Mfg-e8及其用途

Mfg-e8及其用途
【專利摘要】本發明公開了使用乳脂球表皮生長因子-因子VIII(MFG-E8)治療腦缺血癥的方法，同樣地公開了重組人MFG-E8及其在用于治療缺血/再灌注后炎癥和器官損傷、以及膿毒癥和肺損傷的藥物組合物、產品和方法中的用途。
【專利說明】MFG-E8及其用途
[0001]相關申請的交叉參考
[0002]本申請要求保護2011年4月28日提交的美國臨時專利申請N0.61/480，031的利益，將其內容通過引用整體并入本文。
[0003]政府資助聲明
[0004]本發明是在國立衛生研究院授予的基金號GM057468由政府支持進行的。政府具有本發明的某些權利。
[0005]發明背景
[0006]在整個本申請中，在括號中提及各種出版物。這些參考資料的完全引用可見于說明書的結尾。將這些出版物的公開內容通過引用整體并入本申請中以更全面地描述本發明所屬的領域。
[0007]炎癥和細胞凋亡在缺血損傷后腦梗塞的演化中起著至關重要的作用。在腦梗塞核心的壞死細胞死亡后，相對低灌注的半陰影中的細胞死亡通過炎癥和細胞凋亡機制隨時間發生。炎癥過程牽涉NF-K B介導的可引起細胞損傷的細胞因子(例如TNF-α )的釋放(Dirnagl等人1999)。細胞凋亡包括促細胞凋亡分子例如bax的釋放和半胱天冬氨酸蛋白酶的激活，從而導致DNA片段化和細胞死亡。被缺血激活的細胞損傷機制被細胞存活機制(包括抗細胞凋亡分子例如bcl-2的上調)抵消(Antonsson2004)。過氧化物酶體增生物激活受體-Y (PPAR-Y)是已顯示通過下調細胞因子釋放而對抗炎癥的配體誘導性轉錄因子(Ricote和Glass2007)。炎癥和細胞凋亡的治療性抑制可在缺血性卒中后拯救半陰影。
[0008]膿毒癥是最盛行的疾病之一，占據重癥監護室(I⑶)接收者的20% (Angus，等人，2001)。證據表明僅在美國，每年就有超過750，000人發生膿毒癥，總體死亡率為28.6%(Angus，等人，2001)。盡管已在膿毒癥患者的治療中取得進展，但大量此類患者死于緊接著發生的膿毒癥休克和多器官衰竭(Ferrer,等人，2008; Strehlow,等人，2006;Martin,等人，2003;Guidet,等人，2005)。醫院記錄分析表明已死于膿毒癥的患者的總數實際上在不斷增加(Martin,等人，2003)。隨著美國人口老齡化，膿毒癥的發病率預計將增加，因為膿毒癥的發病率和死亡率隨年齡增長而穩定上升(Angus，等人，2001;Martin,等人，2003)。因此，存在對膿毒癥患者的有效新型療法的緊迫而未滿足的醫學需要。
[0009]乳脂球表皮生長因子VIII(MFG_E8)，也稱為乳粘素(lactadherin)，是最初在小鼠乳和乳腺上皮中發現的66-kDa糖蛋白(Stubbs等人1990)。其為抑制腸病原體結合和感染性的重要乳黏液蛋白相關防御組分(Yolken，等人，1992)。隨后發現MFG-E8廣泛地分布 在小鼠和其它哺乳動物物種包括人的不同組織中(Aziz等人2009;Hanayama等人2004; Larocca等人1991)。在腦中，MFG-E8在星形細胞(Boddaert等人2007)和小神經膠質細胞中表達(Fuller和Van Eldik2008)。MFG-E8包含兩個N-末端表皮生長因子(EGF)樣重復，和兩個C末端盤菌素(discoidin)/F5/8C結構域。MFG-E8通過第二個EGF結構域中包含的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序結合ανβ3/5整聯蛋白異二聚體(Andersen等人1997)。[0010]最近的研究已顯示MFG-E8還可由活化的巨噬細胞和未成熟樹突細胞分泌，并且已與凋亡細胞的調理作用關聯(Hanayama,等人，2002;Hanayama,等人，2004;Miyasaka,等人，2004; Thery,等人，1999; Oshima,等人，2002)。MFG-E8 的第二個 F5/8C 結構域對陰離子膜磷脂例如磷脂酰絲氨酸具有高親和力，所述磷脂在細胞凋亡過程中變得外露(Andersen等人1997; Shao等人2008)。已顯示MFG-E8通過在凋亡細胞上暴露的磷脂酰絲氨酸與吞噬細胞上的α νβ 3/5整聯蛋白受體之間充當橋接分子來促進凋亡細胞的吞噬去除。凋亡細胞的這種增強的清除阻止了會釋放導致組織損傷的促炎介質的繼發性壞死(Hanayama等人2002)。MFG-E8還在組織損傷中產生其它有益效應，例如在腸缺血(Cui等人2010)和阿爾茨海默病(Fuller和Van Eldik2008)中抑制炎癥和細胞凋亡。
[0011]先前的研究已顯示含大鼠MFG-E8的外來體(exosome)或重組鼠MFG-E8 (rmMFG-E8)的施用會增加凋亡細胞的吞噬作用，減少促炎細胞因子，和在由盲腸結扎穿孔(CLP)誘導的膿毒癥的大鼠模型中改善存活(Miksa，等人，2008;Miksa，等人，2009c)。然而，一個阻礙將MFG-E8開發為患者的治療劑的障礙是動物蛋白質在人中的潛在免疫原性。
[0012]本發明特別地使用重組人MFG-E8 (rhMFG_E8)來解決對治療腦缺血癥和膿毒癥以及其它疾病和障礙的需求。
[0013]發明概述
[0014]本發明提供了預防和/或治療受試者的腦缺血癥的方法，包括以有效地預防和/或治療腦缺血癥的量給受試者施用乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)。
[0015]本發明還提供制備用于預防和/或治療腦缺血癥的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地預防和/或治療腦缺血癥的量在藥物組合物中配制乳脂球表皮生長因子-因子 VIII(MFG-E8)。
[0016]本發明還提供了包含以用于預防和/或治療腦缺血癥的劑型存在的乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
[0017]本發明還提供了藥品，其中包含在藥學上可接受的載體中配制的乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8);和提供關于施用MFG-E8以預防和/或治療腦缺血癥的說明的包裝說明書。
[0018]本發明還提供了具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列的重組人MFG-E8 (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8是非糖基化的。
[0019]本發明還提供了預防和/或治療受試者的缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的方法，包括以有效地預防和/或治療炎癥和/或器官損傷的量給受試者施用重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0020]本發明還提供了治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的方法，所述方法包括給受試者施用有效地減弱膿毒癥的生理作用的量的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ IDNO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0021] 本發明還提供了治療受試者的肺損傷的方法，包括給受試者施用有效地治療肺損傷的量的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0022]還提供了制備用于預防和/或治療受試者的缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0023]還提供了制備用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地減少膿毒癥的生理作用的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0024]還提供了制備用于治療受試者的肺損傷的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地治療肺損傷的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8)，其中所述 rhMFG-E8 具有與人 MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0025]還提供了包含以用于預防和/或治療缺血/灌注后炎癥和/或器官損傷的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。 [0026]還提供了包含以用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-ESWy^iihMFG-ES) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
[0027]還提供了包含以用于治療肺損傷的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8)和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中所述rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0028]還提供了包含在藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)的藥物組合物；和提供關于施用rhMFG_E8以治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的說明的包裝說明書，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0029]還提供了包含在藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8);和提供關于施用rhMFG_E8以治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的受試者的說明的包裝說明書，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ IDNO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0030]還提供了包含在藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8);和提供關于施用rhMFG_E8以治療患肺損傷的說明的包裝說明書的藥品，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0031]附圖概述
[0032]圖1.表達和純化的rhMFG-E8的SDS-PAGE分析。泳道I，純化的rhMFG_E8 (lug);泳道2，純化的rhMFG-E8 (0.5 μ g);泳道3，分子量標準(marker);泳道4，未純化的細菌裂解物。
[0033]圖2.表達和純化的rhMFG_E8的Western印跡分析。所述特定抗人抗體通過western印跡分析識別MFG-E8。泳道I,純化的rhMFG_E8 (lug);泳道2,分子量標記。
[0034]圖3.rhMFG-E8增強對凋亡細胞的吞噬作用。pHrodo_SE-標記的凋亡胸腺細胞的熒光強度在被巨噬細胞吞食后增加。用FITC抗-⑶llb/c標記脾巨噬細胞，用pHrodo-SE標記胸腺細胞。將細胞共溫育60分鐘，收集細胞，在進行熒光顯微鏡術之前用1%PFA固定細胞。⑶llb/c+pHrodo+細胞的吞噬指數示于圖中。數據表示為平均值土SE(n=6-9/組)并且通過單因素方差分析(one-way AN0VA)和Student-Newman-Keuls法進行比較:*Ρ〈0.05,相對單獨的培養基。
[0035]圖4a_4b.rhMFG_E8在 CLP后減少胸腺細胞凋亡。大鼠經歷CLP以誘導實驗性膿毒癥，在CLP后立即人用白蛋白(載體)、rmMFG-E8 (20 μ g/kg BW)或rhMFG_E8 (20 μ g/kgBff)進行治療。(A)在CLP后20h通過膜聯蛋白V/PI染色和FACS分析評價胸腺細胞凋亡。數據表示為平均值土SE(n=4/組)，并且通過單因素方差分析和Student-Newman-Keuls法進行比較:*P〈0.05，相對Sham組；#P〈0.05，相對載體組。(B)在CLP后20h通過Western印跡法測定胸腺中切割的胱天蛋白酶-3的改變。提供了 2個獨立的觀察的代表性凝膠。
[0036]圖5a_5b.rhMFG_E8減弱CLP后的器官損傷。大鼠經歷CLP以誘導實驗性膿毒癥并且在CLP后立即用人白蛋白(載體)、rmMFG-E8 (20 μ g/kg Bff)或rhMFG_E8 (20 μ g/kg BW)進行處理。在CLP后20h測量乳酸(A)和IL_6(B)的血清水平。數據表示為平均值土SE(n=4-6/組)并且通過單因素方差分析和Student-Newman-Keuls法進行比較:*Ρ〈0.05，相對于Sham組；#Ρ〈0.05，相對于載體組。
[0037]圖6.利用rmMFG-E8或rhMFG_E8的治療改善了盲腸結扎與穿孔后第10天的存活率。在CLP后，給小鼠提供人白蛋白治療(Vehicle)或rmMFG-E8(20y g/kg BW)或rhMFG-E8 (20 μ g/kg BW)治療。每一個組中有20只動物。通過Kaplan-Meier法評價存活率，通過使用log-rank檢驗比較存活率。*P〈0.05，相對于載體組。
[0038]圖7.由中腦動脈閉塞(MCAO)造成的局灶性腦缺血癥后腦MFG-E8水平的改變。在MCAO后24h測量腦MFG-E8水平。數據表示為平均值土 SE，通過Student’ s t_檢驗分析所述數據。與Sham相比較，腦缺血癥(MCAO)降低MFG-E8水平(n=4_5，*p〈0.05，相對于Sham)。
[0039]圖8.rhMFG-E8治療減少局灶性腦缺血癥后神經學缺損。通過評價腦缺血癥后24h感覺運動和反射行為缺陷來測定組合神經學缺損評分(組合神經評分)。數據表示為平均值土SE,并且通過單因素方差分析和Student Newman Keul氏法來進行分析。相較于Sham,腦缺血癥在經載體和經rhMFG-E8處理的動物中引起顯著的神經學缺損。相較于載體組，rhMFG-E8處理顯著減少神經學缺損(n=6, *p〈0.05,相對于Sham, #p<0.05,相對于載體)。
[0040]圖9a_9c.相比于腦缺血癥后經載體和rhMFG_E8處理而言經sham-操作的大鼠
(Sham)的梗塞面積和腦組織病理學的改變。(a)用氯化三苯四唑翁| (TTC)對新鮮腦組織的2mm厚冠狀切片進行染色，隨后利用NIHImageJ軟件進行數字分析。TTC染色的代表性圖像示于條塊的頂部。數據表示為平均值土SE，通過Student’ s t檢驗進行分析。利用rhMFG-E8的處理相較于利用載體的處理減小了梗塞面積(n=6, *p〈0.05,相對于載體)。(b)蘇木精伊紅(H&E)染色的切片的顯微照片通過掃描切片(A、C、E)和通過在400x初始放大倍數(B、D、F)下的亮視野顯微鏡術來獲得。Sham(A、B)僅顯示正常的活的嗜堿性神經元(通過箭頭顯示的)。載體組(C、D)主要顯示壞死的嗜伊紅神經元(通過長箭頭顯示的)。rhMFG-E8處理(E、F)保護免受神經元壞死損傷，從而導致活的嗜堿性神經元和壞死的嗜伊紅神經元的混合物。比例尺條棒(Scale bar) =50 μ m0 (c)每個H&E染色的載片測定6個隨機視野中的完整神經元(嗜堿性神經元)的平均數目。數據表示為平均值土SE，通過Kruskal-Wallis單因素ANOVA進行分析。相較于Sham動物,在經載體和經rhMFG_E8處理的動物中腦缺血癥(MCAO)引起完整神經元數目的顯著減少。rhMFG-E8處理保護了神經元免受壞死(η=6, *ρ〈0.05,相對于Sham ；#ρ<0.05,相對于載體)。
[0041]圖1Oa-1Od.腦缺血癥后,相較于載體和rhMFG_E8處理而言經sham-操作的大鼠(Sham)中腦IL-6、TNFa和髓過氧化物酶的改變。(a)在MCAO后24h通過ELISA測量腦IL-6水平。數據表示為平均值土SE，通過單因素方差分析和Student Newman Keul氏法進行分析。腦缺血癥(MCAO)在經載體和rhMFGE8-處理的動物中相較于Sham動物而言引起IL-6水平的升高。相較于利用載體的處理，利用rhMFG-E8的處理下調IL-6表達(n=6，*p〈0.05，相對于Sham ；#p<0.05，相對于載體)。(b)對腦組織的TNF- α進行免疫組織化學染色，在亮視野顯微鏡術下在400χ初始放大倍數下進行檢查。經載體(B)和rhMFG-E8(C)處理的動物顯示相較于Sham動物(A)而言增加的TNF-α表達。rhMFG_E8處理(C)相較于載體(B)而言減少了 TNF-α表達。比例尺條棒=50 μ m。(c)腦組織針對嗜中性粒細胞標志物髓過氧化物酶免疫組織化學染色， 并且以400X初始放大倍數在亮視野顯微鏡術下檢查。Sham(A)動物未顯示髓過氧化物酶的染色(無嗜中性粒細胞浸潤)，然而載體(B)和rhMFG-E8(C)處理的動物顯示髓過氧化物酶的染色。腦缺血癥后的rhMFG-E8處理(C)相較于載體(B)而言減少了髓過氧化物酶染色。比例尺條棒=50 μ m。(d)通過髓過氧化物酶免疫組織化學進行的腦嗜中性粒細胞浸潤的定量。嗜中性粒細胞在亮視野顯微鏡術中在400x初始放大倍數下被鑒定為小的圓形髓過氧化物酶染色細胞。將每個載片中6個隨機視野內嗜中性粒細胞的平均值測定為嗜中性粒細胞計數/40x高倍視野(hpf)。數據表示為平均值土SE，通過單因素方差分析和Student Newman Keul氏法來進行分析。與Sham動物相比較,經載體和rhMFG-E8處理的動物顯示增加的嗜中性粒細胞浸潤。rhMFGE8處理相較于載體而言減少了腦嗜中性粒細胞浸潤(η=4, *ρ〈0.05,相對于Sham ；#ρ<0.05,相對于載體)。
[0042]圖1 la-1 Ib.腦缺血癥后ICAM-1和過氧化物酶體增生物激活受體-Y (PPAR- Y )表達的改變。(a)腦ICAM-1基因表達通過RT-PCR來測量。數據表示為平均值土SE，并且通過單因素方差分析和Student Newman Keul氏法來進行分析。相較于Sham而言腦缺血癥，在載體中導致ICAM-1表達的上調。rhMFG-E8處理減少了 ICAM-1表達，即使相較于載體而言并不顯著(η=4_6, *ρ〈0.05,相比于Sham)。(b)MCAO后24h通過western印跡測定PPAR- Y蛋白水平。數據表示為平均值土SE，并且通過Kruskal-Wallis單因素方差分析來進行分析。與Sham相比較，腦缺血癥下調載體組中的PPAR- Y。rhMFG_E8處理相較于載體而言上調PPAR- Y表達(n=6，*p<0.05，相對于Sham ；#p<0.05，相對于載體)。[0043] 圖12a_12c.在大鼠的腦缺血癥后，通過Bcl_2/Bax比率和TUNEL染色測量的rhMFG-E8處理對細胞凋亡的作用。(a)Bcl_2/Bax比率通過western印跡來測定。數據表示為平均值土SE,并且通過單因素方差分析和Student Newman Keul氏法來進行分析。Bcl_2/Bax比率在載體與Sham之間沒有不同。相較于載體和Sham而言，rhMFG_E8處理顯著升高了 Bcl-2/Bax比率(n=6，*p〈0.05，相對于載體和Sham)。(b)腦缺血癥后的TUNEL染色。在200x初始放大倍數下的熒光顯微鏡下，凋亡細胞顯示為更亮的熒光，然而碘化丙錠(PI)更暗的染色顯示TUNEL反應產物的細胞核定位。Sham組(A、B、C)未顯示細胞凋亡，因為對于TUNEL染色(A)無陽性細胞。載體組(D、E、F)由TUNEL陽性細胞數目增加顯示增加的細胞凋亡(D)。TUNEL染色(D)和PI染色(E)的合并(F)顯示載體動物的半影中大多數細胞是凋亡的。利用rhMFG-E8 (G、H、I)的處理減少了細胞凋亡，如相較于載體TUNEL染色⑶而言更少的TUNEL染色(G)顯示的。rhMFG-E8TUNEL染色(G)和PI染色(H)的合并⑴顯示相較于載體組(F)而言rhMFG-E8處理保護了腦細胞免受細胞凋亡。(c) TUNEL染色的定量。在200x初始放大倍數下對每一張載片捕獲8個隨機視野。計數TUNEL陽性細胞的平均數目，將其表達為TUNEL細胞/20x高倍視野(hpf)。數據表示為平均值土 SE，并且通過單因素方差分析和Student Newman Keul氏法來進行分析。相較于Sham動物,腦缺血癥增加了經載體和rhMFG-E8處理的動物中的TUNEL-陽性細胞。利用rhMFG_E8的處理相較于載體組而言減少了 TUNEL陽性細胞的數目(n=4，*p〈0.05，相對于Sham ；#p<0.05，相對于載體)。
[0044]發明詳述
[0045]本發明提供了預防和/或治療受試者的腦缺血癥的方法，包括以有效地預防和/或治療腦缺血癥的量給受試者施用乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)。
[0046]受試者可以例如是患有腦缺血癥的受試者或處于發生腦缺血癥風險中的患者，例如，經歷或即將經歷手術的患者。腦缺血癥可以是例如由堵塞腦血管的血塊引起的局灶性腦缺血，或由向腦的血流減少引起的全腦缺血。
[0047]如本文中所用，“治療”受試者的腦缺血癥意指阻止或減少腦缺血癥的生理影響。例如，給受試者施用MFG-E8可降低白細胞介素-6 (IL-6)的腦水平，和/或減少浸潤的嗜中性粒細胞的數目，和/或減少腦炎癥和/或細胞凋亡。優選地，MFG-E8的施用減少和/或防止腦組織的死亡。優選，受試者的存活概率通過MFG-E8的施用得到了提高。
[0048]本發明還提供了制備用于預防和/或治療腦缺血癥的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地預防和/或治療腦缺血癥的量在藥物組合物中配制乳脂球表皮生長因子-因子 VIII(MFG-E8)。
[0049]本發明還提供了包含以用于預防和/或治療腦缺血癥的劑型存在的乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
[0050]本發明還提供了包含在藥學上可接受的載體中配制的乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8);和提供關于施用MFG-E8以預防和/或治療腦缺血癥的說明的包裝說明書的藥品。
[0051]在本文中描述的任何方法、組合物、產品或用途的一個優選實施方案中，MFG-E8是重組人MFG-E8(rhMFG-E8)。在不同的實施方案中，rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性，或與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性，或與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。在一個優選實施方案中，MFG-E8是非糖基化的。
[0052]本發明還提供了具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列的重組人MFG-E8 (rhMFG-E8)，其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0053]本發明還提供了預防和/或治療受試者中缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的方法，包括以有效地預防和/或治療炎癥和/或器官損傷的量給受試者施用重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，其中rhMFG-E8是非糖基化的。缺血/再灌注可以例如是胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、脊髓或擠壓肢體缺血/再灌注中的一種或多種。
[0054]優選地，所述方法阻止或降低了腫瘤壞死因子-α、白細胞介素_6、白細胞介素-1 β、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、乳酸或乳酸脫氫酶中一種或多種的血清升高。優選地，炎癥被預防或治療。優選地，器官損傷被預防或治療，其中例如，所述器官是胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、脊髓或擠壓肢體中的一種或多種。優選地，受試者的存活概率增加。 [0055]本發明還提供了治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的方法，所述方法包括給受試者施用有效地減小膿毒癥的生理作用的量的重組人乳脂球表皮生長因子-因子 VIII (rhMFG-E8)，其中 rhMFG_E8 具有與人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。膿毒癥的生理作用可以是例如血清TNF-α水平的升高，和/或血清IL-6水平的升高，和/或休克。優選地，rhMFG-E8的施用減輕了全身性炎癥。
[0056]本發明還提供了治療受試者的肺損傷的方法，包括給受試者施用有效地治療肺損傷的量的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。在一個優選實施方案中，肺損傷是急性肺損傷。
[0057]除本文中公開的rhMFG_E8外的MFG-E8形式用于治療膿毒癥、缺血/再灌注和肺損傷的用途已進行了描述(US2009/0297498、W02009/064448)。
[0058]本發明還提供了制備用于預防和/或治療受試者中缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中 rhMFG_E8 具有與人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少 95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0059]本發明還提供了用于制備用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地減小膿毒癥的生理作用的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0060]本發明還提供了制備用于治療受試者的肺損傷的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地治療肺損傷的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中 rhMFG_E8 具有與人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少 95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0061]本發明還提供了包含以用于預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0062]本發明還提供了包含以用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0063]本發明還提供了包含以用于治療肺損傷的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0064]本發明還提供了包含在藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)和提供關于施用缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的說明的包裝說明書的藥品，其中rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0065]本發明還提供了包含在藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8);和提供關于施用rhMFG_E8以治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的說明的包裝說明書的藥品，其中rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) ( SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0066]本發明還提供了包含在藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8);和提供關于施用rhMFG_E8以用于治療肺損傷的說明的包裝說明書的藥品，其中rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0067]本發明還提供了乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)用于制備用于預防和/或治療腦缺血癥的藥劑的用途，以及乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)用于預防和/或治療腦缺血癥的用途。
[0068]本發明還提供重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)用于制備藥劑的用途，所述藥劑用于預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷，或用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者，或用于治療肺損傷，其中rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的，還提供了 rhMFG_E8用于預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷，或用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者，或用于治療受試者的肺損傷。
[0069]在重組人MFG-E8、方法、組合物、產品或用途的不同實施方案中，所述rhMFG_E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列，或rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E 8) (SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。[0070]可將MFG-E8在包含藥學上可接受載體的藥物組合物中給受試者施用。可接受的藥物載體的實例包括但不限于添加液(additive solution) _3 (AS_3)、鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、林格溶液、乳酸鹽林格溶液、Locke-Ringer溶液、Krebs Ringer溶液、Hartmann氏平衡鹽溶液和肝素化檸檬酸鈉右旋糖溶液。
[0071]無需過度實驗即可配制包含MFG-E8的組合物以施用給受試者，包括人(視具體應用而定)。此外，使用標準劑量-反應方案，無需過度實驗即可測定組合物的適當劑量。
[0072]因此，通過本領域內公知的方法，例如利用惰性稀釋劑或利用可食用載體，無需過度實驗即可制備設計用于口服、經舌、舌下、經頰和頰內施用的組合物。可將組合物封裝于明膠膠囊中或壓制成片劑。為了口服治療施用目的，可將本發明的藥物組合物與賦形劑整合在一起，以片劑、糖錠、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、華夫、口香糖等形式使用。
[0073]片劑、丸劑、膠囊、糖錠等還可包含粘合劑、接受者、崩解劑、潤滑劑、甜味劑和調味劑。粘合劑的一些實例包括微晶纖維素、黃蓍膠或明膠。賦形劑的實例包括淀粉或乳糖。崩解劑的一些實例包括海藻酸、玉米淀粉等。潤滑劑的實例包括硬脂酸鎂或硬脂酸鉀。助流劑的實例是膠體二氧化硅。甜味劑的一些實例包括蔗糖、糖精等。調味劑的實例包括薄荷、水楊酸甲酯、橙調味劑等。用于制備這些不同組合物的材料應當是藥學上純的并且在使用的量上是無毒的。
[0074]本發明的組合物可以例如通過靜脈內、肌內、硬膜內或皮下注射來容易地胃腸外施用。胃腸外施用可通過將本發明的組合物摻入溶液或懸浮液來實現。這樣的溶液或栓劑還可包括無菌稀釋劑例如注射用水、鹽溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑。胃腸外制 劑還可包括抗菌劑例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯、抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉以及螯合劑例如EDTA。還可添加緩沖劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調節張力的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。可將胃腸外制劑封裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。
[0075]直腸施用包括將藥物組合物施用進入直腸或大腸。這可使用栓劑或灌腸劑來實現。栓劑制劑可容易地通過本領域已知的方法來制備。例如，栓劑制劑可通過將甘油加熱至約120°C，將組合物溶解于甘油中，混合加熱的甘油(隨后可添加純化的水)和將熱混合物傾倒入栓劑模具中來制備。
[0076]經皮施用包括通過皮膚進行的組合物的經皮吸收。經皮制劑包括貼劑(例如公知的煙堿貼劑)、軟膏、乳膏、凝膠、油膏等。
[0077]本發明包括經鼻給哺乳動物施用治療有效量的組合物。如本文中所用，經鼻施用或鼻腔施用包括將組合物施用至患者的鼻道或鼻腔粘膜。如本文中所用，用于經鼻施用組合物的藥物組合物包括待施用(例如以鼻腔噴霧、滴鼻劑、懸浮液、凝膠、軟膏、乳膏或粉劑的形式)的通過公知方法制備的治療有效量組合物。組合物的施用還可使用鼻塞或鼻腔海綿來進行。
[0078]受試者可以是人或另一種動物。
[0079]來自人或小鼠MFG-E8的氨基酸序列示于下文中。
[0080]SEQ ID 勵:2-人]\^648-來自 GenBank NP005919
[0081]I mqvsrvlaal cgmllcasgl faasgdfcds slclnggtcl tgqdndiycl cpegftglvc
[0082]61 netergpcsp npcyndakcl vtldtqrgdi fteyicqcpv gysgihcete tnyynldgey[0083]121 mfttavpnta vptpaptpdl snnlasrcst qlgmeggaia dsqisasyvy mgfmglqrwg
[0084]181 pelarlyrtg ivnawhasny dskpwiqvnl lrkmrvsgvm tqgasragra eylktfkvay
[0085]241 sldgrkfefi qdesggdkef lgnldnnslk vnmfnptlea qyirlypvsc hrgctlrfel
[0086]301 lgcelhgcle plglknntip dsqmsasssy ktwnlrafgw yphIgrIdnq gkinawtaqs
[0087]361 nsakcwlqvd lgtqrqvtgi itqgardfgh iqyvcsykva hsddgvqwtv yeeqgsskvf
[0088]421 qgnldnnshk knifekpfma ryvrvlpvsw hnritlrlel Igc
[0089]人MGF-E8蛋白合成為上文中顯示的387個氨基酸的前體，其包含23個氨基酸的信號序列和364個氨基酸的成熟區域。本研究中表達的重組人蛋白是人MFG-E8的成熟分子(SP，Leu24-Cys387)，即 SEQ ID NO:2 的氨基酸 24 至 387，其在本文中稱為 SEQ ID NO:1。
[0090]SEQ ID NO: 3-小鼠 MFG-E8-來自 GenBank NP032620
[0091]I mqvsrvlaal cgmllcasgl faasgdfcds slclnggtcl tgqdndiycl cpegftglvc
[0092]61 netergpcsp npcyndakcl vtldtqrgdi fteyicqcpv gysgihcete tnyynldgey
[0093]121 mfttavpnta vptpaptpdl snnlasrcst qlgmeggaia dsqisasyvy mgfmglqrwg
[0094]181 pelarlyrtg ivnawhasny dskpwiqvnl lrkmrvsgvm tqgasragra eylktfkvay
[0095]241 sldgrkfefi qdesggdkef lgnldnnslk vnmfnptlea qyirlypvsc hrgctlrfel
[0096]301 lgcelhgcle plglknntip dsqmsasssy ktwnlrafgw yphIgrIdnq gkinawtaqs
[0097]361 nsakcwlqvd lgtqrqvtgi itqgardfgh iqyvcsykva hsddgvqwtv yeeqgsskvf
[0098]421 qgnldnnshk knifekpfma ryvrvlpvsw hnritlrlel Igc
[0099]根據下列實驗性詳細內容，本發明將得到更好地理解。然而，本領域技術人員將容易地理解，所討論的具體方法和結果僅舉例說明本發明，其將在隨后的權利要求中更全面地描述。
[0100]實驗詳細內容
[0101]實施例1.重組人MFG-E8和膿毒癥的治療
[0102]材料和方法
[0103] 重組人MFG-E8的表達:通過聚合酶鏈式反應擴增包含人MFG_E8cDNA的質粒模板獲得編碼人MFG-E8的成熟區域(364個氨基酸，R24-R387, SwissProt#:Q08431)的1095bp片段(SEQ ID NO: 3) ο將開放閱讀框架克隆進入pET-28a(+)載體(Novagen，Madison, WI)的Sail和Not I位點，位于噬菌體T7RNA聚合酶啟動子下游。終蛋白質產物包含融合至人MFG-E8的N末端的6個組氨酸。將質粒轉化進入大腸桿菌BL21 (DE3)細胞。將細胞在37°C于含有卡那霉素的2YT培養基中(Invitrogen)中生長過夜。通過異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)添加至終濃度1.01111來誘導^11^648蛋白質產生，并且將細胞在25°C繼續生長5h。通過離心收獲細胞,按照制造商的說明書(Novagen)純化誘導的rhMFG-E8蛋白。將rhMFG_E8級分混合，使用Triton X-114通過相分離除去蛋白質溶液的內毒素(Aida和Pabst, 1990)。使用先前描述的(Li,等人，2004)鱟溶解物測定(Limulusamebocyte lysate assay) (BioWhittaker Inc, Walkersville, MD)測定樣品中 LPS 的含量。在10-20%Tris-HCl凝膠上通過SDS-PAGE評價rhMFG_E8的純度，并且使用GelCode Blue染色劑(Pierce, Rockford IL)進行顯現。利用Amicon Ultra-15離心過濾設備將終產物濃縮至指定的濃度并且于_20°C貯存。
[0104]編碼人MFG-E8的DNA序列(除去信號肽)(SEQ ID NO: 4):
【權利要求】
1.一種預防和/或治療受試者的腦缺血癥的方法，包括以有效地預防和/或治療腦缺血癥的量給受試者施用乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)。
2.權利要求1的方法，其中所述受試者具有腦缺血癥。
3.權利要求1的方法，其中所述受試者是處于發生腦缺血癥的風險中的患者。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述腦缺血癥是由阻塞腦血管的血塊引起的局灶性腦缺血。
5.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述腦缺血癥是由至腦的血流減少引起的全腦缺血。
6.權利要求1-5中任一項的方法，其中施用MFG-E8降低了白細胞介素-6(IL_6)的腦水平。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中施用MFG-E8減少了浸潤中性粒細胞的數目。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中施用MFG-E8減輕腦炎癥和/或細胞凋亡。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中施用MFG-E8減少和/或預防腦組織的死亡。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中受試者的存活機會增加。
11.一種制備用于預防和/或治療腦缺血癥的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地預防和/或治療腦缺血癥的量在藥物組合物中配制乳脂球表皮生長因子-因子VIII(MFG-E8)。
12.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述MFG-E8是重組人MFG-E8(rhMFG_E8)。
13.權利要求12的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列。
14.權利要求12的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
15.權利要求12的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
16.權利要求1-15中任一項的方法，其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
17.一種藥物組合物，其包含以用于預防和/或治療腦缺血癥的劑型存在的乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)和藥學上可接受的載體。
18.—種藥品，其包含在藥學上可接受的載體中配制的乳脂球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8);和提供關于施用MFG-E8以預防和/或治療腦缺血癥的說明的包裝說明書。
19.權利要求17的藥物組合物或權利要求18的藥品，其中所述MFG-E8是重組人MFG-E8(rhMFG-E8)。
20.權利要求19的藥物組合物或藥品，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列。
21.權利要求19的藥物組合物或藥品，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
22.權利要求19的藥物組合物或藥品，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
23.權利要求17-22中任一項的藥物組合物或藥品，其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
24.乳脂球表皮生長因子-因子VIII(MFG-ES)用于制備用于預防和/或治療腦缺血癥的藥劑的用途。
25.一種重組人MFG-E8(rhMFG-E8)，其具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
26.權利要求25 的 rhMFG-E8，其中所述 rhMFG_E8 具有與人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
27.權利要求25 的 rhMFG-E8，其中所述 rhMFG_E8 具有與人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)相同的氨基酸序列。
28.一種預防和/或治療受試者的缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的方法，包括以有效地預防和/或治療炎癥和/或器官損傷的量給受試者施用重組人乳脂球表皮生長因子-因子 VIII (rhMFG-E8)，其中所述 rhMFG_E8 具有與人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
29.權利要求28的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
30.權利要求28 的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
31.權利要求28-30中任一項的方法，其中所述方法阻止或減少腫瘤壞死因子_α、白細胞介素_6、白細胞介素-1 β、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、乳酸或乳酸脫氫酶中的一種或多種的血清升高。
32.權利要求28-31中任一項的方法，其中所述受試者的存活機會增加。
33.權利要求28-32中任一項的方法，其中所述炎癥被預防或治療。
34.權利要求28-33中任一項的方法，其中所述器官損傷被預防或治療。
35.權利要求34的方法，其中所述器官是胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、脊髓或受擠壓的肢體中的一個或多個。
36.權利要求28-33中任一項的方法，其中所述缺血/再灌注是胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、脊髓或受擠壓的肢體中的一個或多個的缺血/再灌注。
37.一種治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的方法，所述方法包括給所述受試者施用有效地減小膿毒癥的生理作用的量的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
38.權利要求37的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
39.權利要求37的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
40.權利要求37-39中任一項的方法，其中膿毒癥的生理作用是血清TNF-α水平的升高或血清IL-6水平的升高。
41.權利要求37-39中任一項的方法，其中膿毒癥的生理作用是休克。
42.權利要求37-41中任一項的方法，其中所述rhMFG-E8施用減弱全身性炎癥。
43.一種治療受試者的肺損傷的方法，包括給所述受試者施用有效地治療肺損傷的量的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
44.權利要求43的方法，其中所述肺損傷是急性肺損傷。
45.權利要求43或44的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
46.權利要求43或44的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)相同的氨基酸序列。
47.一種制備用于預防和/或治療受試者的缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
48.一種制備用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地減輕膿毒癥的生理作用的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
49.一種制備用于治療受試者的肺損傷的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地治療肺損傷的量在藥物組合物中配制重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
50.權利要求47-49中任一項的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
51.權利要求47-49中任一項的方法，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
52.一種藥物組合物，其包含以用于預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)和藥學上可接受的載體，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
53.一種藥物組合物，其包含以用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8)和藥學上可接受的載體，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
54.一種藥物組合物，其包含以用于治療肺損傷的劑型存在的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhM FG-E8)和藥學上可接受的載體，其中所述rhMFG_E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
55.一種藥品，其包括于藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhMFG-E8);和提供關于施用rhMFG_E8以預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷的說明的包裝說明書，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG_E8是非糖基化的。
56.一種藥品，其包括于藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8);和提供關于施用rhMFG_E8以治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者的說明的包裝說明書，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
57.一種藥品，其包括于藥學上可接受的載體中配制的重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII (rhM FG-E8);和提供關于施用rhMFG_E8以治療肺損傷的說明的包裝說明書，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
58.權利要求52-54中任一項的藥物組合物或權利要求55-57中任一項的藥品，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
59.權利要求52-54中任一項的藥物組合物或權利要求55-57中任一項的藥品，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
60.重組人乳脂球表皮生長因子-因子VIII(rhMFG-E8)用于制備藥劑的用途，所述藥劑用于預防和/或治療缺血/再灌注后炎癥和/或器官損傷，或用于治療患有膿毒癥的受試者或處于發生膿毒癥的風險中的受試者，或用于治療肺損傷，其中所述rhMFG-E8具有與人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
【文檔編號】A61K38/18GK103987401SQ201280028451
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年4月27日 優先權日:2011年4月28日
【發明者】王平 申請人:范斯坦醫藥研究院