誘導針對葡萄球菌屬中細菌的免疫應答的組合物和方法

誘導針對葡萄球菌屬中細菌的免疫應答的組合物和方法
【專利摘要】本發明涉及包括兩種或更多種葡萄球菌類毒素的組合物，所述組合物可用于誘導針對葡萄球菌疾病的保護免疫應答。
【專利說明】誘導針對葡萄球菌屬中細菌的免疫應答的組合物和方法
[0001]相關申請的交叉參考
[0002]本申請要求2011年3月16日提交的美國臨時申請第61/453，216號的優先權。在先申請的公開內容被認為是本申請公開的部分(且通過引用納入本文)。
[0003]關于聯邦資助的研究或開發的聲明
[0004]本申請中的一些研究由國立衛生研究院(National Institutes of Health)的基金A1074283和U54-AI57153資助。政府對本發明擁有某些權利。
【技術領域】
[0005]本文件關于含有葡萄球菌類毒素的組合物，更具體地關于含有兩種或更多種葡萄球菌類毒素的組合物以及在對象中誘導針對葡萄球菌(Staphylococcus)菌株產生的兩種或更多種葡萄球菌外毒素的免疫應答的方法。
【背景技術】
[0006]在美國，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)被認為是造成嚴重傳染性疾病的最顯著原因；在世界各地似乎也是如此。參見Klevens等，JAMA298:1763-1771 (2007)；和Lowy，NEngl J Med339:520-532 (1998)。該生物造成的嚴重疾病包括高致命性肺炎(每年有多達35000個患者死于該病)，感染性心內膜炎(其中金黃色葡萄球菌是多至20000個病例的原因(10000人致命，并且非常多的幸存者由于在腦部和其他器官中生成微生物凝塊而出現中風和轉移性膿腫))，敗血癥(其中該生物是血流感染的第二大病因(例如800000例外科手術后感染))，以 及骨髓炎(金黃色葡萄球菌是幾乎所有該病癥的病因)。另外，金黃色葡萄球菌已經變得對抗生素有高耐藥性，出現了社區相關和醫院相關的甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)。
[0007]醫學界和科學界已經做出巨大努力來開發針對金黃色葡萄球菌的疫苗。然而，至今所有的努力結果是失敗的。因此，存在針對金黃色葡萄球菌的疫苗的需求。

【發明內容】

[0008]如本文所述，向人葡萄球菌肺炎和的感染性心內膜炎的動物模型給予含有兩種或更多種葡萄球菌類毒素的組合物完全保護該動物免受金黃色葡萄球菌的攻擊。本文所述的組合物能用于針對葡萄球菌屬細菌的主動免疫。另外，本文所述的組合物能用于生成抗體，所述抗體能用作，例如，被動免疫治療試劑。不受特定機理的限制，葡萄球菌生成外毒素以促進該生物造成感染的能力。因此，本文所述的組合物能夠用于增強對象對于兩種或更多種葡萄球菌外毒素的免疫應答，使得在對象中中和外毒素的活性。具體地，葡萄球菌外毒素，其屬于稱為超抗原分子家族，在CD40上含有人細胞受體作用位點。
[0009]如本文所述，非毒性的超抗原突變體能夠擴大第二抗原(葡萄球菌β -毒素)的免疫應答10-100倍，以及其他抗原如HIV蛋白或綿羊紅細胞的的免疫應答。另外，針對TSST-1類毒素的抗體能夠中和超抗原性并且能夠保護兔子免受天然TSST-1的致死攻擊。帶有葡萄球菌TSS的患者沒有產生對于超抗原TSST-1的中和抗體，因此它們仍然容易受TSS復發的影響。這種效果是由于TSST-1的免疫功能障礙，而不是由于識別超抗原為外來的遺傳缺陷。本文所述TSST-1類毒素促進針對天然TSST-1的保護性免疫并且作用為擴大第二抗原抗體應答的佐劑。這種效果在使用野生型TSST-1的情況中沒有發現，其更可能造成抗體免疫抑制而不是佐劑特性。 [0010]在一個方面，本文涉及包含兩種或更多種葡萄球菌類毒素的組合物，其中所述類毒素選自中毒性休克綜合征毒素-1 (TSST-1)類毒素、葡萄球菌腸毒素B (SEB)類毒素、葡萄球菌腸毒素C(SEC)類毒素、葡萄球菌腸毒素樣X(SEL-X)類毒素、α毒素類毒素、β毒素類毒素和Y毒素類毒素。所述TSST-1類毒素可包含在位點31的絲氨酸殘基和在位點32的脯氨酸殘基。TSST-1類毒素能是融合蛋白(例如，殘基1-89為人TSST-1和殘基90-195為綿羊TSST-1的融合蛋白)。TSST-1類毒素能包含在位點135的丙氨酸。TSST-1類毒素能包含在位點136的丙氨酸。SEB類毒素可以包含下列一種或多種:在位點90的丙氨酸殘基，位點91的纈氨酸殘基，和位點210的丙氨酸殘基。SEC類毒素能是SEC3類毒素。SEC類毒素能包含位點90的丙氨酸殘基和/或位點210的丙氨酸殘基。α毒素類毒素能包含位點35的亮氨酸殘基。β毒素類毒素能包含位點149的天冬酰胺和/或位點288的天冬酰胺。在一些實施方式中，所述組合物包含三種葡萄球菌類毒素。在一些實施方式中，所述組合物包含四種葡萄球菌類毒素。在一些實施方式中，所述組合物包含五種葡萄球菌類毒素。在一些實施方式中，所述組合物包含TSST-1類毒素、SEB類毒素、SEC類毒素、α類毒素和β類毒素。這種組合物還能包含SEL-X類毒素和/或Y毒素類毒素。在本文所述的任意組合物中，所述Y毒素類毒素能夠是Y葡萄球菌毒素的單鏈(例如，Y葡萄球菌毒素的B鏈)。在一些實施方式中，所述組合物包含SEC類毒素、SEB類毒素和α類毒素。
[0011]本文所述的任意組合物還能包含佐劑(例如，不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑或鋁鹽)。
[0012]本文也涉及在對象中誘導針對葡萄球菌菌株產生的兩種或更多種葡萄球菌外毒素的免疫應答的方法。所述方法包括向對象給予有效量的藥物組合物以誘導免疫應答，所述藥物組合物包含兩種或更多種葡萄球菌類毒素，其中所述類毒素選自TSST-1類毒素、SEB類毒素、SEC類毒素、SEL-X類毒素、α毒素類毒素和β毒素類毒素。所述組合物能夠皮下給藥或肌肉內給藥。所述方法還能包括確定對象血液中是否包含對一種或多種葡萄球菌類毒素有特異性結合親和性的抗體。所述方法還包括確定對象血液中是否包含對一種或多種葡萄球菌外毒素有特異性結合親和性的抗體。葡萄球菌菌株能夠是甲氧西林耐藥性或甲氧西林敏感性的。所述菌株能夠是USA400、USA300或USA200的分離物。本文所述的任意組合物能用在所述方法中。
[0013]在另一方面，本文涉及包括TSST-1類毒素、SEB類毒素、SEC類毒素、葡萄球菌α毒素類毒素、葡萄球菌β毒素類毒素和Y葡萄球菌毒素單鏈的組合物。所述的組合物還能包含佐劑(例如，不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑或鋁鹽)。
[0014]在另一方面,本文涉及包含TSST-1類毒素、SEC類毒素、葡萄球菌α毒素類毒素、葡萄球菌β毒素類毒素和Υ葡萄球菌毒素的單鏈的組合物。所述的組合物還能包含佐劑(例如，不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑或鋁鹽)。這種組合物還能包含SEB類毒素。
[0015]在另一方面，本文涉及包含TSST-1類毒素、SEC類毒素和葡萄球菌α毒素類毒素的組合物。這種組合物還能包含SEB類毒素。所述組合物還能包含佐劑(例如，不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑或鋁鹽)。
[0016]除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的同樣含義。雖然在本發明的實施或測試中可以采用類似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了示例性的方法和材料。本文所述所有出版物、專利申請、專利、Genbank?登錄號和其他參考文獻都通過引用全文納入本文。在抵觸的情況下，以本申請(包括定義在內)為準。材料、方法和實施例都僅是說明性，并不意在構成限制。
[0017]從下面的詳述和權利要求中容易了解本發明的其他特征和優點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是顯示在中毒性休克綜合征毒素-1 (TSST-1)的類毒素突變體(G31S/S32P和Huvine, 1000 μ g/kg)(每種類毒素攻擊10只兔子)或野生型TSST-1 (I μ g/kg) (5只兔子)攻擊后兔子體溫4小時變化的柱形圖。在4小時時間點上，所有的兔子單獨用50 μ g/kg的脂多糖(LPS) (1/10LD50)攻擊。在造成致死TSS中，超抗原(TSST-1)和LPS之間存在IO6倍的協同作用。
[0019]圖2是顯示在用類毒素突變體SEC Y90A(10只兔子，1000μg/kg)或野生型SEC3(5只兔子，1μ g/kg)攻擊后兔子體溫4小時變化的柱形圖。在4小時時間點上,所有的兔子單獨用50 μ g/kg的LPS (I/IOLD5tl)攻擊。在造成致死TSS中，超抗原(SEC3)和LPS之間存在IO6倍的協同作用。
[0020]圖3顯示在用中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1) (( ) ；G31S/S32P( ?)；H135A ( ▲);和Q136A (.))(每種類毒素攻擊5只兔子)或野生型TSST-1 (I μ g/kg) (5只兔子)攻擊后兔子的體溫CC )。在4小時時間點上，就在測量4小時溫度之后，所有的兔子單獨用100 μ g/kg的LPS攻擊。存活數/總數是在LPS注射后48小時測算的存活動物的數量。
[0021]圖4顯示通過3H-胸苷整合到增殖外周血單核細胞(PBMC)的DNA上測量的TSST-1類毒素突變體(G31S/S32P[實心正方形]，Huvine[實心三角形])的超抗原性。類毒素和野生型TSST-1的劑量從10 μ g/孔至0.000001 μ g/孔。
[0022]圖5顯示在4天試驗中對于兔子脾細胞的TSST-1 ( )、G31S/S32P ( ?)、H135A( ▲)和Q136A(.)的超抗原性土標準偏差。兔子脾細胞(2xl05/孔)與TSST-1和突變體孵育3天，然后每孔加入I μ Ci3H-胸苷孵育24小時。收獲DNA，并且測定計算的每分鐘計數作為T細胞增殖的度量。
[0023]圖6是顯示在野生型TSST-1攻擊(用類毒素預先免疫(prior immunization)或非免疫的兔子)之后，存活兔子數量的柱形圖。用G31S/S32P或Huvine類毒素的預先免疫保護兔子免受TSST-1致死性。監測動物健康狀況15天。
[0024]圖7是顯示在野生型SEC3攻擊(用類毒素預先免疫或非免疫的兔子)之后，存活兔子數量的柱形圖。用SEC3 Y90A預先免疫保護兔子免受SEC3致死性。監測動物健康狀況15天。
[0025]圖8是比較在4天試驗中用兔子脾細胞測試的，在來自非免疫動物收集的兔子血清與TSST-1突變體G31S/S32P、H135A和Q136A超免疫動物收集的兔子血清中TSST-1 (I μ g/孔)超抗原性的柱形圖。脾細胞用指定稀釋的血清+TSST-1孵育3天，然后加入I μ Ci3H-胸苷孵育24小時。收獲DNA，并且測定計數/分鐘作為淋巴細胞增殖的度量。脾細胞的計數/分鐘+TSST-1 = 110，801 ±8647。單獨脾細胞的計數/分鐘=7248± 1164。
[0026]圖9Α是顯示對每個動物用2χ109量的野生型USA200MNPE(對于用G31S/S32P、G31S/S32P+Q或單獨用α免疫的動物)或USA400MW2 (對于用Υ90Α和Υ90Α+α類毒素免疫的動物)菌在支氣管內攻擊之后，預免疫(pre-1mmunized)或非免疫的兔子存活數量的線形圖。監測所述動物的健康狀況7天。用G31S/S32P、Υ90Α± α類毒素的預先免疫保護兔子免受致死性肺炎。
[0027]圖9Β是顯示在用野生型USA200MNPE攻擊之后預免疫或非免疫的兔子存活數量的線形圖。兔子(11只/組)用抗原、TSST-l(G31S/S32P)+SEC+a-毒素(H35L或野生型)的混合物(□)或單獨用a -毒素(H35L) ( ?)免疫3次，或保持非免疫(▲)。抗原在不完全佐劑中乳化并且免疫的動物加上非免疫對照動物用2xl09金黃色葡萄球菌MNPE肺內攻擊。與非接種疫苗的動物或針對單獨α-毒素(H35L或野生型)接種疫苗的動物相比，針對TSST-1 (G31S/S32P) +SEC+ a -毒素(H35L或野生型)免疫的兔子被顯著保護免于死亡(P < 0.001)。與非接種疫苗的對照相比，針對a -毒素(H35L或野生型)接種疫苗的動物顯著延緩死亡(P = 0.001)。
[0028]圖1OA是顯示在每只動物用2xl08量的野生型USA200MNPE IV菌攻擊之后預免疫或非免疫兔子(每組4-5只)的存活數量的線形圖。預免疫動物用G31S/S32P+Y90A+ a + β + y或單獨用α類毒素免疫的。監測所述兔子的健康狀況4天。
[0029]圖1OB是顯示在每只動物用2xl08量的野生型的USA200MNPE IV菌攻擊之后預免疫或非免疫兔子(每組4-5只)存活數量的線形圖。所述兔子用TSST-1 (G31S/S32P)、SEC、a -毒素(H35L)、β毒素和Y毒素(□)或單獨用a -毒素(H35L) ( ?)免疫3次，或保持非接種疫苗(▲)。攻擊生物是靜脈內的USA200金黃色葡萄球菌MNPE (在PBS中2xl08/2ml 體積)。
[0030]圖11是顯示荷蘭黑帶(Dutch-belted)兔(3/組)對于用單獨金黃色葡萄球菌β毒素(貝塔)和與兩種TSST-1類毒素(TSST-1 (Q136A)和TSST-1 (G31S/S32P))結合的免疫應答的抗體效價的柱形圖。與單獨用β毒素的反應相比，在TSST-1突變體存在下的免疫應答在斯氏t檢驗下顯著不同(P < 0.01)。
[0031]圖12是顯示來自用TSST-1和針對中和與T細胞⑶40配體互相作用的⑶40單克隆抗體處理的HVEC中IL-8生成(pg/mL)的柱形圖。單獨針對⑶40的單克隆抗體(x⑶40 ；20 μ I未稀釋)、單獨針對TSST-l(100yg/ml)的單克隆抗體、針對鏈球菌熱原外毒素A(xSPEA)的同種型匹配單克隆抗體和針對⑶40+TSST-1的單克隆抗體、以及針對鏈球菌熱原外毒素+TSST-1的單克隆抗體在96孔微孔板中與融合的HVEC重復三次孵育6小時。隨后用ELISA測量IL-8的生成。誤差線代表平均值的標準誤差。
[0032]圖13是表示針對攻擊CA-MRSA菌株生成的α毒素和各自的超抗原(SEC或SEB)免疫或非免疫兔子的體溫(V )和存活率的柱形圖，其中CA-MRSA菌株通過肺內給藥。在感染之前和感染后第I天用直腸溫度計測量發熱。在7天的時間期間記錄死亡。
[0033]發明詳述
[0034]通常，本文提供包含兩種或更多種葡萄球菌類毒素的組合物(例如，2、3、4、5、6或7種葡萄球菌類毒素)。如本文所使用，類毒素是指與相應的野生型毒素相比生物活性至少有IO6倍降低并且保持免疫原性的毒素。一些葡萄球菌類毒素包含一個或多個突變，所述突變降低了生物活性。在一些實施方式中，葡萄球菌類毒素指毒素的單個蛋白組分，所述毒素需要兩個不同的蛋白組分以生成生物活性毒素。在一些實施方式中，非毒性量的毒素被用于替代葡萄球菌類毒素或在葡萄球菌類毒素之外使用。
[0035]如本文所述，類毒素，特別是超抗原類毒素，通過位于它們中一些或所有之上的一個與B細胞上CD40相互作用的位點來擴大互相之間的免疫應答或對其他蛋白的免疫應答。參見實施例9。這個發現表明在一些其他類毒素疫苗(例如破傷風)的情況下，人不必每8-10年接受加強疫苗接種。另外，免疫劑量可以更小，在疫苗注射部位造成更少的不舒適。另外，這些超抗原類毒素可以加入到其他已確立的疫苗(例如破傷風、白喉、肺炎球菌(pneumonococcal)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、百日咳或奈瑟球菌屬(Neisseria))以用相同的方式擴大免疫應答。在一些實施方式中，合適的葡萄球菌類毒素結合到CD40，但缺少與MHC II分子或T細胞受體β -鏈(νβ -TCR)的可檢測的結合。
[0036]本文所述的組合物能包含中毒性休克綜合征毒素-1 (TSST-1)類毒素、葡萄球菌腸毒素B(SEB)類毒素、葡萄球菌腸毒素C(SEC)類毒素、葡萄球菌腸毒素樣X(SEL-X)類毒素、α毒素類毒素、β毒素類毒素或Y毒素類毒素中的兩種或更多種(例如，三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種或者七種或更多種)。
[0037]TSST-1類毒素能包含一個或多個突變(例如，在位點31、32、135、136或140)。例如，TSST-1類毒素能包含在SEQ ID NO:1的位點31和32的突變，SEQ ID NO:1如下=STNDNIKDLLDWYSSGSDTFTNSEVLDNSLGSMRIKNTDGSISLIIFPSPYY SPAFTKGEKVDLNTKRTKKSQHTSEGTYIHFQISGVTNTEKLPTPIELPLK VKVHGKDSPLKYWPKFDKKQLAISTLDFEIRHQLTQIHGLYRSSDKTGG YffKITMNDUSTYQSDLSKKFEYNTEKPPINIDEIKTIEAEIN。
[0038]例如，TSST-1類毒素能包含絲氨酸取代在SEQ ID NO:1的位點31上的甘氨酸以及脯氨酸取代在SEQ ID NO:1的位 點32上的絲氨酸(G31S/S32P)。TSST-1類毒素也能包含丙氨酸取代在SEQ ID NO:1的位點135上的組氨酸(Η135Α)，丙氨酸取代在SEQ ID NO:I的位點136上的谷胺酰胺(Q136A)，或丙氨酸取代在SEQ ID NO:1的位點139上的谷氨酰胺(Q139A) ο TSST-1G31S/S32P 缺少結合 MHC II 分子的能力，并且 TSST-1H135A，Q136A 和Q139A缺少結合V β -TCR的能力。
[0039]TSST-1類毒素也能夠是TSST-1毒素的人分離物和TSST-1毒素的綿羊分離物的融合蛋白，相對于成熟的人TSST-1分離物，其在SEQ ID NO:1的位點19、55、57、69、80、132和140含有不同的氨基酸。為了生成所述融合蛋白，tstH(人分離物)基因的部分和tstO(綿羊分離物)基因的部分連接以產生人-綿羊基因融合，稱為huvine蛋白。所述huvine蛋白含有來自TSST-1 (人分離物)的前89個氨基酸和來自TSST-綿羊分離物的后105個氨基酸。Huvine不是促T細胞有絲分裂的，并且不會在兔子模型中引發中毒性休克綜合征。參見例如，Murray 等，152 (I):87-95 (2001)。
[0040]如實施例2和4所述，TSST-1類毒素G31S/S32P、huvine、H135A和Q136A是無生物學活性的并且與野生型TSST-1相比至少IO6倍無活性。
[0041]SEB和SEC類毒素能夠包含一個或多個突變(例如，在位點20、23、90、91或210)。參見例如，Leder 等，J Exp Med.187(6) =823-833(1998) ? 例如，SEC 類毒素能是 SEC3 類毒素，其在 SEQID NO:2 的位點 90 有突變，SEQ ID NO:2 如下:ESQPDPMPDDLHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVKSVDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCYFS SKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLVRVYENKRNTIS FEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIENNGNT FWYDMMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTKNG。例如，SEC3 類毒素能夠包含丙氨酸取代在SEQ ID NO:2的位點23上的天冬酰胺。例如，SEC3類毒素能夠包含丙氨酸取代在SEQ ID NO:2的位點90上的酪氨酸。SEC3類毒素能夠包含丙氨酸取代在SEQ ID NO:2的位點210上的谷胺酰胺。
[0042]SEB類毒素能在SEQID NO:3的位點20、26、90、91或210上有突變，SEQID N0:3如下:ESQPDPKPDELHKSSKFTGLMENMKVLYDDNHVSAINVKSIDQFLYFDL1 YSIKDTKLGNYDNVRVEFKNKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSK KTNDINSHQTDKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYRSITVRVFEDGKNLLSF DVQTNKKKVTAQELDYLTRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENS FWYDMMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKMVDSKDVKIEVYLTTKKK。例如，SEB類毒素能夠包括丙氨酸取代在SEQ ID NO:3的位點90上的酪氨酸。SEB類毒素能夠包括丙氨酸取代在SEQ ID NO:3的位點210上的谷胺酰胺。SEB類毒素能夠包括纈氨酸取代在SEQ ID NO:3的位點91上的酪氨酸。在另一個實施方式中，SEB類毒素能包括蘇氨酸取代在位點20上的亮氨酸，酪氨酸取代纈氨酸，以及纈氨酸取代在SEQID NO:3的位點91上的酪氨酸。如實施例2和4所述，與野生型SEC3相比，SEC3Y90A至少IO6倍無活性。
[0043]SEl-X類毒素能包含一個或多個突變(例如，在SEQ ID NO:1的位點31、32、135、136、139或140的對應殘基)。例如，SEl-X類毒素能包含在SEQ ID NO:4 (MFKKYDSKNSIVLKSILSLGIIYGGTFGIYPKADASTQNSSSVQDKQLQ KVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQV RIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGE HLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSV NDIEQV)中與 SEQ ID NO:1 的位點 31 和 32 對應的突變。
[0044]α毒素類毒素能具有一個或多個突變(例如,在位點35)。例如，α毒素類毒素能包含在 SEQ ID NO:5 的位點 35 上的突變，SEQ ID NO:5 如下:ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKT⑶LVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHN KKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTCDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKY VQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSffNPVYGNQLF MKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKffTDRS SERYKIDffEKEEMT N。
[0045]例如，亮氨酸能夠取代SEQ ID NO:5的位點35上的組氨酸。參見例如，W02009/029831。如下文實施例6和7所述，單獨針對G31S/S32P免疫或與α毒素結合免疫的兔子被完全保護以免受金黃色葡萄球菌菌株的攻擊。然而，單獨針對α毒素的免疫僅僅在部分程度上保護動物。
[0046]β毒素類毒素能具有一個或多`個突變(例如，在位點149或288)。例如，β毒素類毒素能包含在SEQ ID NO:6的位點149和288上的突變，SEQ ID NO:6如下:ESKKDDTDLKLVSHNVYMLSTVLYPNWGQYKRADLIGQSSYIKNNDVVI FNEAFDNGASDKLLSNVKKEYPYQTPVLGRSQSGWDKTEGSYSSTVAED GGVAIVSKYPIKEKIQHVFKSGCGFDNDSNKGFVYTKIEKNGKNVHVIGT HTQSEDSRCGAGHDRKIRAEQMKEISDFVKKKNIPKDETVYIGGDLNVN KGTPEFKDMLKNLNVNDVLYAGHNSTWDPQSNSIAKYNYPNGKPEHLD YIFTDKDHKQPKQLVNEVVTEKPKPWDVYAFPYYYVYNDFSDHYPIKA YSK。例如，天冬酰胺能取代SEQ ID NO:6的位點149上的組氨酸并且天冬酰胺能取代SEQ ID NO:6的位點288上的組氨酸。參見例如，Huseby 等，J.Bacteriol.，189 (23):8719-8726 (2007)。
[0047]y毒素取決于兩個不同的蛋白組分，并且每個組分單獨有免疫原性但是沒有毒性。Y毒素的A蛋白與B蛋白或C蛋白配對以形成活性蛋白。因此，組合物能包含Y毒素的A蛋白、B蛋白或C蛋白。B蛋白在本文的組合物中特別有用，由于其單獨不具有毒性。SEQ ID NO:7 是 A 鏈的氨基酸序列:GPLGSPEFENKIEDIGQGAEIIKRTQDITSKRLAICQNIQFDFVKDKKYNK DALVVKMQGFISSRTTYSDLKKYPYIKRMIWPFQYNISLKTKDSNVDLIN YLPKNKIDSADVSQKLGYNIGGNFQSAPSIGGSGSFNYSKTISYNQKNYV TEVESQNSKGVKWGVKANSFVTPNGQVSAYDQYLFAQDPTGPAARDYF VPDNQLPPLIQSGFNPSFITTLSHEKGKGDKSEFEITYGRNMDATYAYVT RHRLAVDRKHDAFKNRNVTVKYEVNWKTHEVKIKSITPKoSEQ ID NO:8 是B 鏈的氨基酸序列:GPLGSPEFEGKITPVSVKKVDDKVTLYKTTATADSDKFKISQILTFNFIKD KSYDKDTLVLKAAGNINSGYEKPNPNDYDFSKLYWGAKYNVSISSQSND SVNVVDYAPKNQNEEFQVQNTLGYTFGGDISISNGLSGGLNGNTAFSETI NYKQESYRTTLSRCTNYKNVGffGVEAHKIMNNGffGPYGRDSFHPTYG NELFLAGRQSSAYAGQNFIAQHQMPLLSRSNFNPEFLSVLSHRQDGAKK SKITVTYQREMDLYQIRffNGFYffAGANYKNFKTRTFKSTYEIDffENHK VKLLDTKETENNK。
[0048]在一些實驗中，本文所述的組合物能包含TSST-1類毒素(例如，G31S/S32P、H135A、Q136A和/或Huvine)，SEC類毒素(例如，SECY90A和/或Q210A)，以及α毒素類毒素(例如,H35L)。這樣的組合物還能包含下列中的一種或多種:SEB類毒素(例如，SECY90A和/或Q210A)、β毒素類毒素(例如，Η149Ν、Η288Ν)、Y毒素類毒素(例如，Y毒素的B鏈)以及SEl-X類毒素。
[0049]在一些實施方式中，本文所述的組合物能包含TSST-1類毒素(例如，G31S/S32P、H135A、Q136A 和 / 或 Huvine)，SEC 類毒素(例如，SECY90A 和 / 或 Q210A)，SEB 類毒素(例如，SECY90A和/或Q210A)、α毒素類毒素(例如，H35L)以及β毒素類毒素(例如,Η149Ν、Η288Ν)。這樣的組合物還能包含Y毒素類毒素(例如，Y毒素的B鏈)和/或SEl-X類毒素。
[0050]本文所述的毒素和類毒素能通過標準體外重組DNA技術和使用合適的多肽的編碼核苷酸序列的體內轉基因制備。可采用本領域技術人員熟知的方法以引入突變和構建含有相關編碼序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。參見例如，SambiOOk等，《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第二版)[紐約冷泉港實驗室，1989],以及Ausubel等，《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols inMolecular Biology)[紐約格林出版聯合公司和威利國際科學，1989]中描述的技術。
[0051]上述轉錄/翻譯調控元件包括但不限于誘導型啟動子和非誘導型啟動子、增強子、操縱子和其他本領域技術人員已知并且驅動或調控基因表達的元件。這種調控元件包括但不限于巨細胞病毒hCMV快速早期基因、SV40腺病毒的早期啟動子或晚期啟動子、Iac (乳糖)系統、Trp (色氨酸)系統、TAC系統、TRC系統、噬菌體A的主要操縱子和啟動子區域、fd外殼蛋白的控制區域、3磷酸甘油酸激酶啟動子、酸性磷酸酶啟動子以及酵母α交配因子啟動子。
[0052]用于本發明目的的表達系統包括但不限于微生物，如含有編碼增強劑或免疫原性刺激物的核酸分子的重組噬菌體DNA、質粒DNA或DNA表達載體轉化的細菌(例如，大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis));用含有編碼增強劑或免疫原性刺激物的核酸分子的重組酵母表達載體轉化的酵母(例如，釀酒酵母(Saccharomyces)和畢赤酵母(Pichia));用含有編碼增強劑或免疫原性刺激物的核酸分子的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)或煙草花葉病毒(TMV))感染或用含有編碼核酸分子的重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)轉化的植物細胞系統；或包容了含有衍生自哺乳動物基因組(例如，金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子和牛痘病毒7.5K啟動子)的啟動子的重組表達構建體的哺乳動物細胞系統(例如，COS、CHO、BHK,293, VERO, HeLa, MDCK, WI38和NIH3T3細胞)。同樣有用的宿主細胞是直接從哺乳動物得到并且用質粒載體轉染或用病毒載體感染的原代或次生細胞。
[0053]用本文所述的表達載體轉染或轉導的細胞然后能用于，例如通過本領域已知的方法大規模或小規模體外制備類毒素。大體上，這種方法涉及在最大化多肽產量的條件下培養細胞和從培養物(例如，細胞和/或培養基)中分離多肽。純化生物大分子(例如，蛋白質)的方法為本領域已知。例如，本文所述的類毒素能通過乙醇沉淀和等電聚焦的結合從含有突變基因克隆的培養液體中純化。參見Blomster-Hautamaa和Schlievert, MethodsEnzymol 165:37-43(11) (1988)。大分子的純度通過任何適當方法如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析來測定。
[0054]含有兩種或更多種葡萄球菌類毒素的組合物能用作針對葡萄球菌屬細菌所造成的疾病的預防性疫苗。本文所述的組合物也能用作生成針對兩種或更多種葡萄球菌外毒素的抗體，以用作例如被動免疫治療劑。例如，本文所述組合物能用作針對金黃色葡萄球菌(包含金黃色葡萄球菌的甲氧西林耐藥性菌株如USA400、USA300或USA200)、中間葡萄球菌(S.1ntermedius)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、里昂葡萄球菌(S.1ugdunensis)、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、李氏葡萄球菌(S.1eei)、其他凝固酶陰性或陽性葡萄球菌造成的疾病的疫苗。USA300和USA400是社區相關的甲氧西林耐藥性的金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)菌株。USA400菌株，包含菌株MW2和c99_529,從USA400與壞死性肺炎(necrotizing pneumonia)的原始聯系中分離，是壞死性肺炎的強效原因。參見JAMA 282 =1123-5(1999);和Fey等，AntimicrobAgents Chemother47:196-203 (2003)。
[0055]金黃色葡萄球菌引起的疾病包括，例如中毒性休克綜合征、肺炎、感染性心內膜炎、敗血癥、皮膚感染、軟組織膿腫、胃腸炎和骨髓炎。本文所用術語“預防”是指完全防止疾病的癥狀、延遲疾病癥狀的發生或減輕隨后發展的疾病癥狀的嚴重程度。例如，對于金黃色葡萄球菌，預防性疫苗能防止肺炎、敗血癥、感染性心內膜炎或骨髓炎的發展，延遲肺炎、敗血癥、感染性心內膜炎或骨髓炎的癥狀或減輕肺炎、敗血癥、感染性心內膜炎或骨髓炎的隨后發展癥狀的嚴重程度。本文所述的組合物能用于在人或其他動物(包括兔子、小鼠、雪貂、狗和雞)中誘導針對葡萄球菌外毒素的免疫應答。
[0056]如本文所用，“免疫應答”是指在受體患者中出現針對葡萄球菌外毒素的體液應答(抗體介導)、細胞應答(抗原特異性T細胞或其分泌產物介導)或同時出現體液應答和細胞應答。這種應答可以是通過給予免疫原誘導的主動應答或者通過給予抗體、含有抗體的物質或激活(primed)的T細胞誘導的被動應答。如本文所用“主動免疫”是指通過給予抗原在對象中產生的任意免疫。如本文所用“被動免疫”是指不給予對象抗原的情況下產生的任意免疫。“被動免疫”因此包括但不限于，給予活化的免疫效應子，所述效應子包含免疫應答的細胞介導物或蛋白介導物(例如，單克隆抗體和/或多克隆抗體)。單克隆抗體或多克隆抗體組合物能用于被動免疫中，以用于防止或治療葡萄球菌生物引起的感染。所述抗體組分能夠是多克隆抗血清。在特定方面，一種或多種抗體從用本文所述組合物攻擊的動物或第二對象中親和純化。
[0057]在一些實施方式中，向對象給予包含多種葡萄球菌類毒素的組合物。本文所述類毒素具有固有的佐劑活性，因為其能與其他抗原顯著地協同以擴大抗體應答。同樣，本文所述組合物不需要包括單獨的佐劑。
[0058]在一些實施方式中，向對象給予含有多種葡萄球菌類毒素和佐劑的組合物。“佐劑”是能增強針對特定抗原(如多肽)的免疫應答的免疫學化合物。能夠基于，例如給藥途徑或給藥次數來選擇合適的佐劑。佐劑的非限制性例子包含礦物油佐劑如弗氏完全佐劑和不完全佐劑、和蒙塔尼(Montanide)不完全森皮(seppic)佐劑(ISA,購法國巴黎的森皮(Seppic)公司)；水包油乳液佐劑如瑞比(Ribi)佐劑系統(RAS) ;TiterMax?，和含有胞壁酰二肽的語法佐劑(syntax adjuvant)制劑；角藍烯；或招鹽佐劑(例如，磷酸招、氫氧化招或明礬)。
[0059]本文所述組合物能包含藥學上可接受的賦形劑，如磷酸鹽緩沖鹽水或碳酸氫鹽(例如，0.24M NaHCO3)。基于給藥的模式和途徑，以及標準藥學實踐，一名本領域普通技術人員能選擇合適的賦形劑。藥物賦形劑和稀釋劑，以及使用它們的藥學必要性，在例如《雷明頓藥物科學》(Remington, s Pharmaceutical Sciences)中描述。藥物賦形劑的非限制性例子包含溶劑(例如水或生理鹽水) 、增溶劑(例如，乙醇、聚山梨酯或Cremophor EL7)、實現等滲的試劑、防腐劑 、抗氧化劑、乳糖、淀粉、結晶纖維素、甘露醇、麥芽糖、磷酸氫鈣、輕質硅酸酐、碳酸鈣、粘結劑(例如，淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮、羥丙基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素或阿拉伯膠)、潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或硬化油)或穩定劑(例如，乳糖、甘露醇、麥芽糖、聚山梨酯、聚乙二醇或聚氧乙烯硬化蓖麻油)。如果需要，能加入甘油、二甲基乙酰胺、70 %乳酸鈉、 表面活 性劑、或堿性物質如氫氧化鈉、乙二胺、乙醇胺、碳酸氫鈉、精氨酸、葡甲胺或三氨基甲烷。如果需要緩慢釋放所述組合物，可生物降解的聚合物如聚-D，L-交酯-共-乙交酯或聚乙交酯能被用作主體基質(bulk matrix)(參見例如,美國專利號5，417，986,4, 675，381和4，450，150)。藥物制品如溶液、片劑、顆粒或膠囊能用這些組分制成。如果所述組合物通過口服給藥，能夠加入調味劑和/或色素。
[0060]通常，給藥的組合物能在藥學上可接受的賦形劑(例如，生理鹽水)中懸浮并且通過口服、透皮、靜脈內、皮下、肌肉內、眼內、腹膜內、直腸內、陰道內、鼻內、胃內、氣管內、肺內或其任意組合給藥。例如，所述組合物能通過鼻內和皮下給藥。如果需要，加強免疫能在不同的間隔下(例如，間隔3個月或3年)下給予一次或多次(例如，2、3或4次)。例如，對于預防性疫苗，初免劑量后在不同的間隔下(例如間隔一周)一次或多次加強免疫(例如，三次加強劑量)。例如，使用相同的制劑，加強注射能在第一次免疫8-12周后給予，并且第二次加強注射在16-20周后給予。
[0061]合適劑量的組合物在對象中引起免疫應答但不造成對象出現葡萄球菌感染的嚴重臨床信號。引起免疫應答所需要的劑量取決于給藥的途徑、組合物的本質、對象的尺寸、體重、表面積、年齡和性別、給予的其他藥物以及主治醫師的判斷。從各種給藥途徑的不同效率來看，預期需要的劑量有很大的變化。例如，口服給藥比靜脈內注射給藥預期需要的劑量更大。這些劑量水平的變化能用標準經驗程序調節以優化，這是本領域所熟知的。把組合物包埋在合適的遞送載劑(例如，聚合微粒或可植入裝置)中可增加遞送的效率，尤其是口服遞送。
[0062]為了確定在對象中是否誘導免疫應答，能檢測來自對象的生物樣品以確定其是否包含可檢測量的具有對一種或多種類毒素的特異結合親和性的抗體，這些類毒素是對象接種疫苗所針對的。生物樣品能夠是血液(例如，血清)或粘膜樣品(例如，唾液)。檢測抗體(包括IgG、IgM和IgA)的方法是已知的，并且能夠包括，例如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或Western印跡。
[0063]制品
[0064]本文所述組合物能與包裝材料和固體結合作為制品或試劑盒。生產制品的組分和方法是熟知的。所述制品可與本文所述的一種或多種治療組合物結合。另外，制品還可包含無菌水、藥物運載體、緩沖液、抗體、指示分子和/或其他有用的檢測微生物疾病的試劑。這種試劑盒中可包含說明書，所述說明書描述組合物或疫苗如何有效防止感染的出現、防止感染的臨床信號的發生、緩解感染的臨床信號、降低感染的臨床信號的風險、降低感染的臨床信號的發生和/或減少感染的擴散。本文所述組合物能以對單次給藥有效量的預制并包裝好的形式提供。
[0065]以下是本發明實踐的實施例。它們不會以任何方式對本發明的范圍構成限制。實施例
[0066]實施例1
[0067]材料和方法
[0068]含有編碼TSST-1、TSST-1突變體或SEC的質粒的金黃色葡萄球菌菌株RN4220被用作 TSST-1、TSST-1 突變體或 SEC 的來源。參見 Leder 等，J Exp Med, 187 =823-33(1998)；Murray 等，Infect Immun, 64:371-4 (1996);以及Murray 等，J Immunol, 152:87-95 (1994)。菌株RN4220不產生可檢測的內源性超抗原。RN4220也被用作β -毒素的來源。參見Gaskin等，Protein Expr Purif9:76_82S(1997)。
[0069]金黃色葡萄球菌菌株MNPE是天然α -毒素的來源。參見Lin等,Biochemistry50:7157-67(2011)。大腸桿菌克隆是突變體α-毒素(H35L)的來源，其由芝加哥大學的Juliane Bubeck-Wardenburg博士提供，并且Y -毒素表達自ρΕΤ載體。參見Bubeck-Wardenburg和 Schneewind, J Exp Med205:287_94S(2008)。
[0070]金黃色葡萄球菌菌株MNPE在微生物攻擊研究中使用；該生物在明尼蘇達州(Minnesota)造成流感后 TSS 的致命病情。參見 MacDonald 等，JAMA, 257 =1053-8(1987)。MNPE分離自USA200 ;這些生物造成了大多數的TSS病情。參見Schlievert等，J AllergyClin Immunol 125:39-49(2010)。MNPE 具有以下分泌毒力因子表型:TSST_1 高+、SEC高+、α -毒素S+、β -毒素S+和Y -毒素+。參見Lin等，2011，同上。對于在肺炎和感染性心內膜炎/敗血癥研究中使用，所述生物在37°C下在標準空氣條件下在25ml的Todd-Hewitt (密歇根州底特律的迪菲克實驗室(Difco Laboratories))肉湯中以200轉/分鐘的速度搖動。參見Schlievert等，Infect Disl47:236-42 (1983)。所述生物用磷酸緩沖鹽水(PBS ;0.005M磷酸鈉，pH7.2 ；0.15M NaCl)洗滌一次，在14，OOOx g下離心5分鐘，然后以2x1070.2ml體積在Todd Hewitt培養基中重懸作為在肺炎研究中的高劑量注射(Strandberg 等，J Infect Dis 202:1690-7 (2010))，并且以 lxl08/ml 在 PBS 中重懸，對于感染性心內膜炎/敗血癥研究用2ml靜脈內注射(Schlievert等，Infect Immun,66:218-23(1998))。
[0071]TSST-1的類毒素候選疫苗包含G31S/S32P(其中位點31從甘氨酸變為絲氨酸，并且位點32從絲氨酸變為脯氨酸)、H135A(其中位點135從組氨酸變為丙氨酸)、Q136A (其中位點136從谷胺酰胺變為丙氨酸)和huvine (人和綿羊TSST的融合基因；這些蛋白有7個氨基酸不同)。由于在結合到MHC II分子的外毒素的位點上的突變，并且這種結合對于毒性是必需的，G31S/S32P蛋白無生物學活性。參見See Kim等，Science,266:1870-1874(1994)。Huvine 蛋白也無生物學活性。參見 Murray 等，J Tmmunol 152:87-95(1994)。H135A蛋白無法結合到T細胞受體的β鏈的可變區(Vβ-TCR)，并且Q136A蛋白也不能結合到 νβ-TCR。參見 Jardetzky 等，Nature368:711_8 (1994) ;McCormick 等，J Tmmunol 1 71: 1385-92 (2003);以及 Murray 等，Infect Tmmun64:371-4(1996) ?
[0072]TSST-1 的 G31S/S32P、H135A 和 Q136A 位點特異突變通過使用快變(Quikchange)方法(加利福尼亞州拉由拉市司查塔基公司(Stratagene))制備。初始質粒是在穿梭質粒pCE104上的天然tstH,克隆進入大腸桿菌。參見Murray等，1996,同上。在進行誘變之后，所得的質粒克隆進入大腸桿菌并且驗證完整的結構基因序列以確認TSST-1突變。然后該質粒克隆進入金黃色葡萄球菌RN4220用于制備和純化。Huvine蛋白通過剪接TSST-1和TSST-綿羊的基因制作并且然后克隆進入RN4220。
[0073]G31S/S32P、H135A、Q136A、huvine 類毒素和 TSST-1, SEC 以及天然 α -毒素和β_毒素通過乙醇沉淀和等電聚焦的結合從含有突變基因克隆的培養液體中純化。參見 Blomster-Hautamaa 和 Schlievert, Methods Enzymol 165:37-43(11) (1988)；以及Blomster-Hautamaa 等，Biochemistry25:54-9(1986)。基本上，對于 TSST-1、TSST-1 類毒素、SEC、天然α-毒素和天然毒 素的生產，生物體在透析的牛心培養基中生長過夜。TSST-U TSST-1類毒素、SEC和β-毒素從培養液體中用四倍體積的無水乙醇沉淀兩天(80 %終濃度)，在蒸餾水中重新溶解，然后通過薄層等電聚焦純化。對于初始分離，等電聚焦的PH梯度是ρΗ3.5-10，然后對于TSST-1、TSST-1類毒素和α -毒素是ρΗ6_8，對于SEC和毒素是ΡΗ7-9。天然α-毒素相似地從金黃色葡萄球菌菌株MNPE生成，除了所述毒素用80%終濃度飽和硫酸銨從培養液體中沉淀，然后在蒸餾水中溶解并且透析3天，然后等電聚焦。
[0074]α -毒素(H35L)的無生物學活性的突變體和Y _毒素的富集制備從ρΕΤ載體中的大腸桿菌克隆中生成并且在鎳柱上純化。參見Bubeck Wardenburg和Schneewind, J ExpMed205:287-94(2008)。
[0075]當用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和反相高效液相色譜檢測時，TSST-K TSST-1 突變體和 SEC 是均勻的。參見 Blomster-Hautamaa 和 Schlievert,1988，同上。另外，這些蛋白對于污染脂多糖(LPS)、肽聚糖、溶細胞素、脂肪酶和蛋白酶是陰性的。天然α-毒素還通過反相高效液相色譜純化并且是均勻的。參見Lin等，2011，同上。由大腸桿菌生成的α-毒素突變體H35L和Y-毒素含有少量大腸桿菌污染物，其并不影響實驗。純化的蛋白用伯樂(BioRad)蛋白試驗定量。
[0076]實施例2
[0077]在兔子中類毒素疫苗的安全性
[0078]通過給予類毒素嘗試在兔子中生成TSS，從而在兔子中測試(荷蘭黑帶兔(Dutch-belted),購自明尼蘇達州雷德溫市(Red Wing)Bakkom養兔場)類毒素的安全性。超抗原外毒素是已知最有效的熱原之一，并且擴大革蘭氏陰性脂多糖LPS的致死效果
1,000，000 倍。參見 Schlievert，Infect Immun 36:123-128(1982)。使用三個試驗以測試類毒素的殘余毒性:1)在靜脈內給予類毒素然后給予LPS ；2)通過微滲透泵皮下給予類毒素；以及3)超抗原性的體外測試。
[0079]在一個實驗中，兔子(每組10只)用TSST-1類毒素突變體(G31S/S32P或Huvine，1000 μ g/kg)或I μ g/kg的野生型TSST-1 (5只兔子)攻擊IV。在4小時時間點上，所有的兔子都用501^/1^的1^5(1/100)5(|)單獨攻擊。所述LPS來自腸炎沙門菌(Salmonellaenteritidis)傷寒血清型(serovar),并且通過熱-苯酹方法制備。圖1顯示用類毒素突變體或野生型TSST-1攻擊后兔子的發熱反應。在4小時時間期間沒有類毒素誘導的顯著發熱，而野生型TSST-1是高熱原的(P << 0.001，對于類毒素和野生型TSST-1，用斯氏t檢驗)。給予1000 μ g/kg的各類毒素然后給予LPS的兔子都沒有死亡，相比之下，所有5只給予I μ g/kg野生型TSST-1然后給予50 μ g/kg LPS的動物死亡(P = 0.003，用菲希爾精確檢驗)。這些研究表明G31S/S32P和Huvine類毒素與野生型TSST-1相比至少1，000, 000倍無活性，并且兩種類毒素都被兔子良好耐受，因為兔子沒有顯示源于攻擊的不良作用。
[0080]在另一個實驗中，兔子(每組5只)用500ug/kg天然TSST-1或TSST-1G31S/S32P、H135A或Q136A突變體中的一種來攻擊IV，然后在4小時時間點上用100ug/kg通過熱-苯酚方法制備的，來自腸炎沙門菌傷寒血清型的LPS攻擊IV。就在給予LPS之前，相比TSST-1或突變體預先注射，在4小時時間點上記錄發熱情況，并且在48小時時間期間內記錄死亡情況。天然TSST-1造成高燒，而所有`的3個突變體都是非熱原的(P < 0.001，對于TSST-1與任意突變體的比較)(圖2)。另外，所有接受天然TSST-1然后接受LPS的5只兔子都在I小時內死亡，但是所有接受突變體TSST-1蛋白然后接受LPS的5只兔子在48小時都沒有死亡(P < 0.008，對于TSST與任意突變體相比)(圖2)。這些數據表明所有3種突變體蛋白是> 500, 000倍無活性的，因此能被認為是類毒素。
[0081]相似的實驗用SEC3 Y90A重復(葡萄球菌腸毒素C，其中位點90從酪氨酸殘基變為丙氨酸殘基)。結果見圖2。與G31S/S32P和huvine類毒素相同，相比野生型SEC3，所述SEC3 Y90A類毒素至少1，000, 000無活性并且被兔子良好耐受，因為沒有觀察到源于攻擊的不良作用。
[0082]當植入的微滲透泵在皮下給藥時，單獨用TSST-1對于兔子是致死的；該模型中的致死劑量是75ι^/動物(llyg/天)。天然TSST-1和每個TSST-1突變體(G31S/S32P、H135A或Q136A) (1000 μ g/動物;143yg/天或IOxLD50)在微滲透泵(加利福尼亞州瓦卡維爾的阿爾扎公司(Alza Corporation))中向5兔子/組給藥。當動物用氯胺酮(25mg/kg)和賽拉嗪(25mg/kg)(加利福尼亞州伯林格姆的菲尼克斯制藥公司(PhoenixPharmaceuticals))麻醉時,植入泵。監測7天內兔子TSS癥狀(發熱、腹灣、結膜發紅和低血壓跡象)和致死疾病的發展，所述致死疾病定義為即將死亡的100%預測值，包括動物同時不能保持挺直和不能展示逃跑反應。動物用靜脈內注射lml/kg的Beuthanasia-D (德克薩斯州西湖的先林葆雅公司(Shering-Plough))處死。存活的兔子在7天結束時處死。給予三種TSST-1突變體的沒有引起發熱，如植入后第二天所測量(P < 0.001，對于TSST-1相比任意突變體)，沒有造成任何TSS病癥并且沒有造成任何動物的死亡。相反，天然TSST-1是熱原的，誘導TSS病癥，并且造成所有5只動物在48小時內死亡(P < 0.008，對于TSST-1相比任意突變體)。
[0083]這些數據通過體外測試確定，所述體外測試通過評估造成人PBMC增殖的能力來評估類毒素造成人T細胞超抗原性刺激的能力(圖4)。在一個實驗中，試驗在96孔微孔板中孵育4天后重復四次進行。參見Barsumian等，Infect Immun22:681-688 (1978)。相似比較野生型TSST-1 [空心正方形]的超抗原性。在完整的劑量反應(10 μ g/孔-0.000001 μ g/孔)中，類毒素(G31S/S32P或huvine)都沒有在體外展示出超抗原性，而野生型TSST-1在10 μ g/孔和0.00001 μ g/孔的劑量之間有超抗原性(所有試驗重復四次進行)。參見圖4。兩種類毒素的3H胸苷整合入DNA的每分鐘計數(CPM)(增殖的度量)相比野生型TSST-1在從10 μ g/孔下至0.00001 μ g/孔之間的所有劑量下，通過斯氏t檢驗有顯著差異(P << 0.001)。這些數據證實兩種類毒素與野生型TSST-1相比至少IO6倍無活性。
[0084]在另一個實驗中，兔子脾細胞(2xl05/孔)與TSST-1和突變體(G31S/S32P、H135A或Q136A)孵育3天，然后每孔加入I μ Ci3H-胸苷24小時。收獲DNA，并且測定每分鐘計數作為T細胞增殖的度量。參見Schlievert等，J Infect Disl43:509-16 (1981)。天然TSST-1在IOyg/孔下至KT6Ug/孔的毒素范圍內是超抗原性的(圖5)。3種TSST-1突變體都沒有展示出超抗原性活性，甚至在10 μ g/孔的劑量也沒有。這些研究表明突變體的超抗原性降低> IO7倍。
[0085]實施例3
[0086]兔子抗體反應
[0087]大約20%的人顯示不能產生針對超抗原TSST-1的抗體應答。參見Parsonnet等,JClin Microbiol43:4628-34(2005);以及 Vergeront 等，J Infect Dis, 148:692-8 (1983)。另外，缺少抗體TSST-1的月經期的TSS病人，沒有產生感染之后的保護性抗體因而易于多次復發TSS。參見Osterholm等，J Infect Disl45:431-40 (1982)。這種現象在感染疾病中是不正常的，通常感染導致特異的免疫。已經假設了兩種可能的機理以解釋在易感個體中缺少產生針對TSST-1的抗體:1)這些人可能遺傳上不能識別TSST-1為外來物，因而不能產生針對這個22，000分子量蛋白的抗體應答；以及2)這些人可能對于超抗原是超敏感(hyper-responsive)的,具有免疫調節異常防止抗體應答。如果20%的人由于遺傳缺陷不能產生針對任意提供的超抗原的抗體應答，這會減少使用超抗原類毒素試圖向人接種以免受嚴重葡萄球菌疾病的爭議。
[0088]兔子產生針對天然TSST-1的保護性抗體應答的能力被確定作為體內模型，以理解在人中缺少保護性抗體應答的機理。與小鼠相反，兔子對于超抗原是高度易受感染的，并且成為研究產生TSS的重要因子的極好的模型。
[0089]20只荷蘭黑帶兔用25 μ g/劑量的在不完全佐劑中乳化的天然TSST-1隔周注射3次。在頸背上多個皮下位點免疫。在對動物的最后一次免疫一周之后，從耳緣靜脈處抽血，收集血清，并且通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)確定抗體效價，如Strandberg等，J Infect Dis202:1690-7(2010)所述。簡要地，平底96孔板(新罕布什爾州樸次茅斯的NUNC Maxisorp公司)用1.Ομ g/孔純化的天然同源超抗原或溶細胞素包被,然后洗漆。兔血清樣品從1:10稀釋開始系列稀釋2倍；平板在室溫下最少孵育1.5小時，然后洗滌。加入辣根過氧化物酶偶聯的抗兔IgG抗體(密蘇里州圣路易斯市的西格瑪-阿爾德里奇公司(Sigma-Aldrich))到孔中。這些平板再孵育最少1.5個小時，并洗滌孔。IgG的相對水平通過加入100 μ I/孔的鄰苯二胺和H2 O 2底物確定。比色反應通過加入50 μ 112.5%的硫酸溶液停止。平板用分光光度計在490nm的波長下掃描吸光度。
[0090]用25 μ g/劑量的天然TSST-1免疫導致僅僅10/20的兔子產生針對TSST-1的抗體效價，并且ELISA測試其> 10，000，其中效價是提供超過背景的顏色變化的最后一個孔稀釋度的倒數。為了比較，易受TSS感染的人的針對TSST-1抗體效價< 40，而不發生TSS的人的效價> 80。因而，認為10只產生抗體的兔子對TSST-1是超免疫的。
[0091]相反，10只剩下的動物的抗體效價< 10，這是該試驗中的檢測的下限。然后只要它們存活，這些10只無應答的動物每個月持續免疫直到6個月。這些兔子每個月也通過ELISA監測針對TSST-1的抗體的產生。所有10只動物死于疫苗接種嘗試，其中7只在6個月之后死亡。在所有測試的時間點上，所有這10只兔子的抗體效價< 10。因此，兔子模型顯示重復人的情況，因為相當大百分比的人和兔子都不能產生針對TSST-1的抗體應答。在兔子針對超抗原SEB和SEC的抗體應答中觀察到相同的現象。
[0092]實施例4
[0093]在兔子中類毒素 疫苗的免疫原性和安全性
[0094]針對無生物學活性的蛋白(TSST-1和α -毒素突變體)超免疫的荷蘭黑帶兔和新西蘭白兔，所述蛋白通過25 μ g的各蛋白單獨或與PBS結合用等體積的弗氏不完全佐劑乳化。在頸背上多個皮下位點免疫。天然毒素(TSST-l、SEC、a-毒素、β-毒素和Y -毒素)以約10 μ g/ml的劑量按照相同的方案免疫。所有試驗的免疫是隔周的(第O、14和28天)，注射3次。在最后一次動物免疫一周后，從耳緣靜脈處抽血，收集血清，并且通過ELISA測定抗體效價(參見實施例3)。
[0095]在一個實驗中，用25 μ g的在弗氏不完全佐劑中乳化的G31S/S32P或Huvine在頸背皮下注射3次，以隔周免疫兔子(20只/組)。用ELISA所測定，在最后一次免疫I周后所有兔子的抗體效價大于100，000，相比非免疫(20只動物)和免疫前動物的抗體效價是< 10。
[0096]用野生型TSST-1攻擊免疫的和非免疫對照動物(通過阿爾扎微滲透泵皮下給藥500 μ g)，并且在15天的時間期間監測致死TSS的發展(圖6)。當通過阿爾扎微滲透泵皮下給藥時,野生型TSST-1對于兔子是致死的。參見Lee等，Infect Immun59:879-884 (1991)。微滲透泵被設計在7天期間釋放恒定量的毒素，在這段期間內在100 μ g/泵(14 μ g/天)的野生型TSST-1劑量下，兔子出現統一的致死TSS。在這個模型中致死性不需要LPS。
[0097]沒有免疫的動物在測試期間死亡，并且在第I天測量時也沒有出現發熱(平均0.3±0.10C )，沒有出現腹瀉并且沒有減少體重。相反，所有非免疫動物都死亡(P = 7xl0_12相比于免疫組)，所有動物在第I天發熱顯著(平均1.9±0.2V )，所有動物有大量腹瀉，并且都在死亡前減少體重。
[0098]用SEC3 Y90A類毒素重復類似的實驗。如圖7所示，用SEC3 Y90A的預先免疫保護兔子免受野生型SEC3的攻擊。
[0099]在另一個實驗中，兔子(10只/組)用TSST-1突變體G31S/S32P、H135A或Q136A隔周免疫，共3次。在第三次注射一周后采血時，ELISA測試各組中的所有10只動物(總共30只)具有> 10，000的針對天然TSST-1的抗體效價。這些數據說明之前50%的兔子無法產生抗體應答是由于TSST-1誘導的免疫應答的調節異常，而不是遺傳上不能識別TSST-1為外來蛋白。
[0100]針對TSST-1突變體G31S/S32P、H135A或Q136A免疫的兔子以及對照、非免疫動物(5只/組)然后在最后一次免疫一周后，用致死劑量的天然TSST-1攻擊，或以10 μ g/kg加LPS(10 μ g/kg)靜脈內(5000x LD50)攻擊或單獨以500 μ g/kg在微滲透泵中(71 μ g/天; 5.5x LD50)攻擊。在LPS增強模型中用TSST-1攻擊時，每組的5只兔子中都沒有出現發熱，并且在給予LPS后4小時時間點上，每組5只動物都沒有死亡。相反，所有5只對照，非免疫動物出現TSST-1引起的發熱，并且所有都在LPS給藥后< 6小時內死亡。在微滲透泵模型中，在植入后第2天測量，每組中的5只動物都沒有出現發熱，都沒有顯示TSS癥狀并且沒有死亡。相反，所有5只對照、非免疫動物顯示出發熱，并且所有動物都在植入后第2天之前死亡。
[0101]總體來說，實施例2和4表明類毒素是安全的，因為蛋白> IO6失活；所述類毒素是免疫原性的(3次免疫的效價> 100，000，相比免疫前和對照動物< 10的效價)；并且在TSS的標準高敏感兔子模型中，當用五倍劑量的造成100%致死的TSST-1攻擊時所述動物被保護。
[0102]實施例5
[0103]用抗體中和TSST-1
[0104]在用天然TSST-1攻擊之前，合并從上述10只兔子收集的血清，所述兔子用突變體蛋白(G31S/S32P、H135A或Q136A)隔周免疫3次。這些合并的血清和來自接種前動物的合并的血清在體外測試其中和TSST-1超抗原性的能力，所述測試用兔子脾細胞和I μ g/孔的天然TSST-1測試(圖8)。在這些試驗中，來自免疫動物的未稀釋和1/10和1/100稀釋的血清完全中和TSST-1超抗原性；甚至1/1000稀釋的來自免疫動物的合并的血清部分中和天然TSST-1的超抗原性。相反，20ul的未稀釋的、合并的免疫前血清不能中和超抗原性。在所有稀釋免疫血清下TSST-1超抗原性的抑制與用非免疫血清超抗原性的抑制存在至少P < 0.003的顯著差異。所述數據表明針對TSST-1致死性的免疫機理是中和超抗原性。
[0105]實施例6
[0106]針對致命肺炎的免疫
[0107]兔子(每組11只)針對G31S/S32P TSST-1和α毒素免疫，并且分別用Υ90Α SEC3和單獨α毒素免疫。另外,用單獨G31S/S32P、單獨Y90ASEC3和單獨α毒素進行相似研究。所有動物隔天用在弗氏不完全佐劑中的25 μ g的各抗原/類毒素免疫，共注射3次。在最后一次免疫一周后，進行ELISA。與免疫前和非免疫動物< 10的效價相比，免疫兔子的抗體效價超過100，000。所述兔子然后用2xl09菌落形成單位(CFU)的USA200菌株MNPE支氣管內攻擊(這些動物對TSST-1和α類毒素免疫)或2χ109菌落形成單位USA400菌株MW2支氣管內攻擊(這些動物對SEC3和α毒素免疫)。與對照，非免疫動物相比，就兔子免受攻擊的保護而言，監測7天(圖9Α)。[0108]針對單獨G31S/S32P免疫或與α毒素結合免疫的動物完全被保護而免受USA200MNPE金黃色葡萄球菌的攻擊；單獨α毒素免疫的這些動物僅僅部分被保護。對于免疫的動物，除了這些針對單獨α毒素免疫的兔子，在7天的時間內沒有動物顯示發熱、腹瀉或減少體重；所有動物保持健康。這些用α毒素的數據與小鼠中進行的研究不同，而在小鼠中當單獨用α毒素接種時觀察到完全保護。在金黃色葡萄球菌感染方面，小鼠與人不同，而兔子與人高度相似，因此兔子是更敏感的動物模型。針對單獨Υ90Α SEC免疫或Υ90Α+ α毒素免疫的兔子完全被保護而免受USA400麗2的攻擊。當用USA200MNPE或USA400MW2攻擊時，非免疫動物(在本研究中僅顯示為一行)都在I天內死亡。
[0109]在另一個實驗中，使用兔子肺病模型，其中荷蘭黑帶兔通過氣管內接種給予MNPE (0.2ml 體積中 2xl09CFU)，該方法如 Strandberg 等，J Infect Dis 202:1690-7(2010)所述。簡單地說，用皮下注射氯胺酮(25mg/kg)和賽拉嗪(25mg/kg)(加利福尼亞州伯林格姆的菲尼克斯制藥公司(Phoenix Pharmaceuticals))麻醉兔子。刮去它們頸部的毛，造成小的切口以暴露氣管。在插入Imm直徑的聚乙烯導管(馬里蘭州斯帕克斯的BD公司(Becton, Dickinson and Co))并將其穿透左側的支氣管之前,在氣管中造成小切口(3mm)。MNPE通過導管給予，然后移去導管并封閉切口。監測7天內兔子TSS癥狀(發熱、腹瀉、結膜發紅和低血壓跡象)和致死疾病的發展，所述致死疾病定義為即將死亡的100%預測值，包括動物同時不能保持挺直和不能展示逃跑反應。動物用靜脈內注射lml/kg的Beuthanasia-D(德克薩斯州西湖的先林德雅公司(Shering-Plough))處死。存活的兔子在7天結束時處死。
[0110]評估由TSST-1 (G31S/S32P)、低劑量天然SEC和非毒性劑量α -毒素(H35L) (5只兔子)或野生型α-毒素出只兔子)組成的三價疫苗保護免受高劑量USA200金黃色葡萄球菌MNPE (2x109CFU)攻擊的致死肺炎的能力。也評估針對α -毒素非毒性突變體(H35L) (5只動物)或單獨用天然α-毒素(5只動物)的免疫以保護兔子免受金黃色葡萄球菌MNPE的相似攻擊。所有的動物用不完全佐劑隔周注射3次來免疫，ELISA顯示出有針對所有三種天然毒素的高抗體效價(> 10，000)，并且這些動物在最后一次免疫一周后與非免疫對照一起，用2χ109ΜΝΡΕ肺內攻擊。在這些組中存活率有顯著的差異(β <0.001)。對于針對包含TSST-lG31S/S32P+SEC+a-毒`素(H35L或天然)的三價疫苗免疫的兔子，所有兔子都被保護免受致死性肺炎(圖9B)。相反，所有11只非免疫動物在致死性攻擊下死亡(β<0.001)。用單獨a -毒素H35L或單獨天然a -毒素免疫的兔子顯示由于MNPE攻擊而減緩死亡，但是最終9/11的兔子死亡(β = 0.001，相比于非免疫組)。針對三價疫苗免疫的兔子相比針對單獨α-毒素(H35L或天然)免疫的兔子有更高的存活率(β <0.001)。
[0111]實施例7
[0112]五價疫苗防止感染性心內膜炎和敗血癥
[0113]通過用(i)G31S/S32PTSST-1、Y90A SEC、α 類毒素、β 毒素和 Y 毒素或(ii)G31S/S32P TSST-U SEC、α類毒素(H35L)、β毒素和、毒素免疫來評價保護兔子免受USA200MNPE敗血癥和感染性心內膜炎。USA200MNPE分泌所有這些外毒素。在這個模型中，通過插入2小時導管破壞新西蘭白兔的左頸動脈瓣。參見Schlievert等，Infection andImmunity 66(1):218-23 (1998)。簡單地說,這些兔子用氯胺酮(25mg/kg)和賽拉嗪(25mg/kg)麻醉。在頸部的左側造成缺口以暴露左頸總動脈。導管插入左頸動脈并且推送到主動脈瓣，在那里導管放置2小時以誘導對內皮的破壞。在2小時后，移去導管并縫合手術位點。2x108CFU劑量的金黃色葡萄球菌USA200MNPE被注射進入耳緣靜脈。因為這些動物是靜脈內注射，能夠監測致死敗血癥和感染性心內膜炎的發展。如上述，監測兔子4天內的疾病信號和致死率。在即將死亡時或4天之后，兔子被處死。取出心臟并檢測增殖體。如果觀察到增殖體，對其切下、稱重、勻漿并系列稀釋以測定CFU。如果不存在增殖體，取用主動脈瓣的刮片、系列稀釋并涂板。
[0114]在一個實驗中，用超抗原類毒素和溶細胞素(G31S/S32P、Y90A SEC、H35La類毒素、野生型β毒素和Y毒素)的結合物免疫的兔子被完全保護免受致死性敗血癥和沒有形成感染性心內膜炎增殖體(圖10)。一只免疫的兔子在接受丁丙諾啡的緩解疼痛藥物后30秒死于致死性過敏。剩余的動物在4天的測試期間(相對于形成心臟增殖體的峰值時間，心內膜炎的標記信號)中保持健康。一些兔子僅僅針對α毒素免疫，并且這些動物顯示減緩的死亡。非免疫動物在I天內死亡。
[0115]在另一個實驗中，兔子(4-5只/組)針對G31S/S32P TSST-1、SEC、α類毒素(H35L)、β毒素和Y毒素或單獨a -類毒素H35L隔周免疫,共3次。對照動物保持非免疫性。在免疫后，通過ELISA，所有的動物對各毒素高度免疫，并且在上述的感染性心內膜炎和敗血癥模型中，所有的免疫動物和非免疫動物在最后一次免疫后一周用MNPE攻擊。用五價疫苗預先免疫的兔子被顯著保護免受致死性敗血癥(圖10B)。通常MNPE的增殖體尺寸大至IOOmg (數據未顯示)。一只來自五價免疫組的兔子在第2天晚些時間死亡并且有6mg的IxlO8CFU的增殖體。在免疫的兔子中觀察到最大的增殖體是14mg而最小的是lmg，比MNPE相關的通常尺寸小得多。這個數據表明針對這5個分泌毒素的預先免疫提供了針對其他致死攻擊的免疫保護并且顯著減小了增殖體的尺寸。
[0116]對于針對單獨α-毒素H35L預先免疫的兔子，四只中有三只出現小的增殖體(2-3mg)，并且所有的兔子都死于致死性敗血癥(圖10B)，盡管致死性相比非免疫對照組延緩了(H35L免疫的兔子在第2天或第3天死亡而對照兔子在第I天死亡)。在這些組中總存活率存在顯著的差異(P = 0 .01)。針對單獨a -毒素和五價疫苗免疫的動物的存活率都顯著高于非免疫動物(P分別=0.002和0.001)。另外，針對五價疫苗免疫的兔子相比單獨針對a -毒素免疫的兔子也被顯著地保護而免受致死性敗血癥(P = 0.004)。
[0117]在本研究中的所有的對照、非免疫動物在注射MNPE后24小時內死于致死性敗血癥(圖10B)。這些動物都沒有顯著的增殖體，可能是由于這些動物死亡太快，盡管在他們的主動脈瓣上有可見的小增殖體形成。
[0118]實施例8
[0119]TSST-1 (Q136A)和TSST-1 (G31S/S32P)作用為佐劑以刺激針對其他抗原的抗體應答。
[0120]用TSST-1突變體(G31S/S32P或Q136A)與葡萄球菌溶細胞素β -毒素結合免疫的兔子相比用單獨β_毒素免疫的兔子生成高得多的針對β_毒素的抗體應答(圖8)。兔子用全蛋白25 μ g/兔子的免疫劑量免疫3次，然后在免疫后一周測試抗體效價。在用不完全佐劑免疫當天后的第14天，通過ELISA評價第一免疫應答；在第14天用不完全佐劑免疫后的第28天，通過ELISA評價第二免疫應答；并且在第28天免疫后的第42天，通過ELISA評價第三免疫應答。單獨用β -毒素免疫的兔子產生免疫應答抗體效價，所述效價從第一次免疫后的100增加至第三次免疫后的600(圖11)。相反，用β-毒素和任意TSST-1 (G31S/S32P)或TSST-1 (Q136A)的共免疫造成β _毒素抗體效價從第一次免疫之后的200-300增加到第三次免疫之后的接近IO6 (P < 0.001比較單獨用β -毒素第三次免疫后的抗體效價與用β -毒素+任意TSST-1突變體的共免疫后的抗體效價)。這些數據表明MHC II突變體TSST-1 (G31S/S32P)以及TCR突變體TSST-1 (Q136A)作用為有效的佐劑。因此，超抗原(SAg)具有固有的佐劑活性，因為它們能夠與其他抗原高度顯著地協同以擴大抗體應答。這個實驗用綿羊紅細胞和卵清蛋白加/減突變體TSST-1蛋白重復得到相似結果。實施例9[0121]TSST-1 結合至 CD40
[0122]超抗原(SAg)是強效的T淋巴細胞促分裂原，這種性質稱為超抗原性，并且刺激來自多個物種的T淋巴細胞。然而，在小鼠和大多數非人靈長類中SAg不生成TSS，但是它們在人，以及作為動物模型的兔子和雪貂中引起TSS。因此，本文所述的疫苗研究在兔子中進行，因為這些動物，像人那樣，對于超抗原的毒性效果是高度易感染的。然而，兔子中的研究限制了測定佐劑特性機理的能力。由于這個問題，用人陰道上皮細胞(HVEC)進行體外研究以確定固有佐劑特性的可能的機理。T細胞刺激取決于SAg與T細胞受體β -鏈可變區(νβ-TCR)的結合，而不取決于T細胞的抗原特異性。另外，最優的T細胞刺激需要通過II型MHC分子向T細胞呈遞SAg。在沒有抗原加工的情況下，通過SAg與在巨噬細胞表面上MHC II分子可變區的結合而發生呈遞。SAg并不在TCR的典型凹槽區域氣結合，其涉及抗原肽-1I型MHC的識別。相反，所述毒素與Vi3-TCR上的外部、相對不變的位點相互作用。由SAg的T細胞刺激(主要是CD4+)和巨噬細胞激活通過細胞因子對TSS疾病的發展起顯著作用，所述細胞因子包含IL-1 β、IL-2、TNF-α、TNF-β和干擾素Y。
[0123]預先研究通過微陣列分析檢測了在暴露于TSST-1之后HVEC基因表達的變化。Peterson等，Infect Immun73:2164-74 (2005)。除了增加細胞因子和趨化因子的表達，當ATCC HVEC與TSST-1孵育時，⑶40RNA轉錄上調(未公開數據)。⑶40位于上皮細胞和抗原遞呈細胞包括B淋巴細胞上。CD40是最優的B細胞抗體生成所必需的重要的免疫共刺激分子。參見Elgueta等，ImmunolRev229:152-72(2009)。CD40也促進免疫球蛋白同種型的類別轉換。另外，HVEC在其表面缺少MHC II分子(數據未顯示)。因此，這些細胞用于確定TSST-1是否與作為佐劑特性所需要的潛在受體的CD40相互作用。
[0124]TSST-1結合到⑶40的能力用Western免疫印跡評價。⑶40(2 μ g，購自R&D系統公司(R&D systems))和對照蛋白(卵清蛋白，2yg)經非變性PAGE并轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜通過加入1%牛血清白蛋白和1%人血清封閉30分鐘。然后，0.033μ8/ml-33 μ g/ml 的 TSST_1、TSST_1 (Q136A)或 TSST-1 (G31S/S32P)與膜在室溫下孵育 24 小時。然后洗滌膜并且用針對TSST-1的兔抗體、堿性磷酸酶-偶聯的抗兔IgG的抗體和最終底物依次孵育，每個步驟之間洗滌。
[0125]觀察到TSST-1結合⑶40。出現兩種類毒素突變體TSST-1與⑶40的結合相似:，G31S/S32P缺少結合MHC II分子的能力，Q136A缺少結合V β-TCR的能力。這兩種類毒素突變體不與電泳的卵清蛋白結合。所有三種TSST-1蛋白的結合是相似的。所有三種蛋白的相似結合說明TSST-1與νβ-TCR(Q136)和α -鏈MHC II(G31/S32)的相互作用區域不與⑶40相互作用。
[0126]為了測定TSST-1與CD40的結合的Kd，各種濃度的TSST-1，范圍從0.033 μ g/ml至33μ8/πι1，單獨與PVDF膜上的2yg⑶40孵育過夜以保證結合的平衡。然后，洗滌膜并且用針對TSST-1的兔抗體、堿性磷酸酶-偶聯的抗兔IgG抗體和最終底物依次孵育。蛋白條帶的濃度與相似處理的標準量的純化TSST-1作比較,通過NIH程序ImageJ(萬維網www.rsbweb.nih.gov/ij/)比較濃度。通過斯卡查德(Scatchard)分析確定的⑶40與TSST-1相互作用的Kd為約2.7X10_6M。
[0127]為了具有評價⑶40與TSST-1相互作用的獨立方法，使用牽出試驗來驗證結合。用蛋白A包被的磁珠(Dynabeads,紐約州格蘭德島的英杰生物科學公司(Invitrogen LifeSciences))用針對TSST-1的山羊IgG抗體處理，然后用TSST-1，最后用CD40 (2ug)處理，每個步驟之間和用CD40孵育之后洗滌。所得的制備物用十二烷基硫酸鈉(SDS)PAGE點樣緩沖液處理，SDS-PAGE電泳，然后用Western免疫印跡測試⑶40。對照是由不用TSST-1但用⑶40處理的磁珠組成。在磁珠上存在TSST-1的情況下，相比沒有TSST-1時，更多的⑶40被拉下，證實TSST-1結合到⑶40。
[0128]假設用將TSST-1和單克隆抗體(所述抗體中和T細胞上與⑶40配體相互作用的CD40)與HVEC共同孵育會導致干擾IL-8趨化因子的生成。來自絕經前女性的HVEC描述于Petersen等，2005，同上。第二 HVEC系購自ATCC (登錄號CRL-2614)。在使用前，HVEC在角質形成細胞無血清培養基(KSFM)中用抗生素培養至24小時。在那個時候，所述細胞轉變到不含抗生素的KSFM中。實驗在不含抗生素的KSFM培養基中進行。出乎意料的是，與單獨用TSST-1孵育相比，當TSST-1和針對⑶40的單克隆抗體與HVEC孵育時，在IL-8趨化因子生成中觀察到接近3倍的協同作用(圖12) ；CD40的單克隆抗體沒有誘導生成細胞因子。另外，非相關單克隆抗體(針對鏈球菌熱原外毒素A(SPEA)的單克隆抗體)不與TSST-1協同作用以造成擴大的IL-8生成。最后，相同的針對⑶40的單克隆抗體阻隔⑶40配體刺激的來自HVEC的趨化因子生成(數據未顯示)。
[0129]總體來說，這些數據表明TSST-1結合到免疫共刺激分子⑶40，⑶40對產生中和抗體的B細胞的最優刺激是必需的，因此對TSST-1突變體類毒素的佐劑特性起作用。天然TSST-1可能與MHC II和νβ -TCR更顯著地相互作用以掩蓋佐劑效果。
[0130]實施例10
[0131]針對壞死性肺炎的免疫
[0132]通過用α毒素、SEC和SEB免疫來評價保護兔子免受USA400菌株MW2和c99_529感染造成的壞死性肺炎。MW2對于溶細胞素α毒素和SEC的產生是陽性的，而菌株C99-529對于α毒素和SEB的產生是陽性的。
[0133]兔子(每組10只)通過在頸背上3次皮下注射針對α毒素和SEC來免疫，注射的組合物如下:第O天，在弗氏不完全佐劑(密歇根州底特律的迪菲克公司(Difco))中乳化的(10 μ g α毒素、IOyg SEC和IOyg SEB);第14天,在弗氏不完全佐劑(密歇根州底特律的迪菲克公司)中乳化的(IOyg α毒素、IOyg SEC和IOyg SEB);以及第28天，在弗氏不完全佐劑(密歇根州底特律的迪菲克公司)中乳化的(10 μ g α毒素，IOyg SEC和10 μ g SEB)。ELISA證明了針對相應毒素的兔子血清抗體效價> 10，000。
[0134]四組兔子用2x109/0.2ml體積的麗2或c99_529肺內攻擊。這四組兔子是:
[0135]第I組:10只α毒素+SEC免疫并且用MW2攻擊的兔子；第2組:10只非免疫并且用麗2攻擊的兔子；第3組:10只α毒素+SEB免疫并且用c99_529攻擊的兔子；第4組:10只非免疫并且用C99-529攻擊的兔子。
[0136]這些實驗的結果視于圖13。當第O天(注射前)與注射后第I天比較時，動物(兩種性別的新西蘭白兔，2-3Kg)顯示體溫升高。在第I天，非免疫動物的體溫升高比免疫動物的體溫升高顯著得多，如斯氏t檢驗分析所測試(P<<0.001)。這個數據顯示對于α毒素以及相應超抗原的免疫能顯著防止發熱的發展。用CAMRSA菌株攻擊的在兩組中非免疫動物在注射后第三天前一律死亡。所有這些動物都有出血性壞死性肺炎。相反，免疫動物都沒有死亡，事實上，所有動物在注射后第7天都似乎是健康的。在免疫和非免疫動物之間的存活率有顯著差異，對于兩種攻擊生物的菲希爾精確檢驗P < 0.0001。這些數據指示了由USA400CA-MRSA產生的對于α毒素和主要超抗原(SEB或SEC)的免疫保護免受壞死性肺炎。
[0137]其他實施方式
[0138]雖然結合 具體說明描述了本發明，但上述說明旨在闡釋而非限制本發明的范圍，本發明的范圍由所附權利要求書所限定。其他方面、優勢和修改在以下權利要求的范圍內。
【權利要求】
1.一種包含兩種或更多種葡萄球菌類毒素的組合物，其特征在于，所述類毒素選自中毒性休克綜合征毒素-1 (TSST-1)類毒素、葡萄球菌腸毒素B (SEB)類毒素、葡萄球菌腸毒素C(SEC)類毒素、葡萄球菌腸毒素樣X(SEL-X)類毒素、α毒素類毒素、β毒素類毒素和Y毒素類毒素。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述TSST-1類毒素包含位點31的絲氨酸殘基和位點32的脯氨酸殘基。
3.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述TSST-1類毒素是融合蛋白。
4.如權利要求3所述的組合物，其特征在于，所述融合蛋白是人TSST-1的殘基1-89和綿羊TSST-1的殘基90-195的融合。
5.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述TSST-1類毒素包含位點135的丙氨酸殘基。
6.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述TSST-1類毒素包含位點136的丙氨酸。
7.如權利要求1-6中任一項所述的組合物，其特征在于，所述SEB類毒素包含下面的一種或多種:位點90的丙氨酸殘基，位點91的纈氨酸殘基，和位點210的丙氨酸殘基。
8.如權利要求1-7中任一項所述的組合物，其特征在于，所述SEC類毒素是SEC3類毒素。
9.如權利要求1或8所述的組合物，其特征在于，所述SEC類毒素包含位點90的丙氨酸殘基和/或位點210的丙氨酸殘基。
10.如權利要求1-9中任一項所述的組合物，其特征在于，所述α毒素類毒素包含位點35的売氣酸殘基。
11.如權利要求1-10中任一項所述的組合物，其特征在于，所述β毒素類毒素包含位點149的天冬酰胺和/或位點288的天冬酰胺。
12.如權利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含3種葡萄球菌類毒素。
13.如權利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含4種葡萄球菌類毒素。
14.如權利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含5種葡萄球菌類毒素。
15.如權利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含TSST-1類毒素、SEB類毒素、SEC類毒素、α毒素類毒素和β毒素類毒素。
16.如權利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含SEL-X類毒素。
17.如權利要求15或16所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含Y毒素類毒素。
18.如權利要求17所述的組合物，其特征在于，所述Y毒素類毒素是Y葡萄球菌毒素的單鏈。
19.如權利要求18所述的組合物，其特征在于，所述單鏈是Y葡萄球菌毒素的B鏈。
20.如權利要求1-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含SEC類毒素、SEB類毒素和α毒素類毒素。
21.如權利要求1-20中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含佐劑。
22.如權利要求21所述的組合物，其特征在于，所述佐劑選自不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑和鋁鹽。
23.一種在對象中誘導針對葡萄球菌菌株生成的兩種或更多種葡萄球菌外毒素的免疫應答的方法，所述方法包括向所述對象給予一定量的有效誘導所述免疫應答的藥物組合物，所述藥物組合物包含兩種或更多種葡萄球菌類毒素，其中所述類毒素選自中毒性休克綜合征毒素-1 (TSST-1)類毒素、葡萄球菌腸毒素B(SEB)類毒素、葡萄球菌腸毒素C(SEC)類毒素、葡萄球菌腸毒素樣X(SEL-X)類毒素、α毒素類毒素和β毒素類毒素。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述組合物通過皮下給藥。
25.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述組合物通過肌肉內給藥。
26.如權利要求23-25中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包含確定所述對象的血液是否包含具有對于一種或多種所述葡萄球菌類毒素的特異性結合親和力的抗體。
27.如權利要求23-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述菌株是甲氧西林耐藥性的。
28.如權利要求23-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述菌株是甲氧西林敏感的。
29.如權利要求23-26中任 一項所述的方法，其特征在于，所述菌株是USA400、USA300或USA200的分離物。
30.如權利要求23-29中任一項所述的方法，其特征在于，所述TSST-1類毒素包含位點31的絲氨酸殘基和位點32的脯氨酸殘基。
31.如權利要求23-29中任一項所述的方法，其特征在于，所述TSST-1類毒素是融合蛋白。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白是人TSST-1的殘基1-89和綿羊TSST-1的殘基90-195的融合。
33.如權利要求23-29中任一項所述的方法，其特征在于，所述TSST-1類毒素包含135位點的丙氨酸殘基。
34.如權利要求23-29中任一項所述的方法，其特征在于，所述TSST-1類毒素包含136位點的丙氨酸殘基。
35.如權利要求23-34中任一項所述的方法，其特征在于，所述SEB類毒素包含下面的一種或多種:位點90的丙氨酸殘基，位點91的纈氨酸殘基，和位點210的丙氨酸殘基。
36.如權利要求23-35中任一項所述的方法，其特征在于，所述SEC類毒素是SEC3類毒素。
37.如權利要求23-36中任一項所述的方法，其特征在于，所述SEC類毒素包含位點90的丙氨酸殘基和/或位點210的丙氨酸殘基。
38.如權利要求23-37中任一項所述的方法，其特征在于，所述α毒素類毒素包含位點35的売氣酸殘基。
39.如權利要求23-38中任一項所述的方法，其特征在于，所述β毒素類毒素包含位點149的天冬酰胺和/或位點288的天冬酰胺。
40.如權利要求23-39中任一項所述的方法，其特征在于，所述組合物包含3種葡萄球菌類毒素。
41.如權利要求23-39中任一項所述的方法，其特征在于，所述組合物包含4種葡萄球菌類毒素。
42.如權利要求23-39中任一項所述的方法，其特征在于，所述組合物包含TSST-1類毒素、SEB類毒素、SEC類毒素、α毒素類毒素和β毒素類毒素。
43.如權利要求42所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含SEL-X類毒素。
44.如權利要求42或43所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含Y毒素類毒素。
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，所述Y毒素類毒素是Y葡萄球菌毒素的單鏈。
46.如權利要求45所述的方法，其特征在于，所述單鏈是Y葡萄球菌毒素的B鏈。
47.如權利要求23-46中任一項所述的方法，其特征在于，所述組合物還包括佐劑。
48.如權利要求47所述的方法，其特征在于，所述佐劑選自不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑和鋁鹽。
49.一種包含TSST-1類毒素、SEC類毒素、葡萄球菌α毒素類毒素、葡萄球菌β毒素類毒素和Y葡萄球菌毒素的單鏈的組合物。
50.一種包含TSST-1類毒素、SEC類毒素和葡萄球菌α毒素類毒素的組合物。`
51.如權利要求49或50所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含SEB類毒素。
52.如權利要求49-51中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含佐劑。
53.如權利要求52所述的組合物，其特征在于，所述佐劑選自不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑和鋁鹽。
【文檔編號】A61K39/085GK103561762SQ201280023672
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年3月16日 優先權日:2011年3月16日
【發明者】P·M·施利弗特, M·L·彼德森 申請人:明尼蘇達大學董事會