體與可溶性HER2的結合且第二抗原結合區阻斷(c)的抗體與可溶性HER2的結合，或反之亦然；(v)第一抗原結合區阻斷(b)的抗體與可溶性HER2的結合且第二抗原結合區阻斷(d)的抗體與可溶性HER2的結合，或反之亦然；(vi)第一抗原結合區阻斷(c)的抗體與可溶性HER2的結合且第二抗原結合區阻斷(d)的抗體與可溶性HER2的結合，或反之亦然。7.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區每個都包含獨立選自下組的VH⑶R1，⑶R2，和⑶R3序列a)分別為SEQIDNO:64，65和66(153)；b)分別為SEQIDNO:43，44和45(127)；c)分別為SEQIDN0:50，51和52(159)；d)分別為SEQIDNO:57，58和59(098)；e)分別為SEQIDNO:71，72和73(132)；8.權利要求7的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區每個都包含獨立選自下組的VH區和VL區:a)包含分別為SEQIDNO:64，65和66的CDRl，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:68，DASj^PSEQIDNO:69的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(153)；b)包含分別為SEQIDNO:43，44和45的CDRl，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:47，AASjPSEQIDNO:48的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(127)；c)包含分別為SEQIDNO:50，51和52的CDRl,CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:54，AASj^PSEQIDNO:55的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(159)；d)包含分別為SEQIDNO:57，58和59的CDRl,CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:60，AASj^PSEQIDNO:61的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(098)；e)包含分別為SEQIDNO:71，72和73的CDRl，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:75，DASjPSEQIDNO:76的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(132)；f)包含分別為SEQIDNO:166，167和168的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:170，GAS和SEQIDNO:171的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(005)；g)包含分別為SEQIDNO:173，174和175的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:177，DASjPSEQIDNO:178的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(006)；h)包含分別為SEQIDNO:180，181和182的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:184，GASj^PSEQIDNO:185的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(059)；i)包含分別為SEQIDNO:187，188和189的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:191，GASjPSEQIDNO:192的CDRl,CDR2和CDR3序列的VL區(060)；j)包含分別為SEQIDNO:194，195和196的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:198，GASjPSEQIDNO:199的CDRl,CDR2和CDR3序列的VL區(106)；k)包含分別為SEQIDNO:201，202和203的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:205，GAS，和SEQIDNO:206的CDRl,CDR2和CDR3序列的VL區(111)；I)包含分別為SEQIDNO:2，3和4的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:6,DASJPSEQIDNO:7的CDRl,CDR2和CDR3序列的VL區(169)；m)包含分別為SEQIDNO:9,10和11的CDR1,CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:13，AASjPSEQIDNO:14的CDRl,CDR2和CDR3序列的VL區(050)；η)包含分別為SEQIDNO:16，17和18的CDRl,CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:20，VASjPSEQIDNO:21的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(084)；ο)包含分別為SEQIDNO:23，24和25的CDRl,CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:27，AASjPSEQIDNO:28的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(025)；P)包含分別為SEQIDNO:30，163和31的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:33，AASjPSEQIDNO:34的CDRl,CDR2和CDR3序列的VL區(091)；q)包含分別為SEQIDNO:36，37和38的CDRl,CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:40，DASjPSEQIDNO:41的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(129)；t)包含曲妥珠單抗的VH⑶R1，⑶R2和⑶R3序列的VH區和包含曲妥珠單抗的VLCDRl，CDR2和CDR3區的VL區；和u)包含帕妥珠單抗的VH⑶R1，⑶R2和⑶R3序列的VH區和包含帕妥珠單抗的VLCDRl，CDR2和CDR3序列的VL區，前提是當所述第一抗原結合區來自曲妥珠單抗時，所述第二抗原結合區不來自帕妥珠單抗，且反之亦然。9.權利要求8的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區每個都包含獨立選自下組的VH區和VL區:a)包含分別為SEQIDNO:64，65和66的CDRl，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:68，DASj^PSEQIDNO:69的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(153)；b)包含分別為SEQIDNO:166，167和168的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:170，GASj^PSEQIDNO:171的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(005)；c)包含分別為SEQIDNO:2，3和4的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:6,DASJPSEQIDNO:7的CDRl,CDR2和CDR3序列的VL區(169);和d)包含分別為SEQIDNO:23，24和25的CDRl,CDR2和CDR3序列的VH區；和包含分別為SEQIDNO:27，AASjPSEQIDNO:28的CDRl，CDR2和CDR3序列的VL區(025)。10.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含SEQIDNO:66的VHCDR3序列(153)且所述第二抗原結合區包含SEQIDNO:168的VHCDR3序列(005)，或反之亦然。11.權利要求10的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:69的VLCDR3序列(153)，且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:171的VLCDR3序列(005)。12.權利要求10和11任一項的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDN0:64的VHCDRl序列和SEQIDNO:65的VHCDR2序列(153)，且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:166的VHCDRl序列和SEQIDNO:167的VHCDR2序列(005)。13.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含含SEQIDNO:63的VH區和含SEQIDNO:67的VL區(153)，并且所述第二抗原結合區包含含SEQIDNO:165的VH區和含SEQIDNO:169的VL區(005)，或反之亦然。14.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含SEQIDNO:66的VHCDR3序列(153)，并且所述第二抗原結合區包含SEQIDNO:4的VHCDR3序列(169)，或反之亦然。15.權利要求14的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:69的VLCDR3序列(153)，并且第二抗原結合區還包含SEQIDNO:7的VLCDR3區(169)。16.權利要求14和15任一項的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:64的VHCDRl序列和SEQIDNO:65的VHCDR2序列(153)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:2的VHCDRl序列和SEQIDNO:3的VHCDR2序列(169)。17.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含含SEQIDNO:63的VH區和含SEQIDNO:67的VL區(153)，并且所述第二抗原結合區包含含SEQIDNO:1的VH區和含SEQIDNO:5的VL區(169)，或反之亦然。18.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含SEQIDNO:168的VHCDR3序列(005)并且所述第二抗原結合區包含SEQIDNO:4的VHCDR3序列(169)，或反之亦然。19.權利要求18的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:171的VLCDR3序列(005)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:7的VLCDR3序列(169)。20.權利要求18和19任一項的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:166的VHCDRl序列和SEQIDNO:167的VHCDR2序列(005)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:2的VHCDRl序列和SEQIDNO:3的VHCDR2序列(169)。`21.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含含SEQIDNO:165的VH區和含SEQIDNO:169的VL區(005)，并且所述第二抗原結合區包含含SEQIDNO:1的VH區和含SEQIDNO:5的VL區(169)，或反之亦然。22.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含SEQIDNO:25的VHCDR3序列(025)并且所述第二抗原結合區包含SEQIDNO:168的VHCDR3序列(005)，或反之亦然。23.權利要求22的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:28的VLCDR3序列(025)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:171的VLCDR3序列(005)。24.權利要求22和23任一項的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:23的VHCDRl序列和SEQIDNO:24的VHCDR2序列(025)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:166的VHCDRl序列和SEQIDNO:167的VHCDR2序列(005)。25.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含含SEQIDNO:22的VH區和含SEQIDNO:26的VL區(025)，并且所述第二抗原結合區包含含SEQIDNO:165的VH區和含SEQIDNO:169的VL區(005)，或反之亦然。26.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含SEQIDNO:25的VHCDR3序列(025)并且所述第二抗原結合區包含SEQIDNO:66的VHCDR3序列(153)，或反之亦然。27.權利要求26的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:28的VLCDR3序列(025)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:69的VLCDR3序列(153)。28.權利要求26和27任一項的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:23的VHCDRl序列和SEQIDNO:24的VHCDR2序列(025)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:64的VHCDRl序列和SEQIDNO:65的VHCDR2序列(153)。29.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含含SEQIDNO:22的VH區和含SEQIDNO:26的VL區(025)，并且所述第二抗原結合區包含含SEQIDNO:63的VH區和含SEQIDNO:67的VL區(153)，或反之亦然。30.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含SEQIDNO:25的VHCDR3序列(025)并且所述第二抗原結合區包含SEQIDNO:4的VHCDR3序列(169)，或反之亦然。31.權利要求30的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:28的VLCDR3序列(025)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:7的VLCDR3序列(169)。32.權利要求30和31任一項的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區還包含SEQIDNO:23的VHCDRl序列和SEQIDNO:24的VHCDR2序列(025)，并且所述第二抗原結合區還包含SEQIDNO:2的VHCDRl序列和SEQIDNO:3的VHCDR2序列(169)。33.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區包含含SEQIDNO:22的VH區和含SEQIDNO:26的VL區(025)，并且所述第二抗原結合區包含含SEQIDNO:1的VH區和含SEQIDNO:5的VL區(169)，或反之亦然。34.雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，其中所述第一抗原結合區結合HER2域II中的表位并且所述第二抗原結合區結合HER2域III或IV中的表位。35.權利要求34的雙特異性抗體，其中所述第二抗原結合區結合HER2域III中的表位。36.權利要求34的雙特異性抗體，其中所述第二抗原結合區結合HER2域IV中的表位。37.權利要求34至36任一項的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合區阻斷參考抗體與可溶性HER2的結合，其中所述參考抗體包含含SEQIDNO:63的序列的VH區和含SEQIDNO:67的序列的VL區(153)。38.權利要求34至37任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和/或第二抗原結合區包含權利要求1至33任一項的VH區和任選地VL區。39.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體還包含第一Fe區和第二Fe區。40.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其包含第一Fab臂和第二Fab臂，其中所述第一Fab臂包含第一抗原結合區和第一Fe區，并且其中所述第二Fab臂包含第二抗原結合區和第二Fe區。41.權利要求1-38任一項的雙特異性抗體，其包含第一Fab臂和第二Fab臂，其中所述第一Fab臂包含第二抗原結合區和第一Fe區，并且其中所述第二Fab臂包含第一抗原結合區和第二Fe區。42.權利要求39-41任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和第二Fab臂的同種型獨立選自IgGl，IgG2，IgG3，和IgG4。43.權利要求42的雙特異性抗體，其中所述第一和第二Fe區的同種型獨立選自IgGl和IgG4。44.權利要求43的雙特異性抗體，其中所述第一和第二Fe區一個是IgGl同種型且一個是IgG4同種型。45.權利要求43的雙特異性抗體，其中所述第一和第二Fe區是IgGl同種型。46.權利要求39至45的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在選自409，366，368，370，399,405和409的位置的氨基酸取代，且所述第二Fe區具有在選自405，366，368，370，399，407，和409的位置的氨基酸取代，并且所述第一Fe區和所述第二Fe區不在相同的位置中取代。47.權利要求39至45任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區在409位具有除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區具有在選自405，366，368，370，399和407位的位置的氨基酸取代。48.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸且所述第二Fe區在405位具有除了Phe之外的氨基酸。49.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區在409位具有除了Lys7Leu或Met之外的氨基酸,并且所述第二Fe區在405位具有除了Phe,Arg或Gly之外的氨基酸。50.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區包含在405位的Phe和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區包含在405位的除了Phe之外的氨基酸和在409的Lys。51.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區包含在405位的Phe和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區包含在405位的除了Phe，Arg或Gly之外的氨基酸和在409位的Lys。52.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區包含在405位Phe和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區包含在405位的Leu和在409位的Lys。53.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區包含在405位的Phe和在409位的Arg，并且所述第二Fe區包含在405位的除了Phe，Arg或Gly之外的氨基酸和在409位的Lys。54.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區包含在405位的Phe和在409位的Arg，并且所述第二Fe區包含在405位的Leu和在409位的Lys。55.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區包含在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。56.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區包含在409位的Arg,并且所述第二Fe區包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。57.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區包含在370位的Lys、在405位的Phe和在409位的Arg，并且所述第二Fe區包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。58.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在409位的除了Lys,Leu或Met之外的氨基酸,并且所述第二Fe區具有在407位的除了Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gin,Arg,Ser或Thr之外的氨基酸。59.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在409位的除了Lys,Leu或Met之外的氨基酸,并且所述第二Fe區具有在407位的Ala,Gly,His,He,Leu,Met,Asn,Val或Trp060.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在409位的除了Lys,Leu或Met之外的氨基酸,并且所述第二Fe區具有在407位的Gly,Leu,Met,Asn或Trp061.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區具有在407位的除了Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gin,Arg,Ser或Thr之外的氨基酸和在409位的Lys。62.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區具有在407位的Ala，Gly,His,He,Leu,Met,Asn,Val或Trp和在409位的Lys。63.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區具有在407位的Gly，Leu,Met,Asn或Trp和在409位的Lys。64.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在407位的Tyr和在409位的Arg,并且所述第二Fe區具有在407位的除了Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr之外的氨基酸和在409位的Lys。65.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在407位的Tyr和在409位的Arg,并且所述第二Fe區具有在407位的Ala,Gly,His,He,Leu,Met,Asn,Val或Trp和在409位的Lys。66.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在407位的Tyr和在409位的Arg，并且所述第二Fe區具有在407位的Gly，Leu,Met,Asn或Trp和在409位的Lys。67.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fe區具有⑴在368位的除了Phe,Leu和Met之外的氨基酸，(ii)在370位的Trp，(iii)在399位的除了Asp,Cys,Pro,Glu或Gln之外的氨基酸,或(iv)在366位的除了Lys,Arg,Ser,Thr,或Trp之外的氨基酸。68.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在409位的Arg,Ala,His或Gly,并且所述第二Fe區具有(i)在368位的Lys,Gin,Ala,Asp,Glu,Gly,His,He,Asn,Arg,Ser,Thr,Val,或Trp,或(ii)在370位的Trp，或(iii)在399位的Ala,Gly,He,Leu,Met,Asn,Ser,Thr,Trp,Phe,His,Lys,Arg或Tyr,或(iv)在366位的Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val,Gin,Phe,Gly,He,Leu,Met,或Tyr。69.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一Fe區具有在409位的Arg，并且所述第二Fe區具有(i)在368位的Asp,Glu,Gly,Asn,Arg,Ser,Thr,Val,或Trp,或(?)在370位的Trp，或(iii)在399位的Phe,His,Lys,Arg或Tyr,或(iv)在366位的Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val,Gin。70.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和第二Fe區，除了指明的突變外，包含SEQIDNO:236的序列(IgGlm(a))。71.權利要求39至46任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和所述第二Fe區都不在鉸鏈區包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。72.權利要求39至70任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和所述第二Fe區都在鉸鏈區包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。73.權利要求39至72任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和第二Fe區是人抗體Fe區。74.權利要求40至73任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和第二Fab臂，除了指明的突變外，包含選自下組的序列:SEQIDNO:234，235，236，237，238，239，240，241，242，243,244和245。75.前述任一項權利要求`的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區包含人抗體VH序列和，任選地，人抗體VL序列。76.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區來自重鏈抗體。77.權利要求1至75任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和第二抗原結合區包含第一和第二輕鏈。78.權利要求77的雙特異性抗體，其中所述第一和第二輕鏈是不同的。79.權利要求34至78任一項的雙特異性抗體，其中所述第一和/或第二Fe區包含去除用于Asn連接的糖基化的接納體位點的突變。80.前述任一項權利要求的雙特異性抗體，其綴合至一種或多種其它部分，如藥物、放射性同位素、細胞因子或細胞毒性部分，或含有它們的一種或多種接納體基團。81.權利要求80的雙特異性抗體，其中至少一種細胞毒性部分選自下組:紫杉醇(taxol);細胞松弛素B(cytochalasinB);短桿菌肽D(gramicidinD);溴化乙錠(ethidiumbromide);吐根喊(emetine);絲裂霉素(mitomycin);依托泊苷(etoposide)；替尼泊苷(tenoposide)；長春新堿(vincristine)；長春堿(vinblastine);秋水仙素(colchicin);多柔比星(doxorubicin);柔紅霉素(daunorubicin);二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione);微管蛋白抑制劑如美登素(maytansine)或其類似物或衍生物；米托蒽醌(mitoxantrone);光神霉素(mithramycin);放線菌素D(actinomycinD);1_去氫睪留酮(l-dehydrotestosterone);糖皮質激素類(glucocorticoids);普魯卡因(procaine);丁卡因(tetracaine);利多卡因(Iidocaine);普蔡洛爾(propranolol)；和嘌羅霉素(puromycin);加利車霉素(calicheamicin)或其類似物或衍生物；抗代謝物(anantimetabolite)如甲氨蝶呤(methotrexate)、6_疏基嘌呤(6_mercaptopurine)、6-硫代鳥票呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabin)、5_氟尿啼唳(5_fIuorouraciI);達卡巴嗪(decarbazine)、羥基脲(hydroxyurea)、天冬酰胺酶(asparaginase)、吉西他濱(gemcitabine)或克拉屈濱(cladribine);焼化劑(alkylatingagent)如氮芥(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)、洛莫司汀(lomustin,CCNU)、環憐酉先胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈服霉素(streptozotocin)、達卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)、丙卡巴餅(procarbazine)、絲裂霉素C(mitomycinC)、J幌銷(cisplatin)、卡銷(carboplatin)、倍癌霉素A(duocarmycinA)、倍癌霉素SA(duocarmycinSA)，雷徹霉素(rachelmycin，CC-1065)或其類似物或衍生物；抗生素如更生霉素(dactinomycin)、博來霉素(bleomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、伊達比星(idarubicin)、光神霉素(mithramycin)、絲裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普卡霉素(plicamycin)、安曲霉素(anthramycin，AMC);抗有絲分裂劑(antimitoticagent)如monomethylauristatinE或F或其類似物或衍生物；白喉毒素(diphtheriatoxin)和相關的分子如白喉A鏈(diphtheriaAchain)和其活性片段和雜合分子，菌麻毒素(ricintoxin)如菌麻毒素A或去糖基化的蓖麻毒素A鏈毒素，霍亂毒素(choleratoxin),志賀樣毒素(Shiga-liketoxin)如SLT-1^SLT-11、SLT-1IV，LT毒素，C3毒素，志賀毒素(Shigatoxin)，百日咳毒素(pertussistoxin),破傷風毒素(tetanustoxin),大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制齊Li，假單胞菌外毒素(Pseudomonasexotoxin),相思豆毒素(alorin)，阜草素(saporin)，蒴蓮根毒素(modeccin)，gelanin，相思豆毒素A鏈(abrinAchain)，蒴蓮根毒素A鏈(modeccinAchain)，alpha-sarcin，油桐蛋白質(Aleuritesfordiiproteins)，石竹素蛋白(dianthinproteins),美洲商陸毒蛋白(Phytolaccaamericanaproteins)如PAPI>PAPI1、和PAP-S,苦瓜抑制劑(momordicacharantiainhibitor),麻瘋樹毒蛋白(curcin),巴豆毒蛋白(crotin),肥阜草抑制劑(sapaonariaofficinalisinhibitor),白樹毒素(gelonin),mitogellin,局限曲菌素(restrictocin),酚霉素(phenomycin),和依諾霉素毒素(enomycintoxins);核糖核酸酶(RNA酶)，DNA酶I;葡萄球菌腸毒素A(StaphylococcalenterotoxinA);美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)；白喉毒素(diphtherintoxin);和假單胞菌內毒素(Pseudomonasendotoxin)。82.權利要求80的雙特異性抗體，其綴合至選自下組的至少一種細胞毒性部分:美登素，加利車霉素，倍癌霉素，雷徹霉素(CC-1065),monomethylauristatinE,monomethylauristatinF或其類似物、衍生物或前藥。83.權利要求80的雙特異性抗體，其綴合至選自下組的細胞因子:IL-2，IL-4，IL-6，IL-7,IL-10,IL-12,IL-13，IL-15，IL-18，IL-23，IL-24，IL-27，IL_28a，IL_28b，IL-29，KGF，IFNa,IFNβ,IFNy，GM-CSF，CD40L，Flt3配體，干細胞因子，安西司亭(ancestim)，和TNFa。84.權利要求80的雙特異性抗體，其綴合至放射性同位素，如a輻射體。85.用于產生雙特異性抗體的體外方法，所述方法包括以下步驟:a)提供包含第一Fe區的第一HER2抗體，所述Fe區包含第一CH3區，b)提供包含第二Fe區的第二HER2抗體，所述Fe區包含第二CH3區，c)在還原性條件下溫育所述第一HER2抗體與所述第二HER2抗體，和d)獲得所述雙特異性抗體，其中所述第一和第二CH3區的序列不同并且使得所述第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用強于所述第一和第二CH3區各自的同二聚相互作用。86.權利要求85的方法，其中第一和第二抗體的至少一種阻斷包含以下的抗體與可溶性人表皮生長因子受體2(HER2)的結合:a)包含SEQIDNO:165的序列的VH區和包含SEQIDNO:169的序列的VL區(005)，b)包含SEQIDNO:22的序列的VH區和包含SEQIDNO:26的序列的VL區(025)，c)包含SEQIDNO:63的序列的VH區和包含SEQIDNO:67的序列的VL區(152)，和d)包含SEQIDNO:1的序列的VH區和包含SEQIDNO:5的序列的VL區(169)。87.權利要求85和86任一項的方法,其中所述第一和第二Fe區包含根據權利要求39至64任一項的氨基酸取代。88.—種通過權利要求86至87任一項的方法可獲得的雙特異性抗體。89.—種產生如權利要求1至88任一項中所定義的雙特異性抗體的重組真核或原核宿主細胞。90.一種包含權利要求1至84中任一項所定義的雙特異性抗體和藥學可接受載體的藥物組合物。91.權利要求1至84任一項的雙特異性抗體，其用作藥物。92.權利要求1至84任一項的雙特異性抗體，其用在治療癌癥中。93.用于權利要求92的用途的雙特異性抗體，其中所述癌癥選自下組:乳腺癌，前列腺癌，非小細胞肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，結腸直腸癌，食管癌，頭和頸的鱗狀細胞癌，子宮頸癌，胰腺癌，睪丸癌，惡性黑色素瘤和軟組織癌。94.用于權利要求91至93任一項的用途的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體用于與一種或多種其它治療劑組合治療癌癥，所述治療劑如化療劑。95.權利要求1至84任一項的雙特異性抗體在生產用于治療癌癥的藥物中的用途，其任選地包含權利要求92和/或93的進一步特征。96.一種用于抑制表達HER2的一種或多種腫瘤細胞的生長和/或增殖的方法，其包括向有其需要的個體施用根據權利要求1至84任一項的雙特異性抗體。97.一種用于治療癌癥的方法，其包括a)選擇患有癌癥的受試者，所述癌癥包含表達HER2的腫瘤細胞，和b)向所述受試者施用根據權利要求1-84任一項的雙特異性抗體，或根據權利要求90的藥物組合物。98.權利要求97的方法，其中所述癌癥選自下組:乳腺癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌/子宮頸癌、肺癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睪丸癌、軟組織腫瘤如滑膜肉瘤、和膀胱癌。99.一種用于產生權利要求1至84任一項的雙特異性抗體的方法，所述方法包括以下步驟:a)培養權利要求89的宿主細胞，和b)從培養基純化所述雙特異性抗體。【文檔編號】A61K39/395GK103796678SQ201280030714【公開日】2014年5月14日申請日期:2012年4月20日優先權日:2011年4月20日【發明者】B.德戈伊杰,P.范伯克爾,K.斯特魯馬尼,A.F.拉布里杰恩,J.J.尼杰森,J.I.米斯特斯,P.帕倫,J.舒爾曼申請人:根馬布股份公司