低過敏原的制作方法

低過敏原的制作方法
【專利摘要】本發明提供了用作低過敏原的突變體多肽。更具體地，本發明提供了突變體Bet?v1蛋白和此類多肽用作用于使樺樹花粉過敏癥脫敏的低過敏原的用途。此外，本發明提供了包含此類多肽的疫苗制劑；此類制劑的用途；以及抵抗樺樹花粉過敏癥而進行免疫接種的方法。
【專利說明】低過敏原
發明領域
[0001]本發明涉及可用作低過敏原的突變體多肽。更具體地，本發明涉及特定的突變體Bet vl多肽以及此類多肽作為用于使樺樹花粉過敏脫敏的低過敏原的用途。此外，本發明涉及包含此類多肽的疫苗制劑；此類制劑在免疫接種中的用途；以及抵抗樺樹花粉過敏而進行免疫接種的方法。
[0002]發明背景 [0003]過敏是由對通常無害的蛋白質、過敏原的免疫反應引起的。過敏性疾病在世界范圍內正在達到流行病的比例。工業化國家超過25%的人口患有I型過敏并且數量正在穩定增加。樺樹花粉過敏是I型過敏的非常常見的形式。Bet vl是樺樹花粉的主要過敏原。更多關于Bet vl過敏原、其異構過敏原和變體的信息,見于WHO網站www.allergen, org。
[0004]I型過敏基于免疫球蛋白E(IgE)抗體的形成。當過敏原分子結合兩個結合至肥大細胞或嗜堿細胞表面上的受體的IgE抗體并且誘導IgE-Fc ε RI復合物的交聯時，癥狀發生。這觸發了生物介質(例如組胺和引起炎癥反應和癥狀(例如過敏性哮喘、鼻炎、食物和皮膚過敏以及甚至過敏性反應)的脂質介質)的脫粒。
[0005]IgE是由兩個相同的輕鏈和重鏈組成的大分子。在IgE的重鏈中存在5個結構域:VH、C ε 1、C ε 2、C ε 3和C ε 4。完整IgE分子的大小為約200kDa。結合至其Fe ε RI受體的C ε 2-C ε 4片段以及C ε 2-C ε 4片段的晶體結構已被測定(Garman等人，Nature2000 (406): 259-266，和 Wan 等人，Nature Immunology, 2002 (3): 681-686)。
[0006]最近幾年，已測定了大量不同過敏原的三維結構。在結構上，這些過敏原變化相當大，并且還未鑒定出可解釋過敏原引起IgE抗體產生的能力的共同結構基序。然而，有研究表明過敏原性僅限于少數蛋白質家族，因而提出蛋白質的結構特征也可在過敏原性方面起作用的證據(Jenkins 等人，J Allergy Clin.1mmunol.2005 (115): 163-17O; Raudauer 等人，J Allergy Clin Immunol.2008 (121): 847-852; Rouvinen 等人，PloS0NE2010(5):e9037)。
[0007]當研究過敏原性時關鍵的問題包括所謂的B細胞表位、過敏原的IgE抗體結合位點。然而，不幸地，該B細胞表位不能直接從過敏原的三維結構推導出來。此外，在被個體患者的IgE識別的確定的過敏原的表位中存在差異。因此，通過使用各種技術和各種基礎，例如通過分析與來自過敏癥患者的多克隆IgE血清混合物反應的過敏原性片段或肽、過敏原的定向誘變、使用表位模擬物(模擬位)和生物信息學建模研究來搜尋B細胞表位。然而，迄今，還不存在任何過敏原的優勢表位的一般性圖譜。
[0008]關于樺樹花粉，例如，Holm等人(The Journal ofImmunology2004(173):5258-5267)產生了包含4和9個點突變體的Bet vl突變體，其目的在于操作“選擇的區域”中的表面拓撲學。此論文未描述該“選擇”是如何作出的。具有4個氨基酸置換的突變體代表分子表面上的3個不同區域，而具有9個氨基酸置換的突變體代表分子表面上5個不同的區域。這些Bet vl突變體在一些情況下具有減弱的結合人血清IgE和觸發人嗜堿細胞組胺釋放的能力。它們還能夠誘導抗未突變的Bet vl的IgG抗體。
[0009]其它經修飾的重組過敏原也已被報導:
[0010]國際專利公布W002/40676和W003/096869公開了樺樹花粉過敏原Bet vl的許多突變體形式。這些突變體是通過基于對Bet vl多肽的保守表面結構的序列分析、在推定的IgE結合位點引入隨機突變體而產生的。W003/096869公開了使用過敏原表面上的不同“小組(small group) ”上的4個主要突變。 [0011]國際專利公布W02007/073907公開了在氨基酸位置54、115或123處包含3個氨基酸置換或缺失的Bet vl多肽。沒有證據顯示這些突變體具有降低的組胺釋放能力。
[0012]國際專利公布W02009/024208公開了在氨基酸100-125的區域中具有至少4個突變的Bet vl突變體。然而，由于這些突變，多肽的三維結構喪失了，并且沒有經報導的組胺釋放活性。
[0013]國際專利公布W02008/092992公開了通過修飾非連續致敏性表位(即致敏性物質上具有600-900 A的區域的扁平表面)上的氨基酸殘基來阻斷致敏性物質的I型表面相互作用的方法，并且提示可相應地制備低過敏原性樺樹花粉蛋白。
[0014]Niemi 等人，Structure2007 (15): 1413-21，公開了一 個與 Laver 等人，Celll990(61):553-556的公開內容一致的搜索特定過敏原表位的方法，其聲稱用于測定任何過敏原的完整表位的唯一合理方法包括測量與IgE抗體復合的過敏原的晶體結構。Niemi等人公開了與β乳球蛋白(BLG)復合的IgE Fab片段的晶體結構。他們還顯示了兩個IgE/Fab分子是如何結合二聚體BLG的以及當與已知IgG表位結構相比較時IgE表位是不同的，其是位于β折疊區中的“扁平”表面。
[0015]Rouvinen等人，PloS 0ΝΕ2010 (5): e9037使用與天然質譜法組合的生物信息學方法研究了過敏原的二聚體結構的作用。(電噴霧傅里葉變換離子回旋共振質譜，ESIFT-1CR-MS)。對55個已知的過敏原晶體結構的ES1-MS測量顯示其80%以對稱二聚體或寡聚體存在于晶體中并且大部分是在高蛋白質濃度下形成的瞬時二聚體。利用主要作為二聚體存在的來自牛奶的重組過敏原β乳球蛋白(rBos d5B)和主要作為單體存在的其突變體H146P研究了二聚體結構與過敏原性之間可能的關系。當與天然Bos d5B和重組Bos d5B相比較時，對于單體rBos d5B突變體H146P觀察到在某種程度上降低的組胺釋放能力。盡管作者得出二聚化對于過敏原可以是非常常見且基本的特征并且一般性地提示了過敏原的純單體變體的制備可打開特異性免疫療法的新的可能性，但結構特征在過敏原性中的最終作用仍然未知。根據體外晶體分析不能得出關于過敏原分子如何在人體中即體內表現的直接結論。
[0016]如今，治療所有過敏性癥狀的趨勢是朝向利用過敏原-特異性脫敏作用主動誘導耐受性而非避免過敏原，所述避免過敏原通常是不可能的或僅僅治療癥狀。目前的脫敏療法基于從天然來源純化的過敏原，其中批次間變化可導致與發現和維持治療的正確劑量和效率相關的問題。這些問題可導致過敏性副作用和對新過敏原的致敏作用的潛在風險。
[0017]重組過敏原用于脫敏的用途將消除與批次間變化相關的不利方面，并且最早的重組過敏原處于臨床試驗中(Valenta等人，Annu Rev Immunol2010 (28): 211-41)。此類過敏原在臨床中的效率從而仍待觀察。
[0018]存在對安全高效的疫苗和治療產品的公認和巨大的需要，以應對日益增加的過敏的醫療問題。目前，對過敏的安全高效的療法的市場開發不足。
[0019]發明概述
[0020]本發明涉及基于SEQ ID NO:3中所示的野生型氨基酸序列模板或其任何其它Betvl野生型同種型的重組低過敏原性樺樹花粉Bet vl多肽，所述多肽天然地或通過突變包含: [0021](I)在選自氨基酸殘基E101、K80、N82、S84、S99、SI 17和Kl 19的位置上的至少一
個第一氨基酸置換，和
[0022](2)在選自氨基酸殘基吧8、025、財3、646、財7和￥158的位置上的至少一個第二
氨基酸置換。
[0023]本發明還涉及上文中定義的用作用于對樺樹花粉脫敏的疫苗的低過敏原性多肽。
[0024]本發明還涉及包含至少一種上文中定義的低過敏原性多肽和至少一種藥學上可接受的佐劑的疫苗組合物。在本發明的一個實施方案中，所述疫苗用于舌下施用。
[0025]本發明還涉及抵抗樺樹花粉過敏而進行免疫接種的方法，所述方法包括以有效地誘導脫敏和誘導產生抗樺樹花粉的保護性抗體的量，給患有樺樹花粉過敏癥的受試者施用上文中定義的低過敏原性多肽或疫苗組合物。
[0026]當與Bet Vl野生型的組胺釋放能力相比較時，根據本發明的低過敏原性多肽具有降低至少20倍的組胺釋放能力。在一個實施方案中，所述多肽具有降低至少100倍的組胺釋放能力。
[0027]附圖概述
[0028]在下文中，參考附圖，通過優選實施方案更詳細地描述本發明，其中
[0029]圖1舉例說明Bet vl的推定的IgE表位殘基(紅色的殘基)和參與在實施例1中衍生的Bet vl的二聚化的推定的殘基(紫色的殘基)；
[0030]圖2是用于產生重組過敏原的細菌表達單位的示意圖,其中Ptac是啟動子，PelB是連接于重組過敏原的編碼區的信號序列，星號顯示氨基酸置換位點；
[0031]圖3是Bet vl的36個同種型的氨基酸序列比對；
[0032]圖4顯示實施例2中使用的Bet vl野生型多肽(A, SEQ ID NO:1)和N28K-E101K多肽(B, SEQ ID NO:2)的核酸序列；
[0033]圖5顯示重組Bet vl和Bet vlN28K_E101K多肽對血清IgE與Bet vl結合的競爭性抑制；和
[0034]圖6顯示用重組Bet vl和Bet vlN28K_E101K多肽進行的組胺釋放實驗的結果；
[0035]圖7顯示濃度為3 μ M的重組Bet vl野生型和重組Bet vl突變體N28K-E101K的天然ESI FT-1CR質譜。
[0036]發明詳述
[0037]在下列描述、實施例和權利要求中，三字母和單字母代碼均用于氨基酸。參見，例如，IUPAC-1UB聯合委員會關于生化名稱命名委員會.Nomenclature and Symbolism forAmino Acids and Peptides.Eur.J.Biochem.138:9-37(1984)?
[0038]如下舉例說明根據本發明的多肽中的氨基酸位點的命名:N28意指在位置28上存在天冬酰胺殘基，而N28K意指位置28上的天冬酰胺殘基已被賴氨酸殘基替代。相應地，ElOl意指在位置101上存在谷氨酸殘基，而E101K意指位置101上的谷氨酸殘基已被賴氨酸殘基替代等。
[0039]樺樹花粉過敏是過敏的非常常見的形式，白樺樹(疣皮樺(Betula verrucosa))的花粉是歐洲和北美的I型過敏反應的主要原因之一。據估計約10-15%的人口可患有樺樹花粉過敏。此外，其它過敏原(例如蘋果過敏原)與樺樹花粉特異性IgE交叉反應，從而即使當受試者未經受花粉時亦引起過敏反應。 [0040]Bet vl是樺樹花粉的主要過敏原,其在超過95%的樺樹花粉過敏性受試者中負責IgE結合。Bet vl是具有17kD的分子量的蛋白質。野生型Bet vl的氨基酸序列示于SEQID NO: 3中。WHO過敏原網站(www.allergen, org)列出了 Bet vl的三十六個(36)同種型，圖3顯示了所述同種型的序列比對。此比對顯示出Bet vl是高度保守的。在本發明中用作野生型Bet vl的同種型模板來自同種型Bet via (Bet vl.0101),但這些異構過敏原中的任一種均在適當時可用于提供根據本發明的低過敏原性多肽變體。
[0041]全部36個Bet vl同種型的氨基酸序列如下分別地公開于序列表中:1.0101 (SEQID NO:3)、1.0102(SEQ ID NO:4)、1.0103(SEQ ID NO:5)、1.2501 (SEQ ID Ν0:6)、1.1501 (SEQID NO:7)、1.1502 (SEQ ID NO:8)、1.2801 (SEQ ID N0:9)、1.3001 (SEQ ID NO:10),1.2901 (SEQ ID NO: 11)、1.2301 (SEQ ID NO: 12)、1.0501 (SEQ ID NO: 13)、1.0601 (SEQID NO:14)、1.0602(SEQ ID NO:15)、1.0801 (SEQ ID NO:16)、1.1701(SEQ ID NO:17),1.0401 (SEQ ID NO: 18)、1.0402 (SEQ ID NO: 19)、1.0701 (SEQ ID NO: 20)、1.1001 (SEQID NO: 21)、1.2401 (SEQ ID NO: 22)、1.2601 (SEQ ID NO: 23)、1.2701 (SEQ ID NO: 24)、1.2201 (SEQ ID NO: 25)、1.0201 (SEQ ID NO: 26)、1.0901 (SEQ ID NO: 27)、1.0301 (SEQID NO:28)、1.1401(SEQ ID NO:29)、1.1402(SEQ ID NO:30)、1.1901(SEQ ID N0:31)、1.2001 (SEQ ID NO:32)、1.1801(SEQ ID NO:33)、1.1101(SEQ ID NO:34)、1.1201(SEQ IDNO:35),1.1601(SEQ ID NO:36)、1.2101(SEQ ID NO:37)和 1.1301(SEQ ID NO:38)。
[0042]Bet vl的同種型包括具有不同的致敏性潛能的變體。Bet vl的同種型與SEQ IDN0:3的Bet vl野生型氨基酸序列具有至少94%的同一性。例如，與Bet vl.0101具有96%的氨基酸殘基同一性的同種型Bet vl.0401和與Bet vl.0101具有至少94%的殘基同一性的Bet vl.1001已被鑒定為天然低過敏原，因為它們是介質釋放的弱誘導物。與Bet vl.0101相比較，Bet vl.1001包含例如N28K突變。它們也已被認為達到代表出色疫苗候選者的標準。(Wagner 等人，J.Allergy Clin Immunol2008; 121:725-735)。然而,科學、實驗或臨床數據是不可獲得的。
[0043]本發明提供了 Bet Vl的突變的低過敏原性變體，其可用作疫苗用于免疫接種有此需要的受試者，從而預防和/或減輕過敏和使患有樺樹花粉過敏的受試者脫敏。
[0044]根據本發明的重組樺樹花粉Bet Vl多肽具有野生型氨基酸序列，但它們在所選的氨基酸位置上包含突變以減弱或完全消除它們誘導IgE產生的能力，但保留它們誘導保護性IgG抗體產生的能力，即，它們是低免疫原性的。
[0045]具體地，本發明涉及基于如SEQ ID NO:3中所示的野生型氨基酸序列模板或其任何其它Bet vl野生型同種型的氨基酸序列的重組低過敏原性樺樹花粉Bet vl多肽，所述多肽天然地或通過突變包含:
[0046](I)在選自氨基酸殘基E101、K80、N82、S84、S99、SI 17和Kl 19的位置上包含至少
一個第一氨基酸置換，和[0047](2)在選自氨基酸殘基吧8、025、財3、646、財7和￥158的位置上包含至少一個第
二氨基酸置換。
[0048]在一個實施方案中，本發明的多肽具有如SEQ ID NO:3中所示的野生型氨基酸序列的模板。在另一個實施方案中，本發明的多肽具有選自SEQ ID NO:4-38的野生型氨基酸序列的模板。
[0049]在本發明的一個實施方案中，重組低過敏原性樺樹花粉Bet vl多肽由SEQ IDNO:39中所示的氨基酸序列代表。SEQ ID NO:39公開了具有用于氨基酸置換的位置(氨基酸位置 25、28、43、46、47、80、82、84、99、101、117、119、158)的 Bet vl 多肽序列，并且還公開了這些位點上的野生型氨基酸。 [0050]在任何所示的位置處的第一和第二置換的任何組合產生低過敏原性多肽。在本發明的一個實施方案中，所述多肽包含選自SEQ ID N0:41-47的氨基酸序列或其同種型，和至少一個在選自氨基酸殘基N28、D25、N43、G46、N47和Y158的位置上的第二氨基酸置換。優選地，所述多肽具有選自SEQ ID N0:41-47的氨基酸序列或其同種型，和至少一個在選自氨基酸殘基吧8、025、財3、646、財7和￥158的位置上的第二氨基酸置換。在本發明的另一個實施方案中，所述多肽包含選自SEQ ID NO:41 (其中氨基酸101是K)、SEQ ID NO:42 (其中氨基酸80是Y)、SEQ ID NO:43 (其中氨基酸82是K)、SEQ ID NO:44 (其中氨基酸84是K)、SEQ ID NO:45 (其中氨基酸 99 是 K)、SEQ ID NO:46 (其中氨基酸 117 是 K)和 SEQ IDNO:47 (其中氨基酸119是E)的氨基酸序列；和至少一個在選自氨基酸殘基N28、D25、N43、G46，N47和Y158的位置上的第二氨基酸置換。優選地，所述多肽具有選自SEQ ID NO:41(其中氨基酸101是K)、SEQ ID NO:42 (其中氨基酸80是Y)、SEQ ID NO:43 (其中氨基酸82 是 K)、SEQ ID NO:44 (其中氨基酸 84 是 K)、SEQ ID NO:45 (其中氨基酸 99 是 K)、SEQID NO:46 (其中氨基酸117是K)和SEQ ID NO:47 (其中氨基酸119是E)的氨基酸序列；和至少一個在選自氨基酸殘基N28、D25、N43、G46、N47和Y158的位置上的第二氨基酸置換。SEQ ID N0:41公開了 Bet vl多肽序列，其中位置101上的氨基酸是置換而非野生型氨基酸E0類似地SEQ ID NO:42-47顯示了 Bet vl多肽，其中位置80、82、84、99、117和119上的氨基酸分別是置換而非野生型氨基酸。
[0051 ] 在本發明的一個實施方案中，所述至少一個第一氨基酸置換位于選自氨基酸殘基ElOl和S99的位置上,并且所述至少一個第二氨基酸置換位于選自氨基酸置換N28和D25的位置。
[0052]在本發明的另一個優選的實施方案中，所述至少一個第一氨基酸置換位于位置ElOl上，并且所述至少一個第二氨基酸置換位于位置N28上。在本發明的一個優選實施方案中，重組低過敏原性樺樹花粉Bet vl多肽由SEQ ID N0:40中所示的氨基酸序列表示。SEQ ID NO:40顯示在位置28和101上具有置換的Bet vl多肽序列，這些位置上的氨基酸是賴氨酸⑷。
[0053]本發明的低過敏原性多肽變體還包含含有超過一個第一和第二置換的變體。術語“至少一個第一置換”和“至少一個第二置換”意指所述第一和第二置換可各自包含1、2、3或4或更多個置換，并且第一和第二置換的任何組合都是可能的，只要低過敏原性Bet vl多肽誘導保護性抗體反應的能力保留。因此在本發明的一個優選實施方案中，第一氨基酸置換在位置ElOl上包含置換,并且所述第二氨基酸置換在位置N28和D25上或位置N28、D25和Y158上。在本發明的另一個優選實施方案中，第一氨基酸置換在位置ElOl和S99上包含置換，并且所述第二氨基酸置換在位置N28上。在本發明的另一個優選實施方案中，所述第一氨基酸置換在位置ElOl和S99上，并且所述第二氨基酸置換在位置N28和D25上。
[0054]在本發明的其它優選實施方案中，Bet vl的置換是至少ElOl和N28、E101和D25、ElOl 和 N43、ElOl 和 G46、ElOl 和 N47、ElOl 和 Y158、K80 和 N28、K80 和 D25、K80 和 N43、K80 和 G46、K80 和 N47、K80 和 Y158、N82 和 N28.N82 和 D25、N82 和 N43、N82 和 G46、N82 和N47、N82 和 Y158、S84 和 N28、S84 和 D25、S84 和 N43、S84 和 G46、S84 和 N47、S84 和 Y158、S99 和 N28、S99 和 D25、S99 和 N43、S99 和 G46、S99 和 N47、S99 和 Y158、SI 17 和 N28、SI 17和 D25、S117 和 N43、S117 和 G46、S117 和 N47、S117 和 Y158、K119 和 Ν28、Κ119 和 D25、K119和N43、K119和G46、K119和N47或K119和Y158。在本發明的其它優選實施方案中，所述置換是這些組合之一。 [0055]在本發明的一個優選的實施方案中，總共存在至少2、3或4個氨基酸置換。優選地，本發明的多肽具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個置換。更優選地，所述多肽具有2、3或4個置換。本發明的優勢之一是僅需要少數置換(至少2個)用于所需的效果。
[0056]根據本發明的多肽是低過敏原性的，并且當與相應的未突變的Bet vl野生型的組胺釋放能力相比較時顯示降低至少20倍，優選100倍的組胺釋放能力。
[0057]根據本發明的低過敏原性多肽可用作抗過敏特別是樺樹花粉過敏的疫苗。按照本領域技術人員已知的標準制藥方案配制包含根據本發明的多肽的疫苗。根據本發明的疫苗特別適合于舌下施用。根據本發明的低過敏原性變體是通過突變位于Bet vl的表位表面上的所選特定氨基酸殘基(例如具有大側鏈的殘基)而獲得的。所選的氨基酸殘基是其側鏈向外指向溶劑的那些氨基酸殘基。突變此類殘基引起過敏原的基本三維結構的最小改變。然而，優選地，誘變修飾表位表面的程度使得肥大細胞表面上的IgE抗體的結合和交聯被阻止或強烈減少，然而變體的總體結構仍然與野生型過敏原的總體結構十分相似。此類突變有利于對IgG和具有結合野生型過敏原和突變的變體過敏原的能力的其它保護性抗體的誘導。突變的作用被確定為過敏原特異性IgE抗體對經修飾的Bet vl過敏原的更低親和力。優選地，突變使特異性IgE抗體的親和力減小至少20倍，更優選20-100倍，最優選超過100倍。所產生的經修飾的Bet vl過敏原可用于誘發過敏性患者對樺樹花粉的耐受性。
[0058]可用于過敏原特異性脫敏的根據本發明的低過敏原性變體多肽具有兩個特征:1)強力減弱IgE介導的反應的能力；和2)保持的野生型3D折疊，從而保持誘導產生能夠結合野生型過敏原的IgG抗體的能力。
[0059]IgE結合表位的結構的知識將極大地簡化如上文中提及的低過敏原性變體的設計。然而，與IgE抗體復合的Bet vl的結構不幸地是不可獲得的。被個體患者的IgE識別的確定的過敏原的表位中存在多少差異還是未知的。在表位掃描中使用肽也是不可靠的并且實際上僅當掃描線性表位時才有用(Niemi等人，Structure2007 (15): 1413-21)。單個肽的構象以及物理性質(例如溶解度)可與形成天然蛋白質結構的多肽鏈的相應部分的構象以及物理性質顯著不同。因此，突變體Bet vl過敏原的設計是基于使用分子圖形學程序(例如PyMOL)的分子表面分析，以通過制備和測試突變體來闡明表位的結構和測試潛在命中。此外，在設計中考慮了 Bet vl的二聚化的能力。[0060]Bet vl (蛋白質數據庫代碼1BV1)的晶體結構被用于定義Bet vl的四級結構。TOBePISA互聯網服務器被用于創建Bet vl的對稱二聚體的坐標。據估計肥大細胞表面上的簇中IgE抗體之間的距離為約5nm(KnoI, EF ;Mol.Nutr.Res.50 (2006):620)。通過研究距離對稱軸2.5nm內的圍繞二重對稱軸的Bet vl 二聚體的分子表面，在Bet vl的分子表面(圖1)上鑒定了兩個推定的表位。
[0061]推定的表位由氨基酸殘基V2-E6 ；R70-D75 ;N78_S84 ;E96_K103 和 K115-H121構成，而Bet vl 二聚體的單體-單體界面由氨基酸殘基K20-K32、S39-P50、V74-H76和D156-N159 構成。 [0062]仔細分析了這些推定的表位，以鑒定可作為突變點的氨基酸殘基。優選的突變點應當具有減小過敏原對IgE抗體的結合但仍然維持野生型過敏原的三維結構的能力。假定的表位包括氨基酸殘基K80、N82、S84、S99、E101、S117和Kl 19。單體-單體界面包括殘基D25、N28、N43、G46、N47和Y158。殘基ElOl和N28被認為是最有趣的突變點，因為它們分別位于假定表位的中心和單體-單體界面上的策略性位置中。在本發明中，第一氨基酸置換存在于表位區域中并且第二氨基酸置換存在于單體-單體界面中。
[0063]這兩個殘基在Bet vl的全部36個同種型中高度保守。無天然變異存在于殘基101中。天然變異見于殘基28，其以天冬酰胺(在31個同種型中)、賴氨酸(在2個同種型中)或酪氨酸(在3個同種型中)存在。殘基D25、N43、G46、N47、K80、S84、K119和Y158是保守的，而殘基N82、S99和S117略有變化，如圖3中顯示的。
[0064]下一步驟是選擇對于每一個殘基的適當突變。作為實例，S99是小的親水性和中性氨基酸殘基。將干擾IgE結合的突變從而將具有“相反的”性質，即大的和/或帶電荷的，例如Ser至Lys、Arg、Asp、Tyr和Val。類似地，ElOl和N28可被帶相反電荷的殘基(Lys>Arg)或疏水性殘基(Tyr、Ile或Trp)替代。可相應地設計殘基D25、N43、G46、N47、K80、N82、S84、S117和K119處的置換。表1列出了潛在的置換，所述置換可產生SEQ ID NO: 39中所示的根據本發明的Bet vl低過敏原性突變體。
[0065]表1.Bet vl的突變體
[0066]表位突變體
[0067]
【權利要求】
1.一種重組低過敏原性樺樹花粉Bet Vl多肽，其基于SEQ ID N0:3中所示的野生型氨基酸序列模板或其任何其它Bet Vl野生型同種型的氨基酸序列，所述多肽天然地或通過突變包含: (1)至少一個在選自氨基酸殘基E101、K80、N82、S84、S99、SI17和Kl 19的位置上的第一氨基酸置換，和 (2)至少一個在選自氨基酸殘基吧8、025、財3、646、財7和Y158的位置上的第二氨基酸置換。
2.權利要求1的多肽，其中所述野生型氨基酸序列的模板是如SEQID N0:3中所示的。
3.權利要求1或2的多肽，其中所述多肽具有SEQID NO:39中所示的氨基酸序列。
4.權利要求1的多肽，其中所野生型氨基酸序列的模板選自SEQID NO:4-38.
5.權利要求1-4中任一項的多肽或其同種型，其中所述多肽包含選自SEQIDNO: 41-47的氨基 酸序列和至少一個在選自氨基酸殘基N28，D25, N43, G46, N47和Y158的位置上的第二氨基酸置換。
6.權利要求1-5中任一項的多肽,其中所述多肽包含 選自下述的氨基酸序列: SEQ ID N0:41，其中氨基酸101是K， SEQ ID NO:42，其中氨基酸80是Y， SEQ ID NO:43，其中氨基酸82是K， SEQ ID NO:44，其中氨基酸84是K， SEQ ID NO:45，其中氨基酸99是K， SEQ ID N0:46，其中氨基酸117是K，和 SEQ ID NO:47，其中氨基酸119是E ; 和至少一個在選自氨基酸殘基N28、D25、N43、G46、N47和Y158的位置上的第二氨基酸置換。
7.權利要求1-6中任一項的多肽，其所述至少一個第一氨基酸置換在選自氨基酸殘基ElOl和S99的位置上，并且所述至少一個第二氨基酸置換在選自氨基酸殘基N28和D25的位置上。
8.權利要求1-7中任一項的多肽，其中所述至少一個第一氨基酸置換在位置ElOl上，并且所述至少一個第二氨基酸置換在位置N28上。
9.權利要求8的多肽，其中所述多肽具有SEQID NO:40中所示的氨基酸序列。
10.權利要求1-9中任一項的多肽，與野生型BetVl的組胺釋放能力相比，其具有降低至少20倍的組胺釋放能力。
11.權利要求10的多肽，與野生型BetVl的組胺釋放能力相比，其具有降低至少100倍的組胺釋放能力。
12.前述權利要求中任一項的多肽，其中總共有至少2、3或4個氨基酸置換。
13.一種疫苗組合物,其包含至少一種權利要求1-12中任一項的低過敏原性多肽和藥學上可接受的稀釋劑或佐劑。
14.權利要求13的疫苗組合物，其中所述疫苗用于舌下施用。
15.一種重組樺樹花粉Bet Vl多肽，其基于SEQ ID NO: 3中所示的野生型氨基酸序列模板或其任何其它Bet vl野生型同種型的氨基酸序列，所述多肽天然地或通過突變包含:(1)至少一個在選自氨基酸殘基E101、K80、N82、S84、S99、SI17和Kl 19的位置上的第一氨基酸置換，和 (2)至少一個在選自氨基酸殘基吧8、025、財3、646、財7和￥158的位置上的第二氨基酸置換， 以用作疫苗。
16.一種抵抗樺樹花粉過敏而進行免疫接種的方法，所述方法包括以有效地對樺樹花粉脫敏和誘導產生抵抗樺樹花粉的保護性抗體的量，給患有樺樹花粉過敏癥的受試者施用權利要求1-14中任一項的低過敏原性多肽或疫苗組合物。
【文檔編號】A61K39/36GK103649315SQ201280026275
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年4月18日 優先權日:2011年4月18日
【發明者】K·塔金納恩, M-L·盧卡南, H·索德倫德, S·于爾海, H·霍爾克里, M·尼米南, J·詹妮絲, J·盧維南 申請人:國家技術研究中心Vtt