包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂質體及其用途

包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂質體及其用途
【專利摘要】本發明提供以TS為靶的shRNA的體內遞送方法。一種抗腫瘤藥，其中包含通過RNAi作用可以抑制胸苷酸合成酶的表達的短發夾RNA(shRNA)和PEG修飾陽離子性脂質體，其中，該shRNA結合在該PEG修飾陽離子性脂質體的表面，并且在3’末端至少具有由2個核苷酸組成的突出端。
【專利說明】包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂質體及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及以包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂質體作為有效成分的抗腫瘤藥及其用途、特別是其與化療藥聯合使用的用途。
【背景技術】
[0002]近年來，引起RNA干擾(以下記作“RNAi”)的RNAi分子作為用于治療腫瘤等的有用工具而受到關注，人們正在開發可以抑制腫瘤增殖的各種RNAi分子。本發明人以前報道過以參與DNA合成的胸苷酸合成酶(以下記作“TS”)為靶的RNAi分子，據報道，該RNAi分子通過顯著抑制TS的表達而具有抗腫瘤效果；另外，其還增強5-FU類抗腫瘤藥(特別是替加氟.吉美嘧啶.奧替拉西鉀復方藥)的抗腫瘤效果(專利文獻I)。
[0003]但是，通常RNAi分子通過體內給藥而迅速被分解。因此，向腫瘤遞送足夠量的RNAi分子是極其困難的。
[0004]為了解決該課題，目前，正在開發各種RNAi分子的遞送方法。例如，可以列舉:將編碼RNAi分子(特別是具有短發夾結構的RNAi分子(shRNA))的DNA插入到適當的載體中，給予該載體的方法(專利文獻I)。但是，在該方法中，必須將該載體直接注入到腫瘤內來進行給藥，考慮到臨床應用，希望有更容易的給藥方法(例如，靜脈內給藥等)。另外，正在開發使用由RNAi分子和脂質體組成的復合體(Iipoplex)將RNAi分子遞送到腫瘤細胞中的方法(非專利文獻1-3)。但是，在上述Iipoplex的重復給藥時，由于被給藥的生物體內的免疫系統的作用，Iipoplex快速被排除，出現無法得到充分的效果、而且產生嚴重的副作用等問題。
[0005]因此，在該領域中，依然迫切希望有一種通過體內給藥將RNAi分子有效率地遞送到腫瘤中的方法。
[0006]現有技術文獻 專利文獻
專利文獻 1:W02010/113844 ；
非專利文獻
非專利文獻 I:Qixin Leng 等人，Drug Future.2009 September ；34 (9):721 ；
非專利文獻2:Sherry Y.Wu等人，The AAPS Journal,第 11 卷，N0.4,Decmber 2009 ； 非專利文獻 3:B.0zpolat 等人，Journal of Internal Medicine 267 ;44_53 2009。

【發明內容】

[0007]發明所要解決的課題
本發明的目的在于: 提供一種以TS為靶的ShRNA的簡易且有效率的體內遞送方法。
[0008]解決課題的方法
本發明人為了解決上述課題反復進行了深入研究，結果發現:通過使可以抑制TS的表達的ShRNA以靜電方式結合在進行了 PEG修飾的陽離子性脂質體表面，可以簡易地將ShRNA遞送到癌細胞中。另外還發現:通過將結合有shRNA的進行了 PEG修飾的陽離子性脂質體與化療藥、特別是5-FU類抗腫瘤藥聯合使用，可以提高對癌細胞的靶向性，可以顯著增強其在癌細胞中的效果。進一步發現:通過將結合有shRNA的進行了 PEG修飾的陽離子性脂質體與具有TS抑制作用的化療藥(例如5-FU類抗腫瘤藥或培美曲塞鈉水合物)聯合使用，可以提高癌細胞的對該化療藥的敏感性，可以增強抗腫瘤效果。本發明基于上述認知。
[0009]即，本發明如下。
[0010][1]抗腫瘤藥，其包含通過RNA1作用可以抑制胸苷酸合成酶的表達的短發夾RNA (shRNA)和PEG修飾陽離子性脂質體，其中，該shRNA結合在該PEG修飾陽離子性脂質體的表面，并且在3’末端至少具有由2個核苷酸組成的突出端。
[0011][2] [1]的抗腫瘤藥，其中，ShRNA包含由SEQ 1D NO:1所表示的核苷酸序列組成的有義鏈和與該有義鏈在嚴格條件下雜交的反義鏈。
[0012][3] [1]或[2]的抗腫瘤藥，其中，shRNA包含由SEQ 1D NO:1所表示的核苷酸序列組成的有義鏈和由SEQ 1D NO: 2所表示的核苷酸序列組成的反義鏈。
[0013][4] [1]~[3]中任一項所述的抗腫瘤藥，其中，shRNA由SEQ 1D NO: 8所表示的核苷酸序列組成。
[0014][5] [1]~[4]中任一項所述的抗腫瘤藥，其中，PEG修飾陽離子性脂質體包括由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕櫚酰油酰甘油磷酰膽堿(POPC)、膽固醇(CHOL)和0，0’_雙十四酰基-Ν-(σ-三甲基銨基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)構成的陽離子性脂質體。
[0015][6] [5]的抗腫瘤藥，其中，以3:2:3:2的摩爾比包含DOPE、POPC、CHOL和DC-6-14。
[0016][7] [1]~[6]中任一項所述的抗腫瘤藥，其中，抗腫瘤藥的粒徑為200~300nm。
[0017][8] [1]~[7]中任一項所述的抗腫瘤藥，進一步地，可以抑制選自參與腫瘤細胞增殖的基因的基因表達的s1RNA或shRNA結合在PEG修飾陽離子性脂質體的表面。
[0018][9] [8]的抗腫瘤藥，其中，參與腫瘤細胞增殖的基因是選自編碼VEGF、EGFR、roGF、HGF、W1nt、Bcl-2、存活素、核苷酸還原酶、DNA聚合酶的基因中的一種或多種基因。
[0019][10] [1]~[9]中任一項所述的抗腫瘤藥，該抗腫瘤藥與用于治療腫瘤的化療藥聯合使用。
[0020][11]組合物，該組合物包含[1]~[10]中任一項所述的抗腫瘤藥和用于治療腫
瘤的化療藥。
[0021][12] [10]的抗腫瘤藥和[11]的組合物，其中，用于治療腫瘤的化療藥為具有TS抑制作用的抗腫瘤藥。
[0022][13] [12]的抗腫瘤藥或組合物，其中，具有TS抑制作用的抗腫瘤藥為5-FU類抗腫瘤藥或培美曲塞鈉水合物。
[0023][14] [13]的抗腫瘤藥或組合物，其中，5-FU類抗腫瘤藥為替加氟.吉美嘧啶.奧替拉西鉀復方藥。
[0024]本說明書包含作為本申請的優先權基礎的日本國專利申請2011-114946號的說明書和/或附圖中記載的內容。
[0025]發明效果本發明的以包含抗胸苷酸合成酶的shRNA分子的脂質體作為有效成分的抗腫瘤藥，其通過體內給藥可以抑制表達TS的腫瘤的增殖。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是顯示人結腸直腸癌株DLD-1 (A)和DLD_1/FU(B)中的、以TS為靶的siRNA和shRNA的TS表達抑制效果的特性圖。各泳道分別表示用下述的siRNA或shRNA進行了處理的樣品。1:未處理；2:siCont IOnM ；3:siTS InM ；4:siTS 5nM ；5:siTS IOnM ；6:shTSInM ；7:shTS 5nM ；8:shTS IOnM ；
圖2是顯示人結腸直腸癌株DLD-1中的、以TS為靶的SiRNA(A)和shRNA⑶在5-FU的存在或不存在下的TS表達抑制效果的特性圖。(C)顯示添加新的培養基96小時后的各樣品中的細胞成長抑制率(%)；
圖3是顯示人結腸直腸癌株DLD-1/FU中的、以TS為靶的siRNA (A)和shRNA⑶在5-FU的存在或不存在下的TS表達抑制效果的特性圖。(C)顯示添加新的培養基96小時后的各樣品中的細胞成長抑制率(%)；
圖4是顯示人結腸直腸癌株DLD-1帶瘤小鼠中的、以TS為靶的shRNA在S-1的存在或不存在下的腫瘤生長抑制效果(A)和體重的增減(B)的特性圖；
圖5是顯示人結腸直腸癌株DLD-1帶瘤小鼠中的、以TS為靶的shRNA在TS-1的存在或不存在下的腫瘤生長抑制效果的照片。1:對照(給與蔗糖)；2:S-l;3:TS-shRNA脂質體；4:S-l+TS-shRNA 脂質體；
圖6顯示在人惡性胸膜間皮瘤株MSTO 211 H中培美曲塞鈉水合物、以TS為靶的shRNA、或培美曲塞鈉水合物和以TS為靶的shRNA引起的細胞成長抑制率(%)隨時間的變化；
圖7是顯示在人惡性胸膜間皮瘤株MSTO 211 H帶瘤小鼠中以TS為靶的shRNA在培美曲塞鈉水合物的存在或不存在下的腫瘤生長抑制效果的特性圖。
【具體實施方式】
[0027]本發明中的可以抑制胸苷酸合成酶(以下記作“TS”)的表達的短發夾RNA(以下記作“shRNA”)通過以胸苷酸合成酶的mRNA部分為靶，可以TS特異性地發揮RNAi作用，可以顯著抑制TS的表達。這里，本發明的RNAi分子“以mRNA部分為靶”是指，下述所詳述的shRNA的反義鏈可以與靶mRNA部分在嚴格條件下雜交。
[0028]嚴格的條件可以根據按照常規方法形成雜交瘤的核酸的熔解溫度(Tm，也稱解鏈溫度)來求得。例如，作為可以維持雜交狀態的清洗條件，通常可以列舉“1XSSC、0.1%SDS、37°C”程度的條件，嚴格而言是指“0.5XSSC、0.1% SDS、42°C ”程度的條件，進一步嚴格而言是指“0.1XSSC、0.1%SDS、65°C”程度的條件。
[0029]本發明中的shRNA包含具有編碼TS的ORF的核苷酸序列或與其一部分同一的(identical)核苷酸序列的有義鏈、和與該有義鏈在嚴格條件下雜交的反義鏈。這里，“0RF的核苷酸序列或與其一部分同一的核苷酸序列”是指，將ORF的核苷酸序列中的胸腺嘧啶取代成尿11密唳來表不的核苷酸序列或與其一部分同一的核苷酸序列。
[0030]該有義鏈由15~25個核苷酸、優選19個核苷酸組成。有義鏈的核苷酸序列優選為與編碼TS的ORF的核苷酸序列同一，但實質上可以是同一、即相同的序列。即，有義鏈的核苷酸序列可以是在ORF的核苷酸序列中有I個或多個、即I~3個核苷酸、優選I~2個核苷酸、更優選I個核苷酸的取代、缺失、插入和/或添加。
[0031]該反義鏈具有可以與有義鏈在嚴格的條件下雜交的核苷酸序列。反義鏈只要可以在嚴格的條件下雜交即可，可以是具有包含I~3個核苷酸、優選I~2個核苷酸、更優選I個核苷酸的取代、缺失、插入和/或添加的錯配的反義鏈。優選反義鏈由與有義鏈完全互補的核苷酸序列組成。
[0032]有義鏈和反義鏈的核苷酸序列可以根據編碼TS的公知的核苷酸序列(GenBank:CR601528.1)來選擇。作為選擇這些核苷酸序列的方法，已知有各種方法，例如可以采用siRNA設計支持系統(Takara Bio株式會社)等。
[0033]在本發明中，作為有義鏈，可以列舉由下述核苷酸序列組成的有義鏈，但并不限于這些:5’-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3’ (SEQ ID NO:1) ;5’-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3’ (SEQ IDNO:3) ;5’-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3’(SEQ ID NO:5) ;5’_GGGUGUUU UGGAGGAGUUGTT-3’(SEQID NO:11)。
[0034]優選本發明中的shRNA 包含:有義鏈 5’ -GUAACACCAUCGAUCAUGA-3’ (SEQID NO:1)和反義鏈 5’ -UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3’ (SEQ ID NO: 2)；有義鏈5’-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3，(SEQ ID NO: 3)和反義鏈 5’-AUUCCAUAUCUCUGUAUUC(SEQID NO: 4);或有義鏈 5’ -CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3’ (SEQ ID NO: 5)和反義鏈5，-ACACUCUACAUCAUGAUCG-3，(SEQ ID NO: 6);有義鏈5，-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3，(SEQID NO: 11)和反義鏈 5’ -AACAACUCCUCCAAAACACCC-3’ (SEQ ID NO: 12)。
[0035]進一步優選，本發明中的shRNA包含由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列組成的有義鏈和由SEQ ID NO: 2所表示的核苷酸序列組成的反義鏈。
[0036]有義鏈和反義鏈經由接頭部分進行連接，通過該接頭部分形成環而折疊，該反義鏈與該有義鏈雜交，形成雙鏈部分。shRNA分子中所含的接頭部分只要能夠連接有義鏈和反義鏈形成莖環結構即可，可以是多核苷酸接頭，也可以是非多核苷酸接頭，沒有特別限定，優選本領域技術人員所公知的2~22個核苷酸的多核苷酸接頭。具體而言，可以例示UAGUGCUCCUGGUUG(SEQ ID NO: 7)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCC 和 UUCG，優選 UAGUGCUCCUGGUUG (SEQ ID NO: 7)。
[0037]本發明中的shRNA在3’末端至少具有由2個核苷酸組成的突出端。
[0038]在本發明中，突出端是指添加在反義鏈的3’末端的核苷酸，是指在有義鏈所對應的位置不存在能夠互補性結合的核苷酸的核苷酸。反義鏈的3’末端不具有突出端時，與具有突出端時相比，在使用下述所詳述的PEG修飾陽離子性脂質體的轉染中，shRNA所產生的TS表達抑制程度降低約40~60%。對該突出端的核苷酸的種類、數目沒有限定，例如可以列舉:由I~5個、優選I~3個、進一步優選I或2個核苷酸組成的序列，例如可以列舉TTT、UU或TT。優選為UU。
[0039]本發明中，作為優選的shRNA，是由SEQ ID NO: 8所表示的核苷酸序列組成的單鏈RNA。
[0040]另外，根據需要，有義鏈或反義鏈的5’末端可以被磷酸化，在5’末端可以結合有三磷酸(PPP)。[0041]本發明中的PEG修飾陽離子性脂質體，是在陽離子性脂質體的表面共價鍵合一個或多個聚乙二醇分子(PEG)而形成，由此可以增加陽離子性脂質體在體內的血中滯留性。
[0042]陽離子性脂質體可以根據公知的方法、例如薄膜振蕩法(Bangham法)來制作(A.D.Bangham 等人，J.Mol.Biol., 13,238-252 (1965) ；A.D.Bangham 和 R.ff.Horne, J.Mol.Biol.,8, 660-668 (1964)) ο即，在燒瓶等容器內將至少一種磷脂溶解于氯仿等有機溶劑中，使該有機溶劑揮發，在容器底部形成脂質膜，之后向其中加入緩沖液等水溶液，進行攪拌，從而可以得到含有脂質體的懸浮液。
[0043]本發明中的陽離子性脂質體，具有由選自以下的一種以上的磷脂形成的一層或多層膜:二油酰磷脂酰乙醇胺(以下記作“DOPE”)、棕櫚酰油酰甘油磷酰膽堿(以下記作“P0PC”)、膽固醇(以下記作“0101/’)、0，0’ -雙十四酰基-Ν-(σ-三甲基銨基乙酰基)二乙醇胺氯化物(以下記作“DC-6-14”)、氫化純化卵黃磷脂酰膽堿、氫化純化大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿和1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿。[0044]優選本發明中的陽離子性脂質體由DOPE、POPC、CHOL和DC-6-14組成。陽離子性脂質體中的DOPE、POPC和DC-6-14的含有比(摩爾比)為DOPE:P0PC:CH0L:DC_6_14 =2~4:4~1:3~1:1~4，優選為3:2:3:2。
[0045]結合在陽離子性脂質體表面的PEG從分子量處于500~5000的范圍的PEG中選擇，優選分子量為2000左右。PEG與陽離子性脂質體的結合可以按照公知的方法來進行，沒有特別限定，可以采用后插入法(post insertion method)來進行。即，在形成上述陽離子性脂質體后，將由磷脂和PEG組成的復合分子和該陽離子性脂質體在適當的條件下(例如30~60°C、30分鐘~3小時)下培養，從而可以以復合分子的脂質部分暴露在陽離子性脂質體外側的磷脂膜中、PEG暴露在陽離子性脂質體表面的形態插入。此時，相對于上述陽離子性脂質體的總脂質，所用復合分子的量為3~10%(摩爾比)、優選為5%。在本發明中，作為由可以利用的磷脂和PEG形成的復合分子，可以列舉mPEG2_-DSPE，但并不限于此。
[0046]本發明中的PEG修飾陽離子性脂質體，其粒徑為80~200nm，優選為約100nm。本發明中的PEG修飾陽離子性脂質體，其Zeta電位為10~40mV，優選為約25mV。
[0047]上述shRNA通過共價鍵或非共價鍵結合在上述PEG修飾陽離子性脂質體的膜表面。上述shRNA與上述PEG修飾陽離子性脂質體結合時，優選將包含上述shRNA和上述PEG修飾陽離子性脂質體的混合液劇烈攪拌I~15分鐘、優選10分鐘左右。通過增加攪拌，可以將所得的具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體的粒徑調整至數百nm的大小(Barichel lo, J.M.等人，Int.J.Pharm.(2011),doi:10.1016/j.1 jpharm.2011.03.001)。另外，通過進行攪拌，可以使上述ShRNA均勻分散在PEG修飾陽離子性脂質體上并結合，可以防止由shRNA的不均勻結合造成的組織的PEG修飾陽離子性脂質體攝取的不均勻性。
[0048]在本發明中，具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體的粒徑為120~600nm，優選為200~300nm。另外，在本發明中，具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體的Zeta電位為5~30mV，優選為約10~25mV。由于具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體的表面電荷更接近中性、并且存在由PEG產生的立體障礙(steric hindrance),所以其與血清蛋白結合少，因此可以防止其被肺胞捕捉，可以增加血中滯留性。
[0049]本發明中的具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體，除了包含上述shRNA外，還可以包含以在腫瘤細胞中表達的其他基因為靶的siRNA或shRNA。“腫瘤細胞中表達的其他基因”可以列舉:編碼參與腫瘤細胞增殖的因子、例如VEGF、EGFR、PDGF, HGF、Wint、Bcl_2、存活素等的增殖調節因子組，以及編碼核苷酸還原酶、DNA聚合酶等核酸合成相關酶組等的基因，但并不限于這些。上述shRNA和以在腫瘤細胞中表達的其他基因為靶的siRNA或shRNA可以和同一的PEG修飾陽離子性脂質體結合，也可以分別和不同的PEG修飾陽離子性脂質體結合。
[0050]需要說明的是，在本說明書中，有時將具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體稱作“PEG 修飾 lipoplex”。[0051]如下述實施例中所詳述，通過體內給藥，上述具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體可以抑制腫瘤細胞的增殖，可以作為用于治療癌癥的抗腫瘤藥來使用。
[0052]作為使用本發明的抗腫瘤藥可以治療的癌癥，可以列舉高度表達TS的癌癥，沒有特別限定，例如可以列舉:結腸.直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊.膽管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸腫瘤、骨?軟部肉瘤、白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦腫瘤、惡性胸膜間皮瘤等。優選為結腸.直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膽道癌、肝癌、惡性胸膜間皮瘤，特別優選為結腸.直腸癌、惡性胸膜間皮瘤。
[0053]本發明的抗腫瘤藥，在包含具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體的同時，還可以包含藥品制造中通常使用的賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、助溶劑、懸浮劑、等滲劑、pH調節劑、緩沖劑、穩定劑、著色劑、矯味劑、矯臭劑、組氨酸等。
[0054]作為賦形劑，例如可以列舉:乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、赤蘚醇、木糖醇、麥芽糖醇、肌醇、葡聚糖、山梨醇、白蛋白、尿素、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結晶纖維素、硅酸、甲基纖維素、甘油、海藻酸鈉、阿拉伯膠和它們的混合物等。作為潤滑劑，例如可以列舉:純化滑石粉、硬脂酸鹽、硼砂、聚乙二醇和它們的混合物等。作為粘合劑，例如可以列舉:單糖漿、葡萄糖液、淀粉液、明膠溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素、蟲膠、甲基纖維素、乙基纖維素、水、乙醇、磷酸鉀和它們的混合物等。作為崩解劑，例如可以列舉:干燥淀粉、海藻酸鈉、瓊脂末、昆布糖粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、淀粉、乳糖和它們的混合物等。作為稀釋劑，例如可以列舉:水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯類和它們的混合物等。作為穩定劑，例如可以列舉:焦亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸、巰基乙酸、巰基乳酸和它們的混合物等。作為等滲劑，例如可以列舉:氯化鈉、硼酸、葡萄糖、甘油和它們的混合物等。作為PH調節劑和緩沖劑，例如可以列舉:枸櫞酸鈉、枸櫞酸、乙酸鈉、磷酸鈉和它們的混合物等。
[0055]本發明的抗腫瘤藥可以通過口服給藥或胃腸外給藥(例如，靜脈內給藥、動脈內給藥、局部注射給藥、腹腔或胸腔給藥、皮下給藥、肌肉內給藥、舌下給藥、經皮吸收或直腸內給藥等)來進行給藥。優選本發明的抗腫瘤藥進行靜脈內給藥、腹腔內給藥或胸腔內給藥。
[0056]另外，本發明的抗腫瘤藥，根據給藥途徑，可以制成適當的劑型。具體而言，可以制備成注射劑、懸浮劑、乳化劑、軟膏劑、霜劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、丸劑、細粒劑、糖錠、直腸給藥劑、油脂性栓劑、水溶性栓劑等各種制劑形式。[0057]本發明的抗腫瘤藥的效果，可以通過對來自上述癌癥的細胞或組織、以及罹患上述癌癥的個體給予該抗腫瘤藥，將腫瘤的大小與未給予該抗腫瘤藥的(或給藥前的)細胞或組織、以及個體的腫瘤的大小進行比較，以腫瘤縮小或消滅為指標進行評價。作為可用于評價本發明的抗腫瘤藥的效果的癌細胞，只要其表達TS即可，對癌癥種類沒有特別限定，例如可以列舉:人結腸直腸癌細胞株DLD-1、DLD-1/5FU (5-FU抗性DLD-1株)、KM12C/5FU (5-FU 抗性 KMl2C 株)、HT29/5FU (5-FU 抗性 HT29 株)、人胃癌細胞株NUGC-3/5FU(5-FU抗性NUGC-3株)、人惡性胸膜間皮瘤細胞株(MSTO 211H)等。
[0058]與以TS的mRNA為靶的本領域技術人員所公知的以RNAi分子作為有效成分的抗腫瘤藥相比，本發明的抗腫瘤藥的效果可以具有2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、或其以上的抗腫瘤效果。
[0059]以往，向靶細胞中進行shRNA的體內遞送，利用的是包含編碼shRNA的DNA的病毒載體(W02010/113844)，利用該病毒載體注入時的水壓或病毒感染，編碼該shRNA的DNA轉移到細胞內，shRNA在核內表達。所表達的shRNA與內源性的shRNA —樣，與被稱作切酶(dicer)的酶接觸，切出莖環結構，成為由互補性的雙鏈RNA形成的siRNA，發揮RNAi作用。另一方面，本發明的抗腫瘤藥通過口服或胃腸外給藥，將擔載在PEG修飾陽離子性脂質體上的shRNA遞送到腫瘤細胞中。遞送至腫瘤細胞中的shRNA通過內吞作用向細胞內移動。即，與上述現有技術不同，本發明中的shRNA并不在靶細胞中表達。如上所述，從細胞外導入的shRNA在體內并沒有被分解，而是發揮RNAi作用，可以抑制在靶細胞中表達的內源性基因的表達，這是由本發明人首次發現的。
[0060]另外，在PEG修飾陽離子性脂質體上擔載siRNA時，在其制備過程中，有可能僅擔載未形成互補性雙鏈的有義鏈或反義鏈。這樣的僅擔載有義鏈或反義鏈的PEG修飾陽離子性脂質體可以說是雜質，從藥品的觀點考慮并不優選。另一方面，通過使shRNA擔載在PEG修飾陽離子性脂質體上，產生上述雜質的可能性低，從藥品的觀點考慮可謂是優選的。
[0061]本發明的抗腫瘤藥可以和現有的化療藥一同使用。作為現有的化療藥，可以列舉具有TS抑制作用的抗腫瘤藥。
[0062]作為“具有TS抑制作用的抗腫瘤藥”，只要能夠抑制TS的功能即可，沒有特別限定，例如可以列舉:5-FU類抗腫瘤藥、培美曲塞鈉水合物、雷替曲塞(Tomudex)、甲氨蝶呤(MTX)、0S1-7904L (0SI 公司)等。
[0063]有人報道了 TS的表達量與5-FU類抗腫瘤藥的敏感性的關系(Patrick G.Johnston 等人，Cancer Res 1995 ；55:1407-12.和 Kun-Huei Yeh 等人，Cancer 1998 ；82:1626-31)。即使在癌癥患者中，TS的表達較低的癌癥患者，5-FU類抗腫瘤藥也顯著奏效，另一方面，即使在癌癥患者中，TS的表達比較亢進的癌癥患者中大多數對5-FU類抗腫瘤藥具有抗性。通過給予本發明的抗腫瘤藥，可以抑制腫瘤組織內的TS的產生，可以提高該腫瘤組織的5-FU類抗腫瘤藥的敏感性。另外，當上述PEG修飾陽離子性脂質體與5-FU類抗腫瘤藥聯合使用時，其選擇性地蓄積在腫瘤內(Yusuke Doi等人，Cancer Sci, November, 2010,第 101 卷，n0.11,2470-2475)。
[0064]根據上述效果，與5-FU類抗腫瘤藥聯合使用時，包含該PEG修飾陽離子性脂質體的本發明的抗腫瘤藥可以將上述shRNA有效率地遞送到腫瘤中，與單獨使用5-FU類抗腫瘤藥或本發明的抗腫瘤藥時相比，可以得到2倍、3倍、4倍、5倍或其以上的顯著高的抗腫瘤效果O
[0065]作為“5-FU類抗腫瘤藥”，可以列舉:5_FU和活性代謝物為5_FU的5_FU衍生物。作為5-FU衍生物，例如可以列舉含有替加氟的物質。作為5-FU衍生物，優選為含有替加氟的復方藥，具體而言，可以例示:替加氟.尿嘧啶復方藥(例如UFT(注冊商標)(大鵬藥品工業株式會社))、替加氟?吉美嘧啶?奧替拉西鉀復方藥等。其中，特別優選下述所詳述的替加氟?吉美嘧啶?奧替拉西鉀復方藥、例如TS-1 (注冊商標)(大鵬藥品工業株式會社)。需要說明的是，在本說明書中，有時將5-FU類抗腫瘤藥記作“S-1”、“TS-1”，這些用語可以彼此互換使用。
[0066]另外，作為培美曲塞鈉水合物，可以列舉Alimta(注冊商標)(日本Eli Lilly株式會社)。培美曲塞鈉水合物也和上述5-FU類抗腫瘤藥一樣，通過將其與本發明的抗腫瘤藥聯合使用，可以將上述shRNA有效率地遞送到腫瘤中；和/或與單獨使用該培美曲塞鈉水合物或本發明的抗腫瘤藥時相比，可以得到2倍、3倍、4倍、5倍或其以上的顯著高的抗腫瘤效果。
[0067]本發明的抗腫瘤藥，除了與上述具有TS抑制作用的抗腫瘤藥一同使用外，或者可以改成與其他現有的化療藥一同使用。作為這樣的化療藥，可以列舉:環磷酰胺、鹽酸氧氮芥、異環磷酰胺、美法侖、白消安、二溴甘露醇、卡巴醌、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、卡莫司汀、培美曲塞二鈉、甲氨蝶呤、6-疏基嘌呤核苷、巰嘌呤、脫氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞嘧唳(cytarabine ocfosfate)、依諾他濱、吉西他濱、氟達拉濱、培美曲塞、順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、紫杉醇、多西他賽、鹽酸依立替康、卡培他濱等，可以使用從這些藥中選擇的一種或多種化療藥。這些化療藥也 和上述具有TS抑制作用的抗腫瘤藥一樣，通過與本發明的抗腫瘤藥聯合使用，可以將上述shRNA有效率地遞送到腫瘤中；和/或與單獨使用該化療藥或本發明的抗腫瘤藥時相比，可以得到2倍、3倍、4倍、5倍或其以上的顯著高的抗腫瘤效果。
[0068]本發明的抗腫瘤藥和上述現有的化療藥只要是聯合給藥，就可以作為組合物來提供。
[0069]“組合物”可以是包含本發明的抗腫瘤藥和上述現有的化療藥作為有效成分的復方藥，還可以是將本發明的抗腫瘤藥和上述現有的化療藥以適于聯合給藥的單一包裝(試劑盒制劑)的形式制造.包裝.流通的物質。
[0070]“聯合給藥”不僅包括將本發明的抗腫瘤藥和上述現有的化療藥同時進行給藥的情形，還包括將本發明的抗腫瘤藥和上述現有的化療藥間隔著進行給藥的情形。
[0071]本發明的抗腫瘤藥的給藥量和給藥次數，可以根據患者的年齡、體重、疾病的重癥度等因素而變化，以shRNA的量計，可以從每次每Ikg體重、0.0OOlmg~IOOmg的范圍中選擇適當的量，按照I天I~3次、每天或每I~21天來進行給藥。本發明的抗腫瘤藥中所含的上述具備shRNA的PEG修飾陽離子性脂質體，以由以往公知的RNAi分子和脂質體形成的復合體(lipoplex)相比，具有高的血中滯留性，所以可以避免頻繁給藥。由此，可以回避被給藥的生物體內的免疫系統的異物識別。
[0072]上述現有的化療藥的給藥量，可以根據作為有效成分的化學物質的種類、患者的年齡、體重、疾病的重癥度等因素而變化,可以從每次每Ikg體重0.0OOlmg~1000mg的范圍中選擇適當的量，按照I天I~3次、每天或每I~14天來進行給藥。例如，當現有的化療藥為5-FU類抗腫瘤藥時，可以每天或每I~7天給予I天以替加氟計為60~160mg的量。與上述現有的化療藥單獨使用時相比，可以以低用量且低頻率進行給藥。由此，可以抑制或延遲通過給予上述現有的化療藥而能夠引起的副作用(例如，骨髓抑制、溶血性貧血、彌漫性血管內凝血綜合征、重癥肝炎、脫水癥狀、腸炎、間質性肺炎、口腔炎、消化道潰瘍、消化道出血、消化道穿孔、急性腎功能不全、皮膚粘膜眼綜合征、中毒性表皮壞死癥、精神神經障礙、急性胰腺炎、橫紋肌溶解癥、嗅覺喪失等，并不限于這些)的發病。
[0073]本發明還涉及使用上述本發明的抗腫瘤藥的癌癥的治療方法。作為利用該方法可以治療的癌癥，包括以上定義的癌癥。另外，在該方法中，上述本發明的抗腫瘤藥和現有的化療藥的用法和用量如上所述。
實施例
[0074]以下給出實施例，來進一步詳細說明本發明。但本發明并不限于這些實施例。
[0075]實施例1:RNAi分子的制備
根據公知的常規方法，合成下述的siRNA和shRNA。
[0076](I)以 TS 為靶的 siRNA
以TS為靶的SiRNA根據已經確認到抗腫瘤效果的抗TS的siRNA (W02010/113844)來進行合成，其由下述的有義鏈和反義鏈組成。
[0077]有義鏈:
【權利要求】
1.抗腫瘤藥,其包含通過RNAi作用可以抑制胸苷酸合成酶的表達的短發夾RNA即shRNA和PEG修飾陽離子性脂質體，其中，該shRNA結合在該PEG修飾陽離子性脂質體的表面，并且在3’末端至少具有由2個核苷酸組成的突出端。
2.權利要求1所述的抗腫瘤藥，其中，shRNA包含由SEQID NO:1所表示的核苷酸序列組成的有義鏈和與該有義鏈在嚴格條件下雜交的反義鏈。
3.權利要求1或2所述的抗腫瘤藥，其中，shRNA包含由SEQID NO:1所表示的核苷酸序列組成的有義鏈和由SEQ ID NO: 2所表示的核苷酸序列組成的反義鏈。
4.權利要求1~3中任一項所述的抗腫瘤藥，其中，shRNA由SEQID NO: 8所表示的核苷酸序列組成。
5.權利要求1~4中任一項所述的抗腫瘤藥，其中，PEG修飾陽離子性脂質體包括由二油酰磷脂酰乙醇胺即DOPE、棕櫚酰油酰甘油磷酰膽堿即P0PC、膽固醇即CHOL和0，O’-雙十四酰基-Ν-(σ-三甲基銨基乙酰基)二乙醇胺氯化物即DC-6-14構成的陽離子性脂質體。
6.權利要求5所述的抗腫瘤藥，其中，VX3:2:3:2的摩爾比包含DOPE、POPC, CHOL和DC-6-14。
7.權利要求1~6中任一項所述的抗腫瘤藥，其中，抗腫瘤藥的粒徑為200~300nm。
8.權利要求1~7中任一項所述的抗腫瘤藥，進一步地，可以抑制選自參與腫瘤細胞增殖的基因的基因表達的siRNA或shRNA結合在PEG修飾陽離子性脂質體的表面。
9.權利要求8所述的抗腫瘤藥，其中，參與腫瘤細胞增殖的基因是選自編碼VEGF、EGFR、PDGF, HGF、Wint、Bcl_2、存活素、核苷酸還原酶、DNA聚合酶的基因中的一種或多種基因。
10.權利要求1~9中任一項所述的抗腫瘤藥，該抗腫瘤藥與用于治療腫瘤的化療藥聯合使用。
11.組合物,該組合物包含權利要求1~10中任一項所述的抗腫瘤藥和用于治療腫瘤的化療藥。
12.權利要求10所述的抗腫瘤藥和權利要求11所述的組合物，其中，用于治療腫瘤的化療藥為具有TS抑制作用的抗腫瘤藥。
13.權利要求12所述的抗腫瘤藥或組合物，其中，具有TS抑制作用的抗腫瘤藥為5-FU類抗腫瘤藥或培美曲塞鈉水合物。
14.權利要求13所述的抗腫瘤藥或組合物，其中，5-FU類抗腫瘤藥為替加氟.吉美嘧啶.奧替拉西 鉀復方藥。
【文檔編號】A61K47/18GK103561775SQ201280025004
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月22日 優先權日:2011年5月23日
【發明者】石田龍弘, 黃政龍, 和田洋巳 申請人:德爾塔菲制藥股份有限公司