抗-人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ抗體的制作方法

抗-人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ抗體的制作方法
【專利摘要】結合人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ(人PTPRS)的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。
【專利說明】抗-人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ抗體
【技術領域】
[0001]本發明涉及結合人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶O的抗體。在下文中，“蛋白酪氨酸磷酸酶”縮寫為ΡΤΡ，“受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶”縮寫為RPTP或PTPR，“受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ ”有時縮寫為RPTP-σ、PTP-σ或PTPRS，“人”和“小鼠”有時分別用前綴h和m表示。
【背景技術】
[0002]干擾素(在下文中，“干擾素”有時縮寫為IFN)是抗病毒免疫應答中最重要的細胞因子。人血液中的干擾素產生性細胞(IPC:1PC是未分化的淋巴細胞性樹突細胞，其被定位為樹突細胞(DC)的前體細胞。IPC有時也稱為漿細胞樣樹突細胞或類漿細胞樹突細胞(漿細胞樣樹突細胞:pDC)。在下文中，IPC和pDC在本文中被認為具有相同的含義，并且在下文中被術語PDC標準化為一般規則)與⑶4 一起表達主要組織相容性復合物II類蛋白質。然而，由于此類細胞的數目少并且細胞迅速引起細胞凋亡以及缺乏譜系標志物，因此此類細胞至今未被分離或詳細表征。已證明PDC是⑶4+⑶llc-2-類型樹突細胞前體細胞，以及在被微生物刺激后其產生的IFN是其它血液細胞產生的200至1000倍。因此，pDC2是抗病毒和抗腫瘤免疫應答中的決定性免疫系統效應細胞。
[0003]IFNa和IFNβ已知為具有抗病毒活性或抗腫瘤活性的I型IFN。在另一方面，已澄清IFNa與自身免疫疾病相關。例如，在患有下列自身免疫疾病的患者中報導了 IFNa的異常產生。此外，還表明了通過中和IFNa減輕自身免疫病況的可能性。
[0004]報導了全身性紅斑狼瘡(Shiozawa 等人，Arthr.&Rheum.35, 412, 1992)和慢性類風濕性關節炎(Hopkins等人，Clin.Exp.1mmuno173，88，1988),以及其中自身免疫疾病的病況通過施用重組IFNa 2或IFN被表達或惡化的實例(Wada等人，Am.J.Gastroenterol.90, 136, 1995 ；Perez 等人，Am.J.Hematol.49, 365, 1995 ；ffilson LE 等人,Semin Arthritis, Rheum.32, 163-173，2002)。
[0005]此外，還已闡明了 IFNa誘導樹突細胞(DC)的分化。由于樹突細胞也是抗原呈遞細胞，因此認為樹突細胞分化的誘導構成了自身免疫疾病的重要機制。事實上，有人建議IFNa對樹突細胞分化的誘導與全身性紅斑狼瘡的發作密切相關(Blanco等人，Science, 16:294, 1540-1543，2001)。因此，已指出了 IFN α的抗腫瘤活性及其與自身免疫疾病的密切關系。此外，IFNa還與銀屑病的發作密切相關(Nestle FO等人，J.Exp.Med.202，135-143，2005)。
[0006]只有少量pDC存在于血液中。有人認為外周血淋巴細胞中pDC的比率為1%或更少。然而，PDC具有極高的產生IFN的能力。pDC產生IFN的能力達到例如，3000pg/mL/104細胞。即，可以認為盡管細胞的數目少，但病毒感染時血液中的大部分IFNa或IFNP的產生由pDC帶來。
[0007]pDC通過病毒刺激分化成樹突細胞，以誘導T細胞產生IFN- Y和IL-10。此外，PDC還通過IL-3的刺激分化成樹突細胞。通過IL-3的刺激分化的樹突細胞誘導T細胞產生Th2細胞因子(IL-4、IL-5、IL-10)。因此，pDC具有下述特征:其取決于刺激的不同而分化成樹突細胞。
[0008]因此，pDC是具有兩個方面的細胞:一個是作為IFN產生性細胞的方面，另一個是作為樹突細胞的前體細胞的方面。兩種細胞在免疫系統中都起重要作用。即，pDC是從不同方面支持免疫系統的重要細胞之一。
[0009]為了控制體液因子例如IFN的活性，識別所述因子的抗體的施用是有效的。例如，利用抗白細胞介素(IL)-1或IL-4的抗體治療自身免疫疾病的嘗試已付諸實踐(Guler等人，Arthritis Rheum, 44，S307, 2001)。此外，有人認為中和的抗體可成為用于也牽涉干擾素(IFN)的自身免疫疾病的治療藥物(Stewart, TA.Cytokine Growth Factor Rev.14 ；139-154,2003)。可預期類似的方法對于由pDC產生的IFN是有效的。然而，這樣的方法基于產生的體液因子的作用的抑制。如果可直接控制目標(objective)體液因子的產生，則可獲得更關鍵的療效。
[0010]已報導了識別人pDC的抗體。例如，抗-BDCA-2單克隆抗體是特異于人pDC的單克隆抗體(Dzionek A.等人，J.1mmunol 165:6037-6046, 2000)。已闡明了抗-BDCA-2 單克隆抗體具有抑制人PDC的IFN產生的作用(J.Exp.Med.194:1823—1834，2001)。此外，還報導了識別小鼠干擾素產生性細胞的單克隆抗體抑制干擾素產生(Blood2004Junl ; 103/11:4201-4206.2003年12月電子版)。已報導了抗小鼠pDC的單克隆抗體減少樹突細胞的數量(J.1mmunol.2003，171:6466-6477)。
[0011]如果提供類似地識別人PDC并且可控制其活性的抗體，則其是有用的。例如，本發明的發明人已闡明識別Ly49Q的抗體特異性結合小鼠pDC。然而，抗Ly49Q的抗體不干擾小鼠 pDC 的活性(Blood, IApri 12005，第 105 卷，N0.7，pp.2787-2792:W02004/13325A1)。
[0012]蛋白磷酸酶是在糖原代謝的研究中發現的脫磷酸化酶。除了蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)以外，蛋白質絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、磷脂特異性磷酸酶等已被發現，這些酶形成了蛋白磷酸酶的超家族。在這些酶當中，蛋白酪氨酸磷酸酶是在于蛋白質的酪氨酸殘基中觀察到的可逆磷酸化修飾當中負責磷酸化的酶。在另一個方面，蛋白質酪氨酸激酶(PTK)被示例為在于蛋白質的酪氨酸殘基中觀察到的可逆磷酸化修飾中負責磷酸化的酶。
[0013]蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)將其細胞外結構域中的配體結合信息轉化成細胞內結構域的磷酸酶活性，據認為蛋白酪氨酸激酶(PTK)被配體的結合激活，而蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)通常被配體的結合滅活。因此，在蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)和蛋白酪氨酸激酶(PTK)中，配體的刺激都導致磷酸化水平的升高，而在信號性質上預期存在很大的差異。在蛋白酪氨酸激酶(PTK)的情況下，進行了其中受體彼此磷酸化和激活的正反饋控制，并且蛋白酪氨酸激酶(PTK)分子的局部激活傳遞至細胞膜上的其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)分子，從而磷酸化在寬范圍內增加。另一方面，在蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)中僅配體已結合的分子被滅活，并且底物的磷酸化僅局部增加。參與許多生理功能和細胞功能的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)在腦神經生物化學、免疫學、癌癥、糖尿病等的廣泛領域中得到大量關注(Division of Molecular Neurobiology, National Institute for Basic Biology 的主頁的拷貝，http://niwww3.nibb.ac.jp/RPTP.pdf)。
[0014]蛋白酪氨酸磷酸酶家族可被分類成具有細胞膜穿過區的受體類型和非受體類型。在哺乳動物中存在21種受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶(也縮寫為RPTP或PTPR)的分子，其被分成8個亞家族，每一個亞家族具有固有的細胞外結構，其中觀察到免疫球蛋白樣結構域、纖連蛋白類型III樣結構域、碳酸鹽脫水酶樣結構域、MAM結構域等(Nat Rev Mol CellBiol,第 7 卷，833-846，2006)。
[0015]人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ (這縮寫為hRPTP-σ、hPTP-σ或hPTPRS，在本文中主要使用縮寫hPTPRS)與LAR(白細胞抗原相關蛋白酪氨酸磷酸酶)及受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶S (ΡΤΡ-δ) —起屬于R2A亞家族。PTPR家族的酶在不同的組織(包括從動物的產生開始(initiation of generation)至成熟后的神經系統)中表達，但其很少的生理功能被闡明，因為配體分子和底物分子的鑒定不容易。
[0016]樹突細胞(DC)是活體中的主要抗原呈遞細胞，其存在于血液、淋巴組織等中，并且被粗略分類成髓樣樹突細胞(mDC)和漿細胞樣樹突細胞(pDC)。pDC在其細胞表面上選擇性表達TLR7和TLR9作為Toll樣受體，并且產生I型干擾素α和β，尤其是干擾素α。
[0017]最近的研究已闡明作用于樹突細胞以控制它們的成熟和活化的各種配體分子，且來自其受體的細胞內信號傳導機制(intracellular signal transmission mechanism)已變得清楚。然而，關于樹突細胞的功能的修飾和控制的機制還存在許多不清楚之處。與許多其它細胞中的闡明類似，蛋白質的磷酸化被認為也在樹突細胞中控制來自受體的信號傳導(signal transmission)、細胞的運動/遷移等中起著重要作用。
[0018]作為蛋白質磷酸化的負控制因子的蛋白磷酸酶是作為用于維持調節樹突細胞的活化和功能的信號的適當強度和長度的因子的優勢候選者。(Nobuhiro Tanuma(Institutefor Genetic Medicine, Hokkaido University), Northern Advancement Center forScience&Technology(縮寫:N0ASTEC)的主頁中的“樹突細胞成熟中誘導的酪氨酸磷酸酶的功能分析”，http://ww.noastec.jp/kinouindex/data2005/pdf/01/01_20.pdf)。
[0019]國際公布N0.W095/9656Al公開了 RPTP-σ (PTPRS)和編碼其的核酸；然而，公開的氨基酸序列是源自大鼠的氨基酸序列，所述公布未提及特異于PTPRS的抗體。國際公布N0.W095/9656A1也沒有公開抗-人PTPRS抗體。
[0020]國際公布N0.W02007/41317A1涉及特異性結合至少一種RPTP- σ或RPTP- δ (以抑制免疫細胞的免疫應答)或其抗原結合片段的分離的抗體。文獻描述了通過使用特異性結合RPTP的抗體，痘病毒多肽A41L和RPTP的結合被競爭性抑制，從而實現了免疫細胞的免疫應答的抑制。然而，該文獻沒有公開實際上獲得了特異性結合RPTP-σ (PTPRS)的抗體，就考慮實施例的描述而言，實施例僅僅證實了免疫細胞中表達的結合A41L的RPTP是屬于相同的R2A亞型的RPTP-σ、RPTP-δ和LAR的一部分并且制備了 LAR與Fe (LAR (Ig結構域)-Fe融合蛋白)的免疫球蛋白樣結構域的融合蛋白。難以說國際公布N0.W02007/41317A1公開了僅特異于RPTP- σ的抗體以及對其的制備。
[0021]僅結合RPTP-σ (即本申請中的PTPRS的特定位點)的抗體和可特異性結合RPTP- σ (PTPRS)但不結合屬于相同R2A亞型的RPTP- δ和LAR的抗體還未獲得。人PTPRS是其在pDC中的表達被觀察到的分子，但任何抗人PTPRS的抗體直至現在仍未獲得。
[0022]引文列表
[0023]專利文獻
[0024]PTLl:W02004/13325A1
[0025]PTL2:W095/9656A1[0026]PTL3:W02007/41317A1
[0027]非專利文獻
[0028]NPLlShiozawa 等人，Arthr.&Rheum.35, 412, 1992
[0029]NPL2.Hopkins 等人，Clin.Exp.1mmunol.73，88，1988
[0030]NPL3.Wada 等人,Am.J.Gastroenterol.90, 136, 1995
[0031]NPL4Perez 等人,Am.J.Hemato1.49, 365, 1995
[0032]NPL5ffilson LE et al, Semin Arthritis.Rheum.32, 163-173，2002
[0033]NPL6Blanco 等人，Science, 16:294，1540-1543，2001
[0034]NPL7Nestle FO 等人，J.Exp.Med.202，135-143，2005
[0035]NPL8Guler 等人，Arthritis Rheum., 44.S307, 2001
[0036]NPL9Stewart, TA.Cytokine Growth Factor Rev.14 ; 139-154，2003
[0037]NPLlO:Dzionek, A.等人 J.1mmunol.165:6037-6046, 2000
[0038]NPLll:J.Exp.Med.194:1823-1834, 2001
[0039]NPL12:Blood2004Junl;103/11:4201-4206.Epub2003Dec
[0040]NPL13:J.1mmunol.2003，171:6466-6477
[0041]NPL14:Blood, lApril2005, Vol.105，N0.7，pp.2787-2792
[0042]NPL15:http://niwww3.nibb.ac.jp/RPTP.pdf
[0043]NPL16:Nat Rev Mol Cell Biol.，Vol.7，833-846，2006
[0044]NPLl7:
[0045]http://www.noastec.jp/kinouindex/data2005/pdf/01/01_20.pdf發明概述
[0046]技術問題
[0047]本發明的目的是提供結合人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ (人PTPRS，hRPTP- σ )的抗體以及檢測、鑒定或分離pDC。此外，本發明的目的是調節pDC的活性。
[0048]本發明的發明人通過與人pDC相關的研究證實了 PTPRS在pDC中的表達被特異性增強。因此，本發明試圖制備PTPRS的抗體和闡明其作用。
[0049]為了獲得識別痕量的來源于活體的蛋白質的抗體，通常將利用通過基因重組技術制備的蛋白質用作免疫原。本發明的發明人已嘗試基于已被闡明的人PTPRS的cDNA序列以及關于由其編碼的氨基酸序列的信息表達人PTPRS (GenBank登錄號NM_002856.3)。
[0050]為了獲得蛋白質的抗體，通常嘗試將天然蛋白質的部分氨基酸序列用作免疫原。然而，為了使抗體識別細胞表面上的分子，應當選擇這樣的區域:其構成被抗體識別為細胞表面上的表位的部分。因此，認為通過使用片段氨基酸序列作為免疫原來獲得特異于人PTPRS的抗體還是遙遠的。
[0051]問題的解決
[0052]在這樣的情形下，本發明的發明人已闡明結合pDC的抗體可通過使用特殊的免疫原來獲得。此外，他們還已確認所獲得的抗體特異性識別人PDC并且具有調節其活性的作用，且完成了本發明。
[0053]因此，本發明涉及下列抗-人PTPRS抗體，用于產生所述抗體的方法及其應用。[0054]本發明如下。
[0055](I)結合人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ (APTPRS)的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。
[0056](2)根據上述(I)的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，其結合漿細胞樣樹突細胞。
[0057](3)由以登錄號FERM BP-11356保藏的雜交瘤9H5-4、以登錄號FERM BP-11357保藏的雜交瘤10F7-38、以登錄號FERM BP-11358保藏的雜交瘤13G5-52、以登錄號FERMBP-11359保藏的雜交瘤13G5-57、以登錄號FERM BP-11360保藏的雜交瘤14A8-85、以登錄號FERM BP-11361保藏的雜交瘤22H8-84、以登錄號FERM BP-11362保藏的雜交瘤49F2-30、以登錄號FERM BP-11363保藏的雜交瘤55E7-79產生的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。
[0058](4)產生根據上述⑴或(2)的任何單克隆抗體的雜交瘤。
[0059](5)由以登錄號FERM BP-11356保藏的雜交瘤9H5-4、以登錄號FERM BP-11357保藏的雜交瘤10F7-38、以登錄號FERM BP-11358保藏的雜交瘤13G5-52、以登錄號FERMBP-11359保藏的雜交瘤13G5-57、以登錄號FERM BP-11360保藏的雜交瘤14A8-85、以登錄號FERM BP-11361保藏的雜交瘤22H8-84、以登錄號FERM BP-11362保藏的或雜交瘤49F2-30或以登錄號FERM BP-11363保藏的雜交瘤55E7-79產生的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。
[0060](6)用于產生單克隆抗體的方法，其包括培養根據上述(5)的雜交瘤和從培養物收集單克隆抗體。
[0061](7)用于產生細胞的方法，所述細胞產生結合人PTPRS的單克隆抗體，所述方法包括:
[0062]I)給經免疫接種的動物施用表達包括人PTPRS的細胞外結構域的外源蛋白質的細胞，和
[0063]2)從經免疫接種的動物的抗體產生性細胞選擇產生結合人PTPRS的抗體的抗體產生性細胞。
[0064](8)根據上述(7)的方法，其中表達人PTPRS的細胞是表達地保持編碼包括人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列的外源多核苷酸的細胞。
[0065](9)根據上述(8)的方法，其中細胞是動物細胞。
[0066](10)根據上述(9)的方法，其中細胞是人來源的細胞。
[0067](11)根據上述(10)的方法，其中人來源的細胞是HEK-293T細胞。
[0068](12)根據上述(7)至(11)的任一項的方法，其還包括克隆所獲得的抗體產生性細胞。
[0069](13)用于產生結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體的方法，所述方法包括培養通過根據上述(9)的方法獲得的抗體產生性細胞，和從培養物收集單克隆抗體。
[0070](14)識別人PTPRS的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，所述抗體可通過下列步驟獲得:
[0071]I)給經免疫接種的動物施用外源地表達包括人PTPRS的細胞外結構域的蛋白質的細胞；[0072]2)從經免疫接種的動物的抗體產生性細胞選擇產生結合人PTPRS的抗體的抗體產生性細胞；和
[0073]3)培養(2)中選擇的抗體產生性細胞，和從培養物收集識別人PTPRS的抗體。
[0074](15) (a)用于產生結合人PTPRS的抗體的免疫原，其包括外源地且表達地保持編碼包括人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列的多核苷酸的動物細胞，或其細胞膜級分。
[0075](16)根據上述(15)的免疫原，其中動物細胞為人來源的細胞。
[0076](17)用于檢測漿細胞樣樹突細胞的方法，其包括將結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段與受試細胞接觸，和檢測已結合細胞的單克隆抗體，或包括其抗原結合區的片段。
[0077](18)用于檢測漿細胞樣樹突細胞的試劑，其包括結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體，或包括其抗原結合區的片段。
[0078](19)用于抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的方法，其包括將下列組分的任一種與漿細胞樣樹突細胞接觸:
[0079](a)結合人PTPRS以抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，和
[0080](b)已對其移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白，或包括其抗原結合區的片段。
[0081](20)用于抑制活體中的漿細胞樣樹突細胞的活性的方法，其包括給活體施用任意下列組分:
[0082](a)結合人PTPRS以抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，和
[0083](b)已對其移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白，或包括其抗原結合區的片段。
[0084](21)根據上述(19)或(20)的方法，其中漿細胞樣樹突細胞的活性是干擾素產生性活性和干擾素產生性細胞的存活之一或兩者。
[0085](22)用于抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的試劑，其包括任意下列組分作為活性成分:
[0086](a)結合人PTPRS以抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，
[0087](b)已對其移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白，或包括其抗原結合區的片段。
[0088](23)用于抑制根據上述(22)的干擾素產生性細胞的活性的試劑，其中漿細胞樣樹突細胞的活性是干擾素產生性活性和干擾素產生性細胞的存活之一或兩者。
[0089]本發明的有利效應
[0090]本發明提供了特異性識別人PTPRS(用于產生抗體的免疫原)的抗體和用于利用免疫原產生抗-人PTPRS抗體的方法。人PTPRS是屬于RPTP家庭的膜蛋白。本發明的發明人闡明了特異性識別人PTPRS的抗體可被容易地獲得。可通過本發明獲得的抗-人PTPRS抗體是具有高度特異性的抗體，其區分人PDC與表達其它RPTP家族的細胞。
[0091]在優選實施方案中，本發明提供的抗-人PTPRS抗體結合人pDC。此外，發明的抗體特異性識別人pDC。因此，其可用于檢測和分離pDC。pDC是產生大部分I型IFN的細胞。因此，其檢測和分離在其中牽涉pDC的疾病(例如自身免疫疾病)的診斷和研究中是重要的。
[0092]此外，本發明提供的抗-人PTPRS抗體在優選實施方案中具有調節人pDC的活性的作用。因此，本發明的抗-人PTPRS抗體可用于抑制pDC的活性。因此，如果使用本發明的抗體抑制PDC的活性，則即使在具有其中IFNa的表達已增強的自身免疫疾病的患者中，亦可預期治療效果。
[0093]pDC通過極少的細胞產生大量IFN。為了中和IFN，對應于IFN的分子數的抗體是必需的。然而，在本發明中，產生的細胞的活性被直接抑制。因此，相較于通過抗-1FN抗體的中和，利用更少量的抗體可預期產生更強的抑制IFN的效應。此外，在當持續產生IFN的情況下，預期抗體對IFN的中和僅被瞬時抑制，然而pDC的活性被抑制，從而在本發明中可預期長期的抑制IFN產生的效應。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0094]圖1是PTPRS的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。PTPRS是在細胞外區域中具有免疫球蛋白樣結構域(Ig-樣結構域)和纖連蛋白III型樣結構域的單跨膜膜蛋白。此外，其在細胞內區域中具有兩個蛋白酪氨酸磷酸酶區域(PTP結構域)；
[0095]圖2是顯示不同免疫細胞中PTPRS的相對表達水平的圖。已顯示PTPRS以pDC特異性方式表達；
[0096]圖3是顯示組織之間PTPRS基因的表達的比較的圖。PTPRS mRNA在脾和卵巢中顯示相對高的表達，并且也在其它組織中廣泛地表達；
[0097]圖4顯示通過FACS分選進行的表達人PTPRS (hPTPRS)的細胞的選擇；
[0098]圖5顯示使用經免疫接種的hPTPRS/D2SC/l細胞進行的雜交瘤的FACS篩選。獲得了 13個產生抗-hPTPRS抗體的雜交瘤；
[0099]圖6顯示使用CAL-1細胞進行的FACS篩選；
[0100]圖7顯示使用人外周血pDC進行的FACS篩選；
[0101]圖8是顯示hPTPRS與其它PTPR的同源性的圖。PTPRS屬于PTPR家族，此家族的數個家族分子的氨基酸序列與PTPRS的氨基酸序列具有高度同源性；
[0102]圖9是顯示10個類型的識別并且產生特異性結合人pDC的抗體的雜交瘤細胞培養上清液(2G6、4B2、2G2、9H5、10F7、22H8、49F2、14A8、55E7、13G5)是否僅特異性結合PTPRS (hPTPRE不在細胞表面上表達)的測試結果。作為其結果，2G6顯示與PTPRF的交叉反應性(圖9，D)，4B2顯示與PTPRD的交叉反應性(圖9，C)。其它9個類型的抗體顯示PTPRS特異性結合(圖9，A至D)；
[0103]圖10是抗-PTPRS抗體與猴的交叉反應性的測試結果。所有雜交瘤細胞培養上清液特異性結合食蟹猴的PDC細胞群(譜系-CD123+HLA-DR+)；
[0104]圖11顯示雜交瘤的單個化(singlization)分選。單細胞分選通過使用FACSAria(BD)來進行，D2SC/1 細胞和 hPTPRS/D2SC/l 細胞(A 和 B) ,CAL-1 細胞(C)和人 pDC(D)是通過使用雜交瘤的細胞培養上清液來進行染色的，選擇單個雜交瘤；
[0105]圖12顯示獲自雜交瘤的培養上清液的純化的抗體中的內毒素的濃度。所有濃度是標準值0.3Eu/mg Ab或更小；[0106]圖13是純化的抗體結合細胞表面上的人PTPRS的能力的測試結果。可確認所有抗體維持它們的結合能力；
[0107]圖14顯示純化的抗體對人外周血的pDC細胞群(BDCA2+)的特異性結合；
[0108]圖15是測試抗-人PTPRS抗體是否也結合小鼠PTPRS的測試結果。49F2-30、13G5-52U3G5-57 和 22H8-14 結合至 mPTPRS/CHO ；
[0109]圖16顯示抗hPTPRS表達性細胞的抗-PTPRS抗體的補體依賴細胞毒性活性。測量抗人PTPRS/CH0(圖16A)和小鼠PTPRS/CH0 (圖16B)的抗-PTPRS抗體的補體依賴細胞毒性活性。作為結果，13G5-52和13G5-57顯示約20%的抗人PTPRS/CH0的靶標的CDC活性(A)，而13G5-52和13G5-57顯示約100%的抗小鼠PTPRS/CH0的靶標的CDC活性(B)；
[0110]圖17 顯示抗-hPTPRS 嵌合抗體的 ch49F2_30 (圖 17A)、ch9H5_4、chl3G5_57 和ch22H8-84(圖17B)以效應細胞數目依賴性方式損傷靶hPTPRS/CHO ;和
[0111]圖18 顯示 IFNa 的產生完全被具有 ch49F2-30、ch9H5-4、chl3G5_57 和 ch22H8_84的抗-PTPRS嵌合抗體的處理抑制了(圖18A),已闡明pDC群體在對照抗體的Synagis處理中減少更多(圖18B和圖18C)。
[0112]實施方案的描述
[0113]人PTPRS是在漿細胞樣樹突細胞pDC中觀察到其特異性表達的分子。然而，用于產生識別人PTPRS的抗體的任何方法仍未建立。
[0114]已知人PTPRS的4個同種型，其包括由1948個氨基酸殘基組成的同種型1、由1910個氨基酸殘基組成的同種型2、由1501個氨基酸殘基組成的同種型3和由1505個氨基酸殘基組成的同種型4。在其結構中，觀察到作為細胞外結構的3個免疫球蛋樣結構域(第一Ig結構域、第二 Ig結構域和第三Ig結構域)、纖連蛋白II I型樣結構域、跨膜結構域(跨膜結構域，TM區域)以及作為細胞內結構的兩個磷酸酶結構域(Dl和D2結構域)。僅與細胞膜接近的Dl結構域具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。在圖1中，信號肽和典型的結構域在氨基酸序列中被標記出來。
[0115]人PTPRS的同種型3是包括SEQ ID NO:1的831至851 (圖1)作為跨膜結構域的穿膜蛋白。在包括N末端的1501個氨基酸殘基中，29個氨基酸殘基(SEQ ID N0:1中的I至29)構成信號序列，30至830構成細胞外結構域。在另一方面，C末端側是細胞內結構域。認為細胞外環境中的配體控制PTPRS的活性。
[0116]本發明的發明人已通過基因表達分析證實了人PTPRS在人pDC中特異性表達。他們認為，如果可獲得可區分人PTPRS與其它分子的抗體，則其可用于pDC的研究。然而，存在許多具有在包括人PTPRS的PTP家族中的相似結構的分子。分子例如為RPTP- σ和PTPRA (RPTP- a )、PTPRD (RPTP- δ )、PTPRE (RPTP- ε、PTPRF (RPTP- ζ )的 PTPRS 特別地包括具有高度同源性的氨基酸序列(圖8)。因此，他們認為難以通過使用結構域肽、使用構成細胞外結構域的氨基酸序列的部分序列作為免疫原來獲得可將這些分子彼此區分的抗體。因此，本發明的發明人嘗試通過使用表達人PTPRS作為免疫原的細胞來獲得抗人PTPRS的抗體。
[0117]本發明的發明人已進行了詳盡的研究以獲得識別人PTPRS的抗體，闡明了目標抗體可通過使用特定的轉化性細胞作為免疫原來獲得，且完成了本發明。即，本發明涉及結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。[0118]在本發明中，人PTPRS可被定義為在人pDC中表達的天然分子，或在免疫學上與在ApDC中表達的人PTPRS等同的分子。在本發明中，可以例如如下確認抗體結合人PTPRS。
[0119]-基于與人細胞的反應性的確認:
[0120]根據本發明的發明人獲得的發現，認為人PTPRS可用作pDC的標志物，因為觀察到特異于人pDC的表達。
[0121]基于人PTPRS的這樣的表達譜，首先，pDC結合至少一部分亞組的活性是本發明中結合人PTPRS的抗體的重要特征之一。特定細胞是pDC可通過對于每一個細胞群而言是固有的細胞表面標志物來確認。例如，對目標細胞的結合通過利用結合細胞表面標志物的抗體和其結合活性待確認的抗體的雙染色來確認。即，本發明的PDC包括例如表達BDCA2的細胞。
[0122]-基于與表達人PTPRS基因的轉化細胞的反應性的確認:
[0123]本發明的發明人已確認，當在特定條件下表達人PTPRS基因時，重構了在人pDC中表達的人PTPRS的免疫學特征。因此，與人PTPRS的反應性可基于抗已將編碼人PTPRS的基因人工地引入其中的細胞的抗體的反應性來確認。即，本發明涉及單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，所述單克隆抗體結合包括構成人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列作為細胞外結構域的分子。同時，細胞外結構域由對應于SEQ ID NO:1的30至830的氨基酸序列(圖1)(從SEQ ID NO:1中顯示的氨基酸序列的N末端)構成。
[0124]例如，在已用包括編碼人PTPRS的DNA的表達載體轉化的細胞中，在人pDC中表達的PTPRS的免疫學特征得到維持。因此，表達人PTPRS的轉化細胞優選作為本發明中用于確認抗人PTPRS的細胞外結構域的抗體的結合性質的細胞。當在本發明中通過轉化細胞來確認抗體的反應性時，希望利用未被轉化的細胞作為對照。
[0125]隨后，本發明中結合人PTPRS的抗體可以是其與已知表達除人PTPRS外的PTP家族的細胞群的交叉反應性被觀察到或未被觀察到的抗體。其交叉反應性未被觀察到的抗體優選為本發明中結合人PTPRS的抗體。具體地，優選下述抗體作為本發明中結合人PTPRS的抗體:在與證實同PDC結合的條件相同的條件下，與已知表達除人PTPRS外的PTP家族的細胞群相結合的抗體。
[0126]S卩，本發明中結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體優選包括具有下列免疫學特征的單克隆抗體。
[0127]a)其結合人pDC，
[0128]b)在其中其結合人pDC的條件下，其對選自單核細胞、巨噬細胞、B細胞和CD34陽性細胞以及源自這類細胞的樹突細胞中一種或多種的結合不能被確認。
[0129]具體地，在其中抗體結合人pDC的條件下，其對選自單核細胞、巨噬細胞、B細胞和CD34陽性細胞以及源自這類細胞的樹突細胞中一種或多種的結合不能被確認的抗體優選作為本發明的單克隆抗體。
[0130]或者,本發明中結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體優選包括具有下列免疫學特征的單克隆抗體。
[0131]c)其結合已用表達地保持編碼人PTPRS的DNA的表達載體轉化的轉化細胞，
[0132]d)在用于結合c)中的轉化細胞的條件下，在c)中的轉化之前對宿主細胞的結合不能被確認。[0133]在本發明中，抗-人PTPRS單克隆抗體不與PTP家族中的其它分子交叉反應可通過使用其中已強制表達每一個PTP家族的細胞來確認。即，編碼每一個PTP家族的氨基酸序列的CDNA通過被引入適當的宿主細胞而被強制表達。將其交叉反應性待確認的抗-人PTPRS單克隆抗體與獲得的轉化細胞接觸。隨后，如果沒有觀察到與表達除人PTPRS外的其它PTP家族分子的細胞的結合，則可確認抗體可在免疫學上區分人PTPRS與其它PTP家族分子。例如，在下述實施例中，證實了通過本發明獲得的大多數抗-人PTPRS單克隆抗體不與特別地與PTPRS具有高度同源性的PTPRA、PTPRD和PTPRF交叉反應。因此，結合人PTPRS并且其在相同條件下對PTPRA、PTPRD和PTPRF的結合未被檢測到的單克隆抗體是本發明的優選單克隆抗體。如果使用可在免疫學上將這類PTP家族分子與PTPRS相區別的抗體，則可特異性地檢測到PTPRS的表達的變化。此外，已證明，在與PTPRS具有高度同源性的分子當中，可在細胞中確認PTPRE的表達，但PTPRE不在細胞外表達。因此，其不作為抗體結合PTPRE。
[0134]其結合活性待確認的單克隆抗體與各種細胞之間的結合可利用例如流式細胞術的原理來確認。為了利用流式細胞術的原理來確認抗體的反應性，預先用產生可檢測信號的分子或原子團來標記抗體是有利的。通常地，使用熒光標記物或發光標記物。為了利用流式細胞術的原理分析熒光標記抗體與細胞之間的結合，可使用熒光激活的細胞分選儀(FACS)。通過利用FACS，可有效地確認多種抗體與細胞之間的結合。
[0135]具體地，例如，將已預先闡明能夠鑒定pDC的抗體A和其結合pDC的性質有待分析的抗體B與一組包括pDC的細胞同時反應。預先利用可彼此區分的熒光信號標記抗體A和抗體B。如果在相同的細胞群中檢測到兩種信號，則可確認那些抗體結合相同的細胞群。即，可發現，抗體A和抗體B具有相同的結合性質。如果它們結合不同的細胞群，則很明顯它們的結合性質不同。
[0136]本發明的優選單克隆抗體的實例可包括由雜交瘤9H5-4，10F7-38, 13G5-52、13G5-57、14A8-85、22H8-84、49F2-30 或 55E7-79 產生的單克隆抗體。
[0137]雜交瘤9H5-4、10F7-38、13G5-52、13G5-57、14A8-85、22H8-84、49F2-30 和 55E7-79分別以登錄號 FERM BP-11356, FERM BP-11357, FERM BP-11358, FERM BP-11359, FERMBP-11360,FERM BP-1136UFERM BP-11362 和 FERM BP-11363 于 2011 年 4 月 I 日保藏在專利微生物保藏國立技術和評價研究所(Patent Microorganisms Depositary of NationalInstitute of Technology and Evaluation)。在下文中，將描述關于說明保藏的內容。
[0138](a)保藏機構的名稱:專利微生物保藏國立先進工業科學與技術研究所(PatentMicroorganisms Depositary of National Institute ofAdvanced Industrial Scienceand Technology)
[0139]地址:TsukubaCentral6.l-l-lHigashi, Tsukuba, Ibaraki305_8566,日本
[0140](b)保藏日期:2011年3月17日
[0141](c)登錄號 FERM BP_11356(雜交瘤 9冊_4)
[0142](c)登錄號 FERM BP-11357 (雜交瘤 IOF7-38)
[0143](c)登錄號 FERM BP-11358(雜交瘤 13G5-52)
[0144](c)登錄號 FERM BP-11359(雜交瘤 13G5-57)
[0145](c)登錄號 FERM BP-1l36O (雜交瘤 14A8-85)[0146](c)登錄號 FERM BP-11361 (雜交瘤 22肋_84)
[0147](c)登錄號 FERM BP-11362 (雜交瘤 49F2-30)
[0148](c)登錄號 FERM BP-11363 (雜交瘤 55E7-79)
[0149]本發明的單克隆抗體可以是包括其抗原結合區的片段。例如，包括通過IgG的酶促消化產生的抗原結合部位的抗體片段也可用作本發明的抗體。具體地，抗體片段例如Fab或F (ab’) 2可通過利用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶進行消化來獲得。眾所周知，這類抗體片段可用作具有對于抗原的結合親和力的抗體分子。或者，只要必需的抗原結合活性得到維持，還可使用通過基因重組體構建的抗體。通過基因重組構建的抗體的實例可包括嵌合抗體、CDR移植抗體、單鏈Fv、雙體(diabody)、線性抗體、由抗體片段形成的多特異性抗體等。用于基于單克隆抗體或產生單克隆抗體的抗體產生性細胞獲得這類抗體的方法是已知的。
[0150]本發明的單克隆抗體可使用特定轉化細胞作為免疫原來獲得。即，本發明涉及用于產生細胞的方法，所述細胞產生結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體，所述方法包括:
[0151](I)給經免疫接種的動物施用表達包括人PTPRS的細胞外結構域的外源蛋白質的細胞，和
[0152](2)從經免疫接種的動物的抗體產生性細胞選擇結合人PTPRS的抗體產生性細胞。
[0153]通過培養如此獲得的抗體產生性細胞或已被永生化的抗體產生性細胞，可從培養物收集目標單克隆抗體。對于用于永生化抗體產生性細胞的方法，各種方法是已知的。
[0154]用作本發明的免疫原的轉化細胞可以通過例如制備下列細胞來獲得，所述細胞表達地保持外源多核苷酸，其(a)編碼包括人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列。
[0155]在本發明中，外源多核苷酸是指多核苷酸已被人工地引入宿主細胞。在當將人細胞用作細胞的情況下，將人基因引入人細胞。還在這樣的組合中，人工引入的多核苷酸被稱為外源多核苷酸。因此，人PTPRS的異位表達包括在外源多核苷酸的表達中。
[0156]在本發明中，人PTPRS的細胞外結構域是指來自30至830位置的氨基酸序列，其對應于SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列的細胞外結構域。例如，從下述N端一側按順序包括各區域的氨基酸序列優選為本發明中包括人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列。
[0157][信號序列+細胞外結構域+跨膜結構域+細胞內區域]
[0158]或者，部分缺乏如下細胞內區域的氨基酸序列也被涵蓋在本發明的包括人PTPRS細胞外結構域的氨基酸序列中。
[0159][信號序列+細胞外結構域+跨膜結構域+細胞內區域的部分]
[0160]此外，如下缺乏細胞內區域的結構也包括在本發明的包括人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列中。
[0161][信號序列+細胞外結構域+跨膜結構域]
[0162]在上述結構中，除細胞外結構域外的區域可具有選自SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的序列，或可組合地包括其它同源氨基酸序列。例如，構成信號序列、跨膜結構域和細胞內區域的氨基酸序列可以是除人PTPRS外的PTP家族分子的氨基酸序列。
[0163]或者，可組合除人外的物種的PTP家族的氨基酸序列。此外，構成除細胞外結構域外的區域的氨基酸序列可包括至可維持各區域的功能的程度的突變。此外，可將其它區域插入各區域之間。例如，可將表位標簽例如FLAG插入信號序列與細胞外結構域之間。具體地，信號序列是被翻譯成蛋白質的區域，在至細胞膜表面的轉移階段被加工，并且被除去。因此，誘導經翻譯的蛋白質的細胞膜通過的任何氨基酸序列可被用作信號序列。更具體地，人PTPRS的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)優選為包括人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列。
[0164]因此，對于構成本發明中的上述(a)的多核苷酸，可使用編碼構成上述結構[信號序列+細胞外結構域+跨膜結構域+細胞內區域]的氨基酸序列的任何堿基序列。例如，SEQ ID NO:1的氨基酸序列由SEQ ID N0:2中描述的堿基序列編碼。
[0165]在本發明中，為了獲得待用作免疫原的轉化細胞，僅需引入這樣的表達載體，其中上述多核苷酸(a)表達地被保持在適當的宿主細胞中。
[0166]本發明中的宿主細胞優選是哺乳動物細胞。具體地，來源于人、猴、小鼠或大鼠的細胞可用作宿主細胞。
[0167]具體地，人來源的細胞優選為宿主細胞。例如，HEK-293T細胞為優選的人胚胎來源的腎細胞系，其可被用作本發明中的宿主細胞。HEK-293T細胞可作為ATCC CRL-11268被獲得。來源于經免疫接種的動物的其它細胞也可用作宿主細胞。當來源于經免疫接種的動物的細胞被用作免疫原時，抗宿主細胞的免疫應答是小的。因此，可有效地獲得抗外源地表達的人PTPRS的細胞外結構域的抗體。因此，例如，當將小鼠被用作經免疫接種的動物時，小鼠來源的細胞也可被用作宿主細胞。
[0168]可通過在可在宿主細胞中誘導表達的載體上加載多核苷酸來將上述多核苷酸轉化進入細胞。可使用可在哺乳動物細胞中誘導表達的商購可得的載體。表達載體例如pCMV-Script (R)載體、pSG5 載體(由 Stratagene 生產的)和 pcDNA3.1 (由 Invitrogen 生產的)可用于本發明。
[0169]必要時，可將如此獲得的轉化細胞與額外的組分(例如佐劑)一起向經免疫接種的動物施用。作為佐劑，可使用弗氏完全佐劑等。在當將小鼠用作經免疫接種的動物的情況下，可以以IO4至IO9個細胞，更具體地IO4至IO6個細胞施用轉化細胞。一般而言，以一定的間隔施用免疫原多次，直至抗體滴度增加。例如，在短期免疫過程的情況下，可以2至4天、特別是3天的間隔施用轉化細胞，且可在2至3次施用后收集抗體產生性細胞。或者，在以約每周一次的間隔施用5至6次后，可收集抗體產生性細胞。
[0170]在本發明中，克隆收集的抗體產生性細胞以獲得單克隆抗體。為了進行克隆，優選永生化抗體產生性細胞。例如，細胞融合過程例如雜交瘤過程或利用EB病毒(Epstein-Barr Virus) (EBV)的轉化可用作用于永生化抗體產生性細胞的過程。
[0171]在抗體產生性細胞中，一個細胞產生一種類型的抗體。因此,如果可建立(例如，克隆)源自一個細胞的細胞群，則可獲得單克隆抗體。雜交瘤過程是指其中將抗體產生性細胞與適當的細胞品系融合、永生化和克隆的過程。永生化抗體產生性細胞可利用技術(例如有限稀釋法)來克隆。可用于雜交瘤過程的許多細胞品系是已知的。這些細胞品系具有不同的遺傳標記，所述遺傳標記在基于淋巴細胞的細胞的永生化效率方面是出色的并且是選擇在細胞融合中獲得成功的細胞所必需的。此外，在當意欲獲得抗體產生性細胞時，還可使用缺乏抗體產生性能力的細胞品系。
[0172]例如，小鼠骨髓瘤P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580)和 P3x63Ag8U.1 (ATCCCRL-1597)被廣泛地用作在小鼠和大鼠中用于細胞融合過程的細胞品系。一般而言，雜交瘤通過融合同源細胞來制備，但單克隆抗體可獲自密切相關的異源性異種雜交瘤(heterohybridoma)。
[0173]細胞融合的具體方案是已知的。即，將經免疫接種的動物的抗體產生性細胞與適當的融合伴侶混合以進行細胞融合。對于抗體產生性細胞，使用脾細胞、從淋巴結收集的淋巴細胞、外周血B細胞等。作為融合伴侶，可使用上面已提及的各種細胞株。為了進行細胞融合，使用聚乙二醇法或電融合法。
[0174]隨后，基于由融合細胞具有的選擇標記選擇在細胞融合中獲得成功的細胞。例如，在當HAT敏感性細胞品系被用于細胞融合的情況下，通過選擇在HAT培養基中生長的細胞來選擇在細胞融合中獲得成功的細胞。此外，確認了由選擇的細胞產生的抗體具有所欲的反應性。
[0175]基于抗體的反應性篩選每一個雜交瘤。即，產生結合人PTPRS的抗體的雜交瘤是通過上述方法來選擇的。優選地，亞克隆選擇的雜交瘤，在當最后確認了目標抗體產生的情況下，其被選擇為產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤。
[0176]具體地，可基于與人細胞的反應性或與表達人PTPRS基因的轉化細胞的反應性選擇目標雜交瘤。結合細胞的抗體可通過免疫測定的原理來檢測。例如，利用細胞作為抗原的ELISA可用于檢測目標抗體。具體地，將雜交瘤的培養上清液與在其上固定了用作免疫原的人pDC或轉化細胞的支持物接觸。在當培養上清液包括目標抗體的情況下,抗體被固定在支持物上的細胞捕獲。隨后，將固相與培養上清液分離，必要時進行洗滌，從而可檢測到被捕獲在固相上的抗體。可將識別抗體的抗體用于檢測抗體。例如，可利用抗-小鼠免疫球蛋白抗體檢測小鼠抗體。如果預先標記識別抗體的抗體，其檢測則是容易的。作為標記物，可利用酶、熒光色素、發光色素等。
[0177]在另一方面，作為用于固定細胞的支持物，可利用顆粒、微量滴定板的內壁。可通過在顆粒或塑料制造的容器的表面上進行物理吸附來固定細胞。例如，由聚苯乙烯制造的珠粒或反應容器可用作固定細胞的支持物。
[0178]在雜交瘤的選擇中，預期在一些情況下產生不針對人PTPRS但針對用作免疫原的轉化細胞的宿主細胞的抗體。例如，如實施例中所示，當將人細胞用作免疫原且將小鼠用作經免疫接種的動物時，人細胞被識別為外來物質，預期產生結合其的抗體。本發明目的在于獲得識別人PTPRS的抗體。因此，不必獲得識別除人PTPRS外的人細胞抗原的抗體。為了通過篩選排除產生這樣的抗體的雜交瘤，可在確認抗體的反應性之前，預先吸附非期望的抗體。
[0179]可利用其存在是期望的抗體所結合的抗原吸附非期望的抗體。具體地，例如，抗除人PTPRS外的人細胞抗原的抗體可被其中不能檢測到人PTPRS的表達的細胞吸附。在本發明中，用作免疫原的宿主細胞優選為用于吸附非期望的抗體的抗原。
[0180]必要時，確認單克隆抗體(其對抗原的結合活性已被確認)對pDC的活性的實際作用。對PDC的作用可通過例如下述方法來確認。
[0181]可從通過培養產生單克隆抗體的雜交瘤獲得的培養物收集本發明的單克隆抗體。可體外或體內培養雜交瘤。可通過使用已知培養基例如RPMI1640來體外培養雜交瘤。在培養上清液中，積累由雜交瘤分泌的免疫球蛋白。因此，本發明的單克隆抗體可通過收集培養上清液和必要時純化來獲得。免疫球蛋白的純化在當未將血清添加至培養基的情況下更容易。然而，為了更快地增殖雜交瘤和加速抗體的產生，可將約10%的胎牛血清添加至培養基。
[0182]還可體內培養雜交瘤。具體地,通過將雜交瘤接種在裸小鼠的腹腔中,可將雜交瘤培養在腹腔中。單克隆抗體在腹水中積累。因此，期望的單克隆抗體可通過收集腹水和必要時純化來獲得。可根據目的適當地修飾或加工獲得的單克隆抗體。
[0183]本發明的單克隆抗體可通過從雜交瘤獲得編碼抗體的抗原結合區的cDNA，將其插入適當的表達載體來表達。用于獲得編碼抗體的可變區的cDNA和在適當的宿主細胞中表達的技術是已知的。此外，用于將包括抗原結合區的可變區結合至恒定區以形成嵌合抗體的技術也是已知的。
[0184]例如，作為本發明的優選單克隆抗體，可提供由如下雜交瘤產生的單克隆抗體:以登錄號FERM BP-11356保藏的雜交瘤9H5-4、以登錄號FERM BP-11357保藏的雜交瘤10F7-38、以登錄號FERM BP-11358保藏的雜交瘤13G5-52、以登錄號FERM BP-11359保藏的雜交瘤13G5-57、以登錄號FERM BP-11360保藏的雜交瘤14A8-85、以登錄號FERM BP-11361保藏的雜交瘤22H8-84、以登錄號FERM BP-11362保藏的雜交瘤49F2-30或以登錄號FERMBP-11363保藏的雜交瘤55E7-79等。
[0185]作為包括可變區的嵌合抗體或已對其移植了構成可變區的CDR的人源化抗體、具有源自IgG或IgM的恒定區的抗體被涵蓋在本發明的優選抗體中。本發明的發明人已證實了抗PTPRS的單克隆抗體具有抗PTPRS表達性細胞的⑶C作用。因此，具有源自IgG或IgM的恒定區的抗體具有通過CDC作用產生的抗PTPRS表達性細胞的細胞毒性作用。此類抗體可用于抑制PTPRS表達性細胞例如pDC的細胞數目。
[0186]識別人PTPRS的嵌合抗體或人源化抗體可通過基因工程，通過使用編碼抗體的多核苷酸來產生。
[0187]自在W02007/041317(JP2009-510102A)中闡明人PTPRS的結構以來已過去大約4年；然而，仍未獲得可特異性識別人PTPRS的抗體。識別人PTPRS的抗體首先由本發明的免疫原提供。即，本發明提供了識別人PTPRS的抗體，其可通過下列過程獲得:
[0188](I)向經免疫接種的動物施用包括人PTPRS的細胞外結構域的蛋白質；
[0189](2)從經免疫接種的動物的抗體產生性細胞選擇產生結合人PTPRS的抗體的抗體產生性細胞；和
[0190](3)培養在(2)中選擇的抗體產生性細胞，和從培養物收集識別人PTPRS的抗體。
[0191]已闡明了人PTPRS在人pDC中特異性表達。人pDC中的特異性表達也在基因表達分析中由本發明的發明人利用SAGE確認了。然而，在過去的報導中，在所有情況中基于mRNA分析了人PTPRS的表達水平。由于未提供使得能夠通過其檢測人PTPRS的抗體，過去未分析蛋白質的表達狀態。由本發明提供的結合人PTPRS的細胞外結構域的抗體實現了人PTPRS蛋白的分析。
[0192]根據由本發明的發明人作出的實際確認，基于本發明的結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體特異性地檢測人PDC。即，本發明涉及用于檢測漿細胞樣樹突細胞的方法，其包括使結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段與受試細胞接觸，以及檢測已結合至細胞的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。
[0193]通過基于本發明檢測人PTPRS，可確認特定細胞是否是pDC。即，本發明提供了使用人PTPRS作為指標(index)來鑒定pDC的方法。或者，可通過分離其中已按照本發明檢測到人PTPRS的細胞來分離人pDC。即，本發明提供了使用人PTPRS作為指標分離pDC的方法。
[0194]在本發明中，可預先標記結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。例如，可通過用發光色素或熒光色素標記來容易地檢測抗體。更具體地，使熒光色素標記的抗體與可能包括PDC的細胞集合體接觸，從而可使用熒光色素作為指標來檢測本發明的抗體所結合的細胞。此外，如果分離了其中已檢測到熒光色素的細胞，可分離pDC。可通過FACS的原理容易地進行這系列方法。
[0195]或者，可預先將本發明的抗體結合至固相支持物例如磁性顆粒。結合至固相支持物的抗體識別人PTPRS，且pDC被固相支持物捕獲。因此，可檢測和分離pDC。
[0196]基于本發明的檢測PDC所需的抗體可作為用于檢測pDC的試劑被提供。即，本發明提供用于檢測PDC的試劑，其包括結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。對于本發明的用于檢測PDC的試劑，除了抗體以外，可組合陽性對照或陰性對照。例如，表達人PTPRS的細胞外結構域的轉化細胞(其用作免疫原)、從人收集的PDC等可用作陽性對照。通常地，僅可從外周血獲得極少人pDC。因此，轉化細胞特別優選地作為本發明的試劑的陽性對照。在另一方面，不表達人PTPRS的任何細胞可用作陰性對照。
[0197]即，本發明提供用于檢測人PDC的試劑盒，其包括結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段。
[0198]此外，本發明的發明人已分析了結合的人PTPRS的細胞外結構域的抗體對pDC的作用。因此，他們已確認結合人PTPRS的細胞外結構域的抗體抑制pDC的活性。S卩，本發明涉及用于抑制干擾素產生性細胞的活性的方法，其包括將下列中的任何組分與PDC接觸:
[0199](a)結合人PTPRS以抑制pDC的活性的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，和
[0200](b)已對其移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白或包括其抗原結合區的片段。
[0201]或者，本發明涉及用于抑制活體中pDC的活性的方法，所述方法包括向活體施用下列組分中的任何組分:
[0202](a)結合人PTPRS以抑制pDC的活性的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，
[0203](b)已對其移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白，或包括其抗原結合區的片段，和
[0204](c)編碼(a)或(b)中描述的組分的多核苷酸。
[0205]在本發明中，pDC是指具有產生IFN的能力，且在細胞表面上表達人PTPRS的細胞。在下文中，除非另有所指，否則PDC不僅包括作為樹突細胞的前體細胞的細胞而且還包括具有產生IFN的能力且在細胞表面上表達人PTPRS的細胞。用于鑒定這樣的PDC的方法是已知的。例如，可使用幾個細胞表面標記作為標志將pDC與其它血液細胞相區別。具體地，人pDC的細胞表面標記的特征譜如下(Shortman, K.和Liu, YJ, NatureReviews2:151-161，2002)。近年來還報導了 BDCA-2陽性細胞被定位為pDC (Dzionek, A.等人 J.1mmunol.165:6037-6046, 2000)。
[0206][人pDC的細胞表面抗原的特征譜][0207]CD4陽性、CD 123陽性譜系(CD3、⑶14、⑶16、⑶19、⑶20、⑶56)陰性、CDllc陰性
[0208]因此，具有這些已知標記的表達特征譜以及還具有產生IFN的能力的細胞也可被稱為pDC。此外，甚至一組具有不同于這些標記的表達特征譜的表達模式的特征譜的細胞、活體中具有產生IFN的能力的細胞，所述細胞被涵蓋在pDC中。
[0209]此外，作為通常在人pDC中觀察到的特征，可顯示下列特征。
[0210][細胞形式的特征]
[0211]-其類似于漿細胞。
[0212]-其是具有光滑細胞表面的圓形細胞。
[0213]-其具有相對大的細胞核。[細胞的功能特征]
[0214]-其在病毒感染過程中在短期內產生大量I型IFN。
[0215]-其在病毒感染后分化成樹突細胞。
[0216]在本發明中，pDC的活性的抑制是指抑制至少一個由pDC具有的功能。作為pDC的功能，可顯示IFN的產生和細胞存活。換句話說，細胞存活可被認為是細胞數目。
[0217]因此，這些功能的一個或兩個的抑制是指pDC的活性的抑制。已闡明由pDC產生的I型IFN引起各種疾病。因此，其可作為用于那些疾病的治療策略用于抑制pDC的細胞數目和IFN的產生。
[0218]例如，指出了自身免疫疾病的病理狀況與IFNa之間的關系。大多數IFNa由pDC產生。因此，如果其產生被抑制，則可減輕由IFNa帶來的病理狀態。同時，在本發明中，pDC對IFN產生的抑制是指抑制由pDC產生的IFN當中的至少一種類型的IFN的產生。I型IFN是本發明的優選IFN。在這些IFN當中，IFNa是重要的。
[0219]S卩，本發明涉及用于抑制IFN產生的試劑，其包括結合人PTPRS的細胞外結構域的抗體作為活性成分。或者，本發明提供了用于抑制IFN的產生的方法，所述方法包括施用結合人PTPRS的細胞外結構域的抗體。此外，本發明涉及結合人PTPRS的細胞外結構域的抗體用于產生用于抑制IFN的產生的藥物組合物的用途。
[0220]pDC包括產生由少數細胞產生的大量IFN的細胞。例如，已用病毒等刺激的樹突細胞的前體細胞產生大部分由活體產生的IFN。產生大量IFN的pDC的細胞數目的抑制因而導致IFN的產量的抑制。因此，由IFNa帶來的病理狀況還可通過抑制pDC的細胞數目來減輕。
[0221]在本發明的優選實施方案中，證實了抗-人PTPRS單克隆抗體結合人PTPRS表達性細胞并且通過CDC(補體依賴細胞毒性)作用賦予細胞毒性作用。CDC作用是抗體藥劑的重要作用機制之一。本發明的抗-人PTPRS單克隆抗體還具有通過其CDC作用產生的抗人PTPRS表達性細胞(例如pDC)的強細胞毒性作用。即，除在優選實施方案中IFN產生的抑制機制以外，還可預期通過抗PDC的細胞毒性作用產生的抑制IFN產生的作用。
[0222]可基于先前所述的方法獲得本發明中所用的識別人PTPRS的細胞外結構域的抗體。本發明的抗體可以是任何類別的。此外，抗體所源自的生物的種類也不受限制。此外，包括抗體的抗原結合區的片段可用作抗體。例如，通過IgG的酶促消化產生的包括抗原結合部位的抗體片段也可被用作本發明的抗體。具體地，可通過利用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的消化來獲得抗體片段例如Fab或F(ab’)2。眾所周知，這類抗體片段可用作具有對于抗原的結合親和力的抗體分子。或者，還可使用通過基因重組而構建的抗體，只要其維持必需的抗原結合活性。通過基因重組構建的抗體的實例可包括嵌合抗體、CDR移植抗體、單鏈Fv、雙體和線性抗體以及由抗體片段形成的多特異性抗體等。用于基于單克隆抗體獲得此類抗體的方法是已知的。
[0223]在本發明中，必要時可修飾抗體。根據本發明，識別人PTPRS的細胞外結構域的抗體具有抑制PDC的活性的作用。即，考慮了抗體本身具有抗PDC的細胞毒性作用的可能性。顯示強效應子作用的抗體亞類是已知的。或者，通過利用細胞毒性物質(細胞毒性劑)修飾抗體，可進一步增強抑制PDC的活性的作用。
[0224]細胞毒性物質的實例可包括下列物質。
[0225]毒素:假單胞桿菌內毒素(PE)、白喉毒素
[0226]賴氨酸
[0227]放射性同位素元素:Tc99m、Sr89、1131、Y90
[0228]抗癌劑:加利車霉素、絲裂霉素C、紫杉酚
[0229]可利用雙功能試劑將由蛋白質構成的毒素結合至抗體或其片段等。或者，可將編碼毒素的基因連接至編碼抗體的基因以產生兩個基因的融合蛋白。用于將放射性同位素元素結合至抗體的方法也是已知的。例如，通過使用螯合劑，利用放射性同位素元素標記抗體的方法是已知的。此外，可通過使用糖鏈或雙功能試劑將抗癌劑結合至抗體。
[0230]在本發明中，其結構已被人工修飾的抗體也可用作活性成分。例如，用于改善抗體的細胞毒性作用和穩定性的各種修飾方法是已知的。具體地，其中重鏈的糖鏈已被修飾的免疫球蛋白是已知的(Shinkawa, T.等人，J.Biol.Chem278:3466-3473.2003.)。通過修飾糖鏈，免疫球蛋白的ADCC(抗體依賴細胞介導的細胞毒性)活性得到增強。
[0231]當將結合人PTPRS的細胞外結構域的抗體與pDC接觸時，其活性被抑制。因此，這類抗體可用于用來抑制PDC的活性的試劑或方法。即，本發明提供了用于抑制pDC的活性的試劑，所述試劑包括至少一種類型的選自下列(a)-(c)的組分作為活性成分。或者，本發明涉及用于抑制PDC的活性的方法，所述方法包括施用至少一種類型的選自下列(a)-(c)的組分。此外，本發明涉及選自下列(a)-(c)的組分用于產生用來抑制pDC的活性的試劑的用途。
[0232](a)結合人PTPRS的細胞外結構域的抗體或包括其抗原結合區的片段，和
[0233](b)對其已移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白，或包括其抗原結合區的片段。
[0234]在本發明中，作為抑制pDC的活性的單克隆抗體，可利用識別人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體。在本發明中，可利用一個類型或多個類型的單克隆抗體。例如，可將多個類型的識別人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體并入且用于本發明中。
[0235]可如下確認抗體具有抑制pDC的IFN產生性活性的作用。pDC通過病毒的刺激產生大量IFN。通過在利用病毒刺激之前或之后，或與利用病毒刺激的同時提供抗pDC的抗體，和使用未對其提供抗體的PDC作為對照，比較產生IFN的能力。可通過測量包括在pDC的培養上清液中的IFN-α和IFN-β來評估產生IFN的能力。作為比較的結果，當上清液中的IFN的量因添加抗體而顯著減少時，可確認測試的抗體具有抑制產生IFN的能力的作用。用于測量此類IFN的方法是已知的。pDC是在活體中產生大部分IFN的細胞。因此，通過抑制pDC產生IFN的能力，可調節活體中IFN的產生的狀態。[0236]在本發明中，pDC的活性包括pDC的細胞數目的維持。因此，本發明的pDC的活性抑制包括抑制pDC的細胞數目。如果確認pDC的細胞數目在抗體存在的情況下被抑制，則發現抗體抑制PDC的活性。作為用于比較的對照，可如在IFN的產生中一樣使用源自動物的惰性免疫球蛋白，所述惰性免疫球蛋白所源自的動物與對于其活性待確認的抗體而言的動物的物種相同。可通過計算細胞的數目定量比較PDC的細胞數目。可利用FACS或顯微鏡來計算細胞數目。
[0237]此外，作為被病毒等的感染的結果，還認為pDC分化成稱為DC2 (樹突細胞2)的誘導Th2的細胞。如果可抑制通過病毒刺激引起的pDC的IFN產生，也有可能可抑制分化成為Th2。因此，對于抑制IFN產生的本發明的單克隆抗體可預期對各種變應性疾病(allergydisease)的治療性作用。
[0238]在當向宿主(其與抗體所源自的生物體物種不同)施用識別人PTPRS的細胞外結構域的抗體的情況下，期望將抗體加工成幾乎不被宿主識別為外來物質的形狀。例如，通過加工成下列分子，免疫球蛋白可變得難以被識別為外來物質。用于如下加工免疫球蛋白分子的技術是已知的。
[0239]-缺乏恒定區的包含抗原結合區的片段(MonoclonalAntibodies principlesand Practice,第 3 版,Academic Press Limited.1995;Antibody Engineering,APractical Approach, IRL PRESS, 1996)
[0240]-由單克隆抗體的抗原結合區和宿主的免疫球蛋白的恒定區構成的嵌合抗體(Experimental Manual for Gene Expression, Kodansha Ltd.，1994(由 Isao Ishida 和Tamie Ando 編著的))
[0241]-通過用單克隆抗體的⑶R替換宿主的免疫球蛋白中的互補決定區(OTR)獲得的CDR置換抗體(Experimental Manual for Gene Expression, Kodansha Ltd.，1994 (由 IsaoIshida 和 Tamie Ando 編著))。
[0242]或者，人的免疫球蛋白可變區基因可通過噬菌體展示法來獲得(McCafferty J.等人，Nature348:552-554, 1990 ；Kretzschmar T 等人，Curr Opin Biotechno12002Dec:13(6) =598-602.)。在噬菌體展示法中，將編碼人免疫球蛋白可變區的基因整合進入噬菌體基因。噬菌體文庫可通過使用各種免疫球蛋白基因作為來源來制備。噬菌體將可變區表達為構成噬菌體本身的蛋白質的融合蛋白。由噬菌體表達的噬菌體表面上的可變區維持與抗原的結合活性。因此，通過選擇結合已表達抗原的細胞或抗原等的噬菌體，可從噬菌體文庫篩選已表達具有期望的結合活性的可變區的噬菌體。
[0243]此外，將編碼具有期望的結合活性的可變區的基因保留在通過這樣的方式選擇的噬菌體顆粒中。即，在噬菌體展示法中，編碼具有期望的結合活性的可變區的基因可通過使用可變區的結合活性作為指標來獲得。
[0244]在根據本發明的用于抑制pDC的活性的試劑或方法中，可將識別人PTPRS的細胞外結構域的抗體或包括至少其抗原結合區的抗體片段作為蛋白質或編碼所述蛋白質的多核苷酸施用。為了施用多核苷酸，期望利用下述載體:已將編碼期望的蛋白質的核苷酸置于適當的啟動子的控制之下，以便可表達期望的蛋白質。還可將增強子或終止子置于載體上。可保留構成免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的基因并且可表達免疫球蛋白分子的載體是已知的。可表達免疫球蛋白的載體可通過弓I入細胞來施用。在對活體的施用中，可原樣施用可通過給活體施用來傳遞給細胞的載體。
[0245]或者，可將載體引入曾與活體體分離的淋巴細胞，隨后將其返回活體(離體)。
[0246]在根據本發明的用于抑制pDC的活性的試劑或方法中，有待作為免疫球蛋白給活體施用的單克隆抗體的量通常為每公斤體重0.5mg至IOOmg,例如每公斤體重Img至50mg,優選每公斤體重2mg至10mg。可適當調整向活體施用抗體的間隔，以便可維持治療期過程中活體中的免疫球蛋白的有效濃度。具體地，可以以I至2周的間隔施用抗體。施用途徑是任選的。本領域技術人員可適當地選擇用于療法的有效施用途徑。具體地，可顯示口服或胃腸外施用。例如，可通過靜脈內注射、肌內注射、腹膜內注射或皮下注射等全身性或局部施用抗體。本發明中適用于胃腸外施用的制劑的實例可包括注射劑、栓劑、氣霧劑等。此夕卜，當將抗體提供給細胞時，提供通常為I μ g/mL,優選10μ g/mL或更多，更優選50μ g mL或更多，更優選0.5mg/mL或更多的免疫球蛋白。
[0247]在根據本發明用于抑制pDC的活性的試劑或方法中，可通過任何方法給活體施用單克隆抗體。一般而言，將單克隆抗體與藥學上可接受的載體混合。必要時，可向所述單克隆抗體中摻入添加劑例如增稠劑、穩定劑、防腐劑和增溶劑。這樣的載體或添加劑的實例可包括乳糖、檸檬酸、硬脂酸、硬脂酸鎂、蔗糖、淀粉、滑石、明膠、瓊脂、植物油、乙二醇等。術語“藥學上可接受的”是指已被每一個國家的政府的監管機構接受，或列于每一個國家的藥典中或關于在動物、哺乳動物中，特別是人中使用被普遍認可的藥典中。用于抑制本發明的PDC的活性的試劑可以以凍干的粉劑或片劑(包括一個劑量或多個劑量)形式存在。還可將凍干的粉劑或片劑與可注射無菌水、生理鹽水或緩沖液組合以用于溶解組合物，從而在施用之前提供期望的濃度。
[0248]此外，當以表達免疫球蛋白的載體的形式施用時，考慮到可將重鏈和輕鏈作為分開的質粒共轉染，可以以每公斤體重0.1至IOmg,例如每公斤體重I至5mg施用每一種質粒。此外，為了在體外引入細胞，使用I至5yg的載體/IO6個細胞。
[0249]在下文中，通過參考實施例更詳細地解釋本發明。
[0250]將本文中引用的所有現有技術文獻通過弓I用并入本文。
[0251]在下文中，通過參考實施例，將更詳細地解釋本發明，但本發明不被解釋為受實施例所限。
實施例
[0252]實施例1
[0253]A.PTPRS的表達的分析
[0254]A-1)使用SAGE文庫的分析
[0255]利用SAGE?(Serial Analysis of Gene Expression 基因表達系列分析)法比較和分析基因在人單核細胞、pDC和利用單純皰疹病毒(HSV)處理的pDC中的表達。分析方法如下。
[0256]利用細胞分選儀將單核細胞分離為CD14陽性細胞，并將pDC作為BDCA-4陽性細胞與人外周血單核細胞分離。此外，在HSV存在的情況下培養pDC12小時以制備活化的pDC。從各細胞獲得RNA，通過使用1-SAGE?試劑盒(Invitrogen)制備SAGE文庫。利用SAGE分析軟件(InvitiOgen)分析具有約100000個標簽的所獲得的堿基序列數據。作為結果，作為具有為0/7/0的單核細胞/pDC/pDC+HSV的評分值的基因(即顯示pDC特異性表達的基因)，發現了 已知的基因:PTPRS(GenBank Acc_M_002856.3)。PTPRS 由 SEQ ID NO:2 中所示的堿基序列編碼。此外，其是在細胞外區域中具有免疫球蛋白樣結構域(Ig-樣結構域)和纖連蛋白III型樣結構域的單跨膜結構域。此外，其在細胞內區域具有兩個蛋白酪氨酸磷酸酶區域(PTP結構域)(圖1)。
[0257]A-2)通過定量RT-PCR分析PTPRS mRNA在不同的人免疫活性細胞中的表達
[0258]更詳細地分析PTPRS在免疫細胞中的表達。通過細胞分選儀從人外周血分離每一個細胞。從分離的每一個細胞群體提取RNA，合成cDNA。使用獲得的cDNA作為模板，按照一般方法進行定量RT-PCR以分析PTPRS mRNA的表達水平。通過用已知恒定地表達的GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因的表達水平進行歸一化，比較免疫細胞之間的PTPRS基因的表達。
[0259]所使用的引物的堿基序列和用于PCR的條件如下。
[0260]PTPRS 的正向引物:5' CAC GGC CTATGA CCT CCA3’ (SEQ ID NO:3)
[0261]PTPRS 的反向引物:5，AAG TTC TTG GGC GAG ACT TG 3’ (SEQ ID NO:4)
[0262]GAPDH 的正向引物:5，CCA CCC ATG GCAAAT TCC3’ (SEQ ID NO:5)
[0263]GAPDH 的反向引物:5，TGG GAT TTC CAT TGATGA CAA G 3’ (SEQ ID NO:6)
[0264]I個循環，在50°C進行2分鐘，
[0265]I個循環，在95°C進行10分鐘，和
[0266]50個循環[在95°C進行15秒，和在60°C進行60秒]。
[0267]分析了單核細胞、pDC、利用HSV刺激的pDC、B細胞(CD19+細胞)、T細胞(CD3+細胞)、利用PMA(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯)刺激的活化的T細胞和NK細胞(⑶56+細胞)，已顯示PTPRS以pDC特異性方式表達。此外，發現如下特征=PTPRS的表達被利用HSV刺激的pDC減少(圖2)。
[0268]A-3)通過定量RT-PCR分析PTPRS mRNA在人組織中的表達
[0269]此外，使用ABI PRISM7000 (Applied Biosystem),通過定量PCR研究組織中的表達。作為cDNA小組(panel)，使用BD? MTC多組織cDNA小組(人I ;目錄號636742，人免疫；目錄號636748,人血液級分；目錄號636750 ;全部來自Becton Dickinson)。所使用的引物的堿基序列示于下面。
[0270]PTPRS 的正向引物:5，ACT CAC CCA CAC CCT ACA AGA 3’ (SEQ ID NO:7)
[0271]PTPRS 的反向引物:5，CTT GGT GGT ACG GCC ATC3’ (SEQ ID NO:8)
[0272]GAPDH 的正向引物:5，CCA CCC ATG GCAAAT TCC3’ (SEQ ID NO:5)
[0273]GAPDH 的反向引物:5’TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3’ (SEQ ID NO:6)
[0274]通過使用SYBR green PCR master mix試劑盒(Applied Biosystem),利用可從相同公司獲得的ABI PRISM7000進行PCR。可從相同公司獲得的序列檢測系統軟件被用于分析。反應條件如下。
[0275]步驟1:1個循環，在50°C進行2分鐘
[0276]步驟2:1個循環，在95 °C進行10分鐘
[0277]步驟3:40個循環，在95°C進行15秒和在60°C進行I分鐘
[0278]通過用已知恒定表達的GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因的表達水平進行歸一化，比較組織之間的PTPRS基因的表達。作為結果，PTPRS mRNA廣泛地在組織中表達(圖3)。
[0279]B.PTPRS表達載體的制備
[0280]為了表達PTPRS蛋白，進行PTPRS基因的表達載體的制備。僅將PTPRS基因從已被整合進入PCR4-T0P0克隆載體(Open Biosystem cc#MHS1010-98052887)和被整合進入pcDNA3.1表達載體(PTPRS/pcDNA3.1)的PTPRS cDNA克隆中取出。通過使用獲得的PTPRS/pcDNA3.1質粒作為模板，利用包含EcoR1、Not I和Kozak序列(GCC GCC ACC)的引物(關于引物的信息示于下文中)擴增PTPRS基因。將PCR產物在EcoRI和Not I位點克隆到pMX-1P逆轉錄病毒載體中(PTPRS/pMX-1P)。為了進行PCR反應，使用一個單位的KOD PlusDNA聚合酶(TOYOBO)，反應條件為I個循環(在94°C進行2分鐘)和25個循環[在94°C進行15秒和在68°C進行4分鐘30秒]。
[0281]正向引物(SEQID NO:9):5，aaa GAA TTC gcc gcc acc ATG GCG CCC ACC TGGGGC CCT3，
[0282]反向引物(SEQID NO:10):5’aaa gcg gcc gcT TAG GTT GCA TAG TGG TCAAAGC3，
[0283]在上述堿基序列中，小寫字符代表限制性酶EcoRI的切割位點或Not I的位點。5’末端處的aaa是用于酶促切割的額外堿基。
[0284]C.人PTPRS (hPTPRS)表達性細胞的制備
[0285]為了產生包含PTPRS基因的逆轉錄病毒，使用FuGENE試劑盒(Roche)，利用PTPRS/PMX-1P和逆轉錄病毒包裝載體PCL-ECO瞬時轉染作為人胚胎的腎細胞品系的HEK-293T細胞。兩天后，收集其中病毒包括hPTPRS基因的細胞培養上清液，利用為源自BALB/c小鼠的脾的樹突細胞的D2SC/1細胞(這基于Paglia等人，J.Exp.Med.，178，1893-1901 (1993)來制備)進行感染。由于PMX-1P逆轉錄載體包括嘌呤霉素抗性基因，通過利用嘌呤霉素培養感染的D2SC/1細胞使得僅有表達hPTPRS的細胞可能存活，從而使選擇變得可能。通過FACS分選選擇hPTPRS表達性D2SC/1細胞，并進行培養。為了確認hPTPRS的表達，將10 μ g/mL的山羊IgG(SantaCruz)和商購可得的hPTPRS多克隆抗體(pAb ；R&D)添加至所選的hPTPRS/D2SC/l細胞(各100 μ L)，將混合物于4°C溫育30分鐘。利用PBS洗滌細胞，隨后添加50 μ L的稀釋100倍的FITC-標記的抗-山羊IgG抗體(SantaCruz)，將混合物在4°C溫育30分鐘。在用PBS洗滌后，利用FACSCalibur(BD)輸入數據(圖4)。
[0286]實施例2
[0287]A.抗-人PTPRS單克隆抗體的制備
[0288]A-1)免疫
[0289]作為用作免疫原的細胞，使用上述hPTPRS/D2SC/l細胞。麻醉BALB/c小鼠，以每只足50yL將弗氏完全佐劑(CFA)乳劑皮下注射至足墊。總量為IOOyL/小鼠。在第二天，通過使用作為免疫原制備的hPTPRS/D2SC/l細胞和弗氏不完全佐劑(IFA)來制備乳劑，將其皮下注射至足墊(50 μ L/足，總量100 μ L/小鼠)。每兩天進行免疫接種一次，總共進行3次,在最后一次免疫接種后3天收集引流淋巴結(drawing lymph node)。
[0290]A-2)細胞融合
[0291]從經免疫接種的小鼠的兩只足收集引流淋巴結，將其與已在包含10%FBS的RPMI1640培養基(SIGMA)中培養的小鼠骨髓瘤細胞P3_X63_Ag8.563混合，使得淋巴結細胞與骨髓瘤細胞的比率成為5:4，通過離心收集細胞。將PEG1500 (Roche)添加至混合的細胞用于細胞融合。洗滌融合的細胞(雜交瘤)，將所述融合細胞培養于包含細胞生長補充劑+HAT (Sigma) -RPMI1640培養基(包含2mM L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、IOmM HEPES, ImM丙酮酸鈉、50 μ Μ2-ΜΕ)的10%胎牛血清(FBS)中。
[0292]Α-3)使用經免疫接種的hPTPRS/D2SC/l細胞進行的雜交瘤的FACS篩選
[0293]將50 μ L 制備成 2.5 μ g/ml 的抗-CD16/32 (2.4G2)添加至 3xl05/ 孔的 D2SC/1 細胞或hPTPRS/D2SC/l細胞以封閉FC受體。在用PBS洗滌后，添加制備成10 μ g/ml的山羊IgG、商購可得的抗-hPTPRS pAb(R&D)、小鼠IgG2ak(BioLegend)和培養的雜交瘤的培養上清液(各60 μ L)，將混合物在4°C溫育60分鐘。在用PBS洗滌后，將稀釋50倍的FITC-標記的抗-山羊IgG抗體和稀釋100的PE-標記的抗-小鼠IgG抗體(BD)添加至細胞(各50 μ L),將混合物在4°C避光溫育30分鐘。在用PBS洗滌后，將細胞懸浮于200 μ L的PBS中。利用FACS Calibur(BD)收集數據。通過FSC和SSC的二維點圖(dot plot)開發所收集的數據以門控活細胞。收集數據直到該門控中的細胞的數據達到2000個計數。作為結果，可獲得 13 個產生抗-hPTPRS 抗體的雜交瘤(2G6、28GIO、4B2、2G2、9H5、10F7、22H8、49F2、9D2、14A8、55E7、13G5、16H2)(圖 5)。
[0294]A-4)使用CAL-1細胞的FACS篩選
[0295]將3xl05個人pDC樣細胞品系CAL-1細胞在50 μ L的上述每一種雜交瘤的培養上清液中進行染色，在4°C進行15分鐘。利用FACS緩沖液(1%FBS+PBS)洗滌細胞一次，隨后離心以除去上清液。隨后將2 μ g/ml的PE-標記的抗-小鼠IgG抗體在4V反應20分鐘。用FACS緩沖液洗滌細胞一次并離心。利用FACS緩沖液重懸浮細胞沉淀，利用Calibur進行分析。作為結果，雜交瘤培養上清液中的2G6、4B2、2G2、9H5、10F7、22H8、49F2、14A8、55E7、13G5和16H2與CAL-1充分良好。在另一方面，28G10和9D2反應極小(圖6)。
[0296]A-5)使用人外周血pDC進行的FACS篩選
[0297][人PBMC的分離]
[0298]從健康人收集20ml的外周血，使用HIST0PAQUE-1077 (SIGMA)，通過比重離心分離外周血單核細胞(PBMC)。利用每一種樣品對IxlO6個PBMC進行染色。利用FACS緩沖液洗滌細胞，以25 μ L、5倍稀釋添加Fe封閉試劑(Mililenyi)，在4°C進行反應15分鐘。在用FACS緩沖液洗滌后，添加50 μ L的每種雜交瘤的細胞培養上清液、10 μ g/ml的山羊IgG、抗-hPTPRS pAb和小鼠IgG2a，κ，在4°C進行反應20分鐘。在用FACS緩沖液洗滌后，添加8 μ g/ml的FITC-標記的抗-山羊IgG抗體或2 μ g/ml的PE-標記的抗_小鼠IgG抗體，在4°C進行反應20分鐘。在用FACS緩沖液洗滌后，將50 μ L的稀釋10倍的APC-標記的抗-BDCA2抗體在4°C反應20分鐘。在用FACS緩沖液洗滌后，將細胞重懸于300 μ L的FACS緩沖液中，利用 FACS calibur 進行分析。作為結果，2G6、28G10、4B2、2G2、9H5、10F7、22H8、49F2、14A8、55E7和13G5顯示特異于pDC細胞群體的結合反應。9D2顯示對pDC的結合，并且還顯示與除pDC(BDCA2_)外的細胞群的反應。16H2未顯示對于PBMC的反應(圖7)。
[0299]對抗-PTPRS抗體的特異性的測試
[0300]PTPRS屬于PTPR家族，來自其的幾個家族分子的氨基酸序列具有針對PTPRS的氨基酸序列的高度同源性(圖8)。[0301]A-6)檢查10個類型的雜交瘤細胞培養上清液是否僅特異性結合PTPRS，所述雜交瘤培養上清液產生識別PTPRS并且特異性結合人pDC的抗體(2G6、4B2、2G2、9H5、10F7、22H8、49F2、14A8、55E7、13G5)。通過將FLAG標簽表達至分子的N末端來制備與PTPRS具有特別高同源性的PTPRA (40%) ,PTPRD (76%)和PTPRF (67%)的經轉染的細胞，并對所述細胞進行染色。利用Western印跡來確認hPTPRE在轉染的細胞中的表達，但不能確認在細胞表面上的表達。因此，hPTPRE不在細胞表面上表達。作為結果，4B2與hPTPRD反應(圖9C)，2G6顯示與hPTPRF的交叉反應性(圖9D)。其它8種類型的抗體顯示PTPRS特異性結合(圖9A-D)。
[0302]A-7)抗-PTPRS抗體對猴的交叉反應性
[0303]使用HIST0PAQUE-1077 (SIGMA)通過比重離心從外周血(10ml ；Shin-NipponBiomedical Laboratories, Ltd.)分離食蟹猴的PBMC。為了進行FACS,每樣品使用5x10s個細胞。利用FACS緩沖液洗滌細胞，將10 μ L的利用FACS緩沖液稀釋的10%的食蟹猴血清添加至其中，使反應在4°C進行20分鐘。在用FACS緩沖液洗滌后，添加100 μ L的每一種雜交瘤的細胞培養上清液和10 μ g/ml的小鼠IgG2a, κ或小鼠IgGl, κ (BioLegend)，使反應在4°C進行15分鐘。在利用FACS緩沖液洗滌后，添加I μ g/ml的APC標記的抗-小鼠IgG抗體(BD)，使反應在4°C進行20分鐘。在用FACS緩沖液洗滌后，以25 μ L、以10倍稀釋，使FITC-標記的抗-譜系抗體(BD)、ΡΕ-標記的抗-CD123抗體(BD)和PerCP7Cy5.5-標記的抗-HLA-DR抗體(BD)在4V反應15分鐘。在利用FACS緩沖液洗滌后，將細胞重懸浮于300 μ L的FACS緩沖液中，利用FACS calibur進行分析。作為使用的雜交瘤培養上清液，選擇了 7種為PTPRS特異性并且良好地結合CAL-1細胞和人pDC的類型:49F2、55E7、14A8、13G5、10F7、22H8和9H5。作為結果，所有雜交瘤細胞培養上清液特異性結合至食蟹猴的pDC群體組(譜系-CD123+HLA-DR+)(圖 10)。
[0304]A-8)雜交瘤的單個化
[0305]收集上述7個類型的雜交瘤(49F2、55E7、14A8、13G5、10F7、22H8和9H5)中的每一種，將其懸浮于分選緩沖液(1%FBS/PBS)中以成為IxlO5個細胞/ml。通過使用FACSAria(BD)，進行單細胞分選。收集數據，通過X軸:FSC和Y軸:SSC的二維點圖開發收集的數據。在二維點上門控活細胞。進行用于從活細胞門中的細胞除去雙聯體的門控，細胞群體被分配至96孔平底板以成為I個細胞/孔。將經歷了單細胞分選的細胞培養在HAT培養基(RPMI1640+2mM L-谷氨酰胺、100單位/ml氨芐青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、IOmM HEPES,ImM丙酮酸鈉和50 μ M2-ME) +雜交瘤生長補充劑HFCS (Roche)中。此后，通過使用雜交瘤的細胞培養上清液進行D2SC細胞和hPTPRS/D2SC細胞(圖1lA和B)、CAL-1細胞(圖11C)和人pDC(圖11D)的染色，選擇單個雜交瘤。
[0306]實施例3
[0307]抗體的純化
[0308]使用蛋白G瓊脂糖FastFlow (GE Healthcare)通過純化從雜交瘤的培養上清液獲得 8 個類型的純化抗體(9H5-4, 10F7-38、13G5-52、13G5-57、14A8-85、22H8-14、49F2-30 和55E7-79) ο 通過使用 Pierce rapid ELISA mouse mAb Isotyping 試劑盒(Thermo FisherScientific)，測定同種型。作為結果，13G5-52和13G5-57是小鼠IgG2b, κ，55Ε7-79具有小鼠IgG2b, κ和小鼠IgGl, κ 二者,其它為小鼠IgGl, κ。如果純化的抗體包括內毒素,則其可影響性質測定測試的結果。因此，測量了內毒素的濃度。所使用的試劑盒是EndospecyES-50M set、Toxicolor DIA-MP set 和 Endotoxin standard product CSE-L set (全部由Seikagaku Biobusiness Corporation生產)。作為其結果,所有純化的抗體都具有等于或小于標準值0.3EU/mg Ab的內毒素濃度(圖12)。
[0309]關于純化的抗體的反應性的研究
[0310]利用人pDC-樣細胞品系CAL-1細胞來確認純化的抗體的結合能力(圖13)。此夕卜，所有抗體維持針對人外周血的人PDC群體(BDCA2+)的結合能力(圖14)。
[0311]人PTPRS針對小鼠PTPRS (mPTPRS)的氨基酸序列的同源性為約96%。由于它們彼此顯著相似，研究了制備的抗-人PTPRS抗體是否也結合小鼠PTPRS。利用10 μ g/ml的各抗-PTPRS抗體對其中已強制表達mPTPRS的基因的CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞；在下文中，稱為mPTPRS/CHO)進行染色。細胞數目為2xl05/樣品。在利用FACS緩沖液洗滌后，將PE-標記的抗-小鼠IgG抗體稀釋50倍，用25 μ L進行染色。作為結果，49F2-30、13G5-52、13G5-57 和 22Η8-84 結合至 mPTPRS/cR0(圖 15)。
[0312]實施例4
[0313]抗-PTPRS抗體對hPTPRS表達性細胞的補體依賴細胞毒性
[0314]通過使用幼兔補體，測量了抗表達人PTPRS的CHO細胞(在下文中，稱為hPTPRS/CH0)和小鼠PTPRS/CU0細胞(在下文中，稱為mPTPRS/CHO)的抗-PTPRS抗體的補體依賴細胞毒性(在下文中，稱為CDC活性)。通過使用由從細胞釋放的乳糖脫氫酶(LDH)的測量值計算的細胞毒性作為指標來獲得活性。將每一種細胞以2xl04個細胞/50 μ L/孔分配至96 孔 U 形底板。利用 CDC 培養基(RPMI1640+0.l%BSA+10mM HEPES+2mM L-谷氨酰胺+100單位/ml氨芐青霉素+100 μ g/ml鏈霉素)制備18%補體(CEDARLANE)。制備了兩個類型:
3.3 μ g/ml和30 μ g/ml的對照抗體(小鼠IgGl, κ或小鼠IgG2b, κ )和抗-PTPRS抗體。通過使用CytoTox96非放射性細胞毒性測定的試劑盒(Promega)來進行測定。作為結果，13G5-52和13G5-57顯示約20%的抗hPTPRS/CHO的靶標的CDC活性(圖16A)。在另一方面，13G5-52和13G5-57顯示約100%的抗mPTPRS/CHO的靶標的CDC活性(圖16B)。
[0315]實施例5
[0316]嵌合抗體的制備
[0317]作為用于產生小鼠抗-PTPRS抗體的雜交瘤，使用了下列雜交瘤。
[0318]雜交瘤9H5-4 (登錄號:FERM BP-11356)
[0319]雜交瘤10F7_38(登錄號:FERM BP-11357)
[0320]雜交瘤13G5-52(登錄號:FERM BP-11358)
[0321]雜交瘤13G5-57(登錄號:FERM BP-11359)
[0322]雜交瘤14A8_85(登錄號:FERM BP-11360)
[0323]雜交瘤22H8_84(登錄號:FERM BP-11361)
[0324]雜交瘤49F2-30 (登錄號:FERM BP-11362)
[0325]1.恒定區的同種型的確認
[0326]確認了從7 種雜交瘤(9H5-4、10F7-38、13G5-52、13G5-57、14A8-85、22H8-84 和49F2-30)產生的小鼠抗體的每一種的恒定區的同種型。
[0327]為了進行確認，使用了小鼠單克隆抗體同種型分型試劑盒(目錄號Serotec Product ;0xford, UK)或Pierce Rapid ELISA 小鼠mAb 同種型分型試劑盒(ThermoFisher Scientific)，以及這樣的 9H5-4、10F7-38、13G5-52、13G5-57、14Α8_85、22Η8_84 和49F2-30雜交瘤培養上清液(作為樣品)。
[0328]作為結果，由13G5-52和13G5-57雜交瘤產生的抗體的同種型為包括小鼠IgG2b作為重鏈和κ作為輕鏈的同種型。在另一方面，由9H5-4、10F7-38、14A8-85、22H8-84和49F2-30雜交瘤產生的抗體的同種型為包括小鼠IgGl作為重鏈和包括κ作為輕鏈的同種型。
[0329]2.編碼小鼠抗-PTPRS抗體的可變區的cDNA的克隆
[0330]2-1)總 RNA 的分離
[0331]通過使用商購可得試劑盒“RNeasy Mini試劑盒”(Qiagen,目錄號:74106),按照試劑盒所附的說明書，從7種雜交瘤分離了總RNA。通過從具有5xl06的細胞數目的雜交瘤細胞品系制備來獲得約30 μ g的總RNA。
[0332]2-2)編碼小鼠重鏈可變區的cDNA的擴增和片段化
[0333]使用5 μ g在2-1)中分離的總RNA，利用5’ RACE PCR法擴增編碼小鼠重鏈可變區的cDNA。在擴增中，使用了商購可得的試劑盒“用于快速擴增cDNA END的5’ RACE系統(5，RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs)，2.0 版試劑盒”(Invitrogen,目錄號:18374-058)。詳情如下。首先，利用逆轉錄酶從2_1)中獲得的總cDNA合成第一鏈cDNA。此時，使用下面顯示的反義引物(GSPl)。
[0334]根據每一個小鼠重鏈的同種型使用用于擴增cDNA的GSPl引物。例如，下列反義引物被用于克隆9H5-4、10F7-38、14A8-85、22H8-84和49F2-30雜交瘤(包含小鼠IgGl作為重鏈)的重鏈可變區。
[0335]GSPl 引物:mu IgGlVH-GSPl
[0336]序列:5，-CCAGGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3，(36-mer) (SEQID NO:39)GSP2 引物:mu IgGlVH_GSP2
[0337]序列:5，-GGCTCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3，(32-mer) (SEQ IDNO:40)
[0338]同樣地，例如，下列反義引物可用于克隆9H5-4、10F7-38、14Α8_85、22Η8_84和49F2-30雜交瘤(包含小鼠IgGl作為重鏈)的重鏈可變區。
[0339]GSPl 引物:mu IgGHyl-GSPl
[0340]序列:5'-TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC-3，(24-mer) (SEQ ID NO:11)
[0341]GSP2 引物:mu IgG H Y 1-GSP2
[0342]序列:5，-AGGGGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG-3' (32-mer) (SEQ ID NO:13)
[0343]以及下列反義引物用于克隆13G5-52和13G5-57雜交瘤(包含小鼠IgG2b作為重鏈)的重鏈可變區。
[0344]GSPl 引物:mu IgGHY2B_GSPl
[0345]序列:5'-TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC-3' (24-mer) (SEQ ID NO:41)
[0346]GSP2 引物:mu IgG H y 2B-GSP2
[0347]序列:5，-AGGGGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG-3' (24-mer) (SEQ ID NO:42)。
[0348]此外，通過在第一鏈cDNA的3’ -末端上使用末端脫氧核苷酰轉移酶(TdT)，添加核苷酸同聚物dc。此外，使用具有與dC(錨定序列)互補的核苷酸聚合物的錨定引物(SEQID NO:12)和反義引物(GSP2)，利用PCR法擴增了 cDNA。此外，通過使用獲得的PCR產物為模板，以及使用AUAP引物(SEQ ID NO: 14)和反義引物(GSP2)，利用巢氏PCR法擴增了cDNA。此外，利用1.5%的低熔點瓊脂糖法純化了該PCR產物。
[0349]5’RACE 的錨定引物(SEQ ID NO: 12):5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGGGII GGG IIG-3’ (36-mer)
[0350]用于5’RACE 的 AUAP 弓丨物(SEQ ID NO:14): 5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGTAC-3’ (20-mer)
[0351]2-3)編碼小鼠輕鏈可變區的cDNA的擴增和片段化
[0352]以與2-2)相似的方式從在2-1)中分離的總RNA擴增編碼小鼠輕鏈可變區的cDNA。
[0353]由于這7種抗體包括小鼠IgK輕鏈，因此下列反義引物可用于克隆輕鏈。
[0354]GSPl 引物:Mu IgVL5RACE_GSPl
[0355]序列:5，-TTCACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT-3，(24-mer) (SEQ ID NO:15)
[0356]GSP2 引物:Mu IgVL5RACE_GSP2
[0357]序歹Ij:5' -GAT GGATAC AGT TGG TGC AGC-3，(21-mer) (SEQ ID NO: 16)
[0358]利用1.5%的低熔點瓊脂糖法純化所獲得的PCR產物。
[0359]2-4) cDNA的堿基序列的確認和⑶R區域的測定
[0360]按照試劑盒所附的說明書，使用商購可得的試劑盒“Zero Blunt TOPO PCRCloning試劑盒” (Invitrogen,目錄號=1325137)將2-2)中獲得的重鏈可變區和2-3)中獲得的輕鏈可變區的cDNA片段各自克隆至pCR4Blunt-T0P0載體，并將其引入大腸桿菌(E.coli)感受態細胞，以產生大腸桿菌轉化體。從該轉化體獲得質粒，將質粒DNA樣品送至Operon Biotechnology C0.Ltd (Tokyo)進行序列分析來確認質粒中的cDNA堿基序列。為了分析序列，使用了 “ Sequencher DNA序列裝配和分析軟件4.2.2版(Sequencher DNAsequence assembly and analysis software version4.2.2) (Gene Codes Corporation)”和 “GENETYX-MAC11.1.1 版”軟件(GENETYX CORPORATION) ”。
[0361]沒有包括因互補決定區(在下文中，稱為“⑶R區”)附近發生的移碼、無義突變等而變得失活的RNA的轉化體，提取了具有正確序列的轉化體。此外，就包括在質粒中的 cDNA 喊基序列對免疫球蛋白數據庫(IgBLAST, URL:www.ncb1.nlm.nih.gov/igblast/)和同源性進行了確認以測定每一個可變區中的⑶R區(⑶R KDR1、⑶R2、⑶R3)的序列，使用 Kabat 編號系統(Kabat 等人，1991，sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, National Institutes of Health Publication N0.91-3242,第 5 版，UnitedStates Department of Health and Human Services, Bethesda, MD)按照分析法測定構架區和可變區的序列。
[0362]獲得的抗-PTPRS小鼠9H5-4抗體的重鏈可變區的核酸序列是SEQ ID N0:43，氨基酸序列是SEQ ID NO:44o小鼠9Η5-4抗體的重鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別是 SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46 和 SEQ ID NO:47。
[0363]獲得的抗-FTPRS小鼠9Η5-4抗體的輕鏈可變區的核酸序列是SEQ ID Ν0:48，氨基酸序列是SEQ ID NO:49ο小鼠9Η5-4抗體的輕鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別是 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51 和 SEQ ID NO:52。
[0364]以及，獲得的抗-PTPRS小鼠10F7-38抗體和14A8-85抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的核酸序列與9H5-4抗體的那些相同，包括⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列。
[0365]獲得的抗-PTPRS小鼠13G5-57抗體的重鏈可變區的核酸序列是SEQ ID NO:53，氨基酸序列是SEQ ID NO:54o小鼠13G5-57抗體的重鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別是 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 和 SEQ ID NO:57。
[0366]獲得的抗-FTPRS小鼠13G5-57抗體的輕鏈可變區的核酸序列是SEQ ID NO:58，氨基酸序列是SEQ ID NO:59o小鼠13G5-57抗體的輕鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別是 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 和 SEQ ID NO:62。
[0367]以及，獲得的抗-PTPRS小鼠13G5-52抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的核酸序列與13G5-57抗體的那些相同，包括⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列。
[0368]獲得的抗-PTPRS小鼠22H8-84抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO:63，氨基酸序列為SEQ ID NO:64o小鼠22Η8-84抗體的重鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:67。
[0369]獲得的抗-FTPRS小鼠22Η8-84抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO:68，氨基酸序列為SEQ ID NO:69ο小鼠22Η8-84抗體的輕鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸分別為 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72。
[0370]獲得的抗-PTPRS小鼠49F2-30抗體的重鏈可變區的核酸序列是SEQ ID NO:25,氨基酸序列為SEQ ID NO:26o小鼠49F2-30抗體的重鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29。
[0371]獲得的抗-FTPRS小鼠49F2-30抗體的輕鏈可變區的核酸序列是SEQ ID NO:30，氨基酸序列是SEQ ID NO:31o小鼠49F2-30抗體的輕鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34。
[0372]獲得的抗-PTPRS小鼠9H5-4抗體的重鏈可變區的核酸序列(471bp)示于下面(SEQ ID N0:43)。大寫字母顯示小鼠9H5-4VH可變區，小寫字母顯示小鼠IgGl重鏈恒定區。
[0373]ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGGTATTTCTTGTGGCTCTTTTGAATGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTTGTAGAGACCGGGGGAGGCTTGGTGAGGCCTGGAAATTCTCTGAAACTCTCCTGTGTTACCTCGGGATTCACTTTCAGTAACTACCGGATGCACTGGCTTCGCCAGCCTCCAGGGAAGAGGCTGGAGTGGATTGCTGTAATTACAGTCAAATCTGATAATTATGGAGCAAATTATGCAGAGTCTGTGAAAGGCAGATTCACTATTTCAAGAGATGATTCAAAAAGCAGTGTCTACCTGCAGATGAACAGATTAAGAGAGGAAGACACTGCCACTTATTATTGTAGTAGATCGGTCTACTATGGTTACGTCCTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctaagggc
[0374]小鼠9H5-4抗體的重鏈可變區的氨基酸序列(157a.a)示于下面(SEQ ID NO:44)。大寫字母顯示VH可變區的序列，小寫字母顯示小鼠IgGl重鏈恒定區。加以下劃線的部分意指信號序列，加以雙下劃線的部分意指CDR區域(CDR1、CDR2、CDR3)。
[0375]MELGLSffVFLVALLNGVQCQVQLVETGGGLVRPGNSLKLSCVTSGFTFS MHRMH1WLRQPPGKRLEffIA ΜΤΜΜΜΒΑΜΥΑΒ8ΜΜ RFTISRDDSKSSVYLQMNRLREEDTATYYCSRSVYYGYVLAFDYWGQGTTLTVSSakttppsvyplapkg[0376]9H5-4抗體的重鏈可變區的CDRl是NYRMH(SEQ ID NO:45)，9H5-4抗體的重鏈可變區的 CDR2 是 VITVKSDNYGANYAESVKG (SEQ ID NO:46)，9H5-4 抗體的重鏈可變區 CDR3 是SVYYGYVLAFDY(SEQ ID NO:47)。
[0377]獲得的抗-PTPRS小鼠9H5-4抗體的輕鏈可變區的核酸序列(402bp)示于下面(SEQ ID N0:48)。大寫字母顯示小鼠9H5-4VH可變區，小寫字母顯示小鼠Ig κ輕鏈恒定區。
[0378]ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGG AGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaact
[0379]小鼠9H5-4抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列(134a.a)示于下面(SEQ ID NO:49)。大寫字母顯示小鼠9H5-4VH可變區的序列，小寫字母顯示小鼠IgK輕鏈恒定區。加以下劃線的部分意指信號序列，加以雙下劃線的部分意指⑶R區(⑶R1、⑶R2、⑶R3)。
[0380]MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC 'EABmBMJlMWYQQKPDGTVKLLIY fYJSRLHSl GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCWTFGGGTKLEIKradaapt
[0381]9H5-4 抗體的輕鏈可變區的 CDRl 是 RASQDISNYLN(SEQ ID NO:50) ,9H5-4 抗體的輕鏈可變區的CDR2是YTSRLHS (SEQ ID NO:51)，9H5-4抗體的輕鏈可變區的CDR3是QQGNTLP(SEQ ID NO:52)。
[0382]抗-PTPRS小鼠13G5-57抗體的重鏈可變區的核酸序列(465bp)示于下面(SEQ IDNO:53)。大寫字母顯示小鼠13G5-57VH可變區，小寫字母顯示小鼠IgG2b重鏈恒定區。
[0383]ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGTTTACTACGGGAGGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
[0384]小鼠13G5-57抗體的重鏈可變區的氨基酸序列(155a.a)示于下面(SEQ ID NO:54)。大寫字母顯示VH可變區的序列，小寫字母顯示小鼠IgG2b重鏈恒定區。加以下劃線的部分意指信號序列，加以雙下劃線的部分意指⑶R區域(⑶R1、⑶R2、⑶R3)。
[0385]MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFS DYYMTWVRQTPEKRLEffVA --ΜΟΟΟ?ΙΟΜΙΠΚΙΙ RFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARimmma&ing WGQGTSVTVSSakttppsvyplapkg
[0386]13G5-57抗體的重鏈可變區的CDRl是DYYMY(SEQ ID NO:55)，13G5-57抗體的重鏈可變區的 CDR2 是 HSNGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:56)，13G5-57 抗體的重鏈可變區的 CDR3是 HVYYGRNYAMDY(SEQ ID NO:57)。[0387]獲得的抗-PTPRS小鼠13G5-57抗體的輕鏈可變區核酸序列(465bp)示于下面(SEQ ID N0:58)。大寫字母顯示小鼠13G5-57VH可變區，小寫字母顯示小鼠Ig κ輕鏈恒定區。
[0388]ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTG
[0389]AAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCAC CATCTCCAGAGACAATGCCMGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGTTTACTACGGGAGGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
[0390]小鼠13G5-57抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列(155a.a)示于下面(SEQ ID NO:59)。大寫字母顯示小鼠13G5-57VH可變區的序列，小寫字母顯示小鼠IgK輕鏈恒定區。加以下劃線部分意指信號序列，加以雙下劃線的部分意指⑶R區域(⑶R1、⑶R2、⑶R3)。
[0391]MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC RASQD1SMYLMWYQQKPDGTVKLLIY --ΜΠΜ GVPSRFSGSGSGTDYSLT I SNLEQED IATYFC QOGMILEY TFGGGTKLEIKradaaptvsifppsseqltsggasvvcf
[0392]13G5-57 抗體的輕鏈可變區的 CDRl 是 RASQDISNYLN(SEQ ID NO:60)，13G5-57 抗體的輕鏈可變區的CDR2是YTSRLHS (SEQ ID NO:61)，13G5-57抗體的輕鏈可變區的CDR3是QQGNTLPY(SEQ ID NO:62)。
[0393]抗-PTPRS小鼠22H8-84抗體的重鏈可變區的核酸序列(458bp)示于下面(SEQ IDNO:63)。大寫字母顯示小鼠22H8-84VH可變區，小寫字母顯示小鼠IgGl重鏈恒定區。
[0394]ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCAGTAACTTCAGGTGTCTACTCACAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAAGGATTTACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccc [0395]小鼠22H8-84抗體的重鏈可變區的氨基酸序列(152a.a)示于下面(SEQ ID NO:64)。大寫字母顯示VH可變區的序列，小寫字母顯示小鼠IgGl重鏈恒定區。加以下劃線的部分意指信號序列，加以雙下劃線的部分意指⑶R區(⑶R1、⑶R2、⑶R3)。
[0396]MECNfflLPFILSVTSGVYSQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT MlMQ'WVKQRPGQGLEffIG 'ΜΙΜΜΜΜΙΜΙΜΙ KATLTADKSSSTAYMQLS SLASEDSAVYYCAR Rj.VYOVYYAMPy WGQGTSVTVSSakttppsvypla
[0397]22H8-84抗體的重鏈可變區的CDRl是SYWMQ (SEQ ID NO:65)，22H8-84抗體的重鏈可變區的CDR2是AIYP⑶⑶TRYTQKFKG(SEQ ID NO:66)，22H8-84抗體的重鏈可變區的CDR3是 RIYYGYYYAMDY(SEQ ID NO:67)。
[0398]獲得的抗-PTPRS小鼠22H8-84抗體的輕鏈可變區的核酸序列(430bp)示于下面(SEQ ID N0:68)。大寫字母顯示小鼠22H8-84VH可變區，小寫字母顯示小鼠Ig κ輕鏈恒定區。
[0399]ATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcaagggcg
[0400]小鼠22H8-84抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列(143a.a)示于下面(SEQ ID NO:69)。大寫字母顯示小鼠22H8-84VH可變區的序列，小寫字母顯示小鼠IgK輕鏈恒定區。加以下劃線的部分意指信號序列，加以雙下劃線的部分意指⑶R區域(⑶R1、⑶R2、⑶R3)。
[0401]METDTILLffVLLLffVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISC KAS—QSmYDGDSYMM，WYQQKPGQPPKLLIY AASNLES< GIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC !OOiNEDPLTFGAGTKLELKradaaptvsikg
[0402]22H8-84抗體的輕鏈可變區的CDR1是KASQSVDYD⑶SYMN(SEQ ID NO:70)，22H8-84抗體的輕鏈可變區的CDR2是AASNLES (SEQ ID NO:71), 22H8-84抗體的輕鏈可變區的CDR3是 QQSNEDPL(SEQ ID NO:72)。
[0403]抗-PTPRS小鼠49F2-30抗體的重鏈可變區的核酸序列(469bp)示于下面(SEQ IDNO:25)。大寫字母顯示小鼠49F2-30VH的可變區，小寫字母顯示小鼠IgGl重鏈恒定區。
[0404]ATGAACTTCGGGCTCAGGTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTGACACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAACAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGAC`ACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACAGGTCTACTATGGTCTTTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctaagggcgaat
[0405]小鼠49F2-30抗體的重鏈可變區氨基酸序列(156a.a)示于下面(SEQ ID NO:26)。大寫字母顯示VH可變基因，小寫字母顯示小鼠IgGl重鏈恒定區。加以下劃線的序列顯示信號序列，加以雙下劃線的序列顯示⑶R區(⑶R1、⑶R2、⑶R3)。
[0406]MNFGLRLIFLALILKGVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFIFS SYCMS1WVRQTPDKRLEWVA JISaSGSDTYYP
[0407]PIliCl RFTISRDNANNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR SmiMllBB WGAGTTVTVSSakttppsvypIapkge
[0408]49F2-30抗體的重鏈可變區的CDRl是SYGMS (SEQ ID NO:27)，49F2-30抗體的重鏈可變區的 CDR2 是 TISSGGSDTYYPDSVKG(SEQ ID NO:28) ,49F2-30 抗體的重鏈可變區的 CDR3是 QVYYGLYWYFDV(SEQ ID NO:29)。
[0409]獲得的抗-PTPRS小鼠49F2-30抗體的輕鏈可變區的核酸序列(413bp)示于下面(SEQ ID N0:30)。大寫字母顯示小鼠49F2-30VL的可變區，小寫字母顯示小鼠Ig κ輕鏈恒定區。
[0410]ATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATTTGTAAGGCCAGTCAGGATGT
GAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGT
ACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCT
GAAGACCTGGCAATTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT
AAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcaa[0411]小鼠49F2-30抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列(137a.a)示于下面(SEQ ID NO:31) ο大寫字母顯示小鼠49F2-30VL可變區和小寫字母顯示小鼠IgK輕鏈恒定區。加以下劃線的序列顯示信號序列，加以雙下劃線的序列顯示⑶R區(⑶R1、⑶R2、⑶R3)。
[0412]ME SQIQYFYFVFLffLSGYDGDI VMTQS HKFM STSVGDRVSI IC '?§ΜΜ!Α?ΜWYQQKPGQSPKLLIY 'SMgifi GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAIYYC MffSIg YTFGGGTKLEIKradaaptvsi
[0413]49F2-30 抗體的輕鏈可變區的 CDRl 是 KASQDVNTAVA(SEQ ID NO:32) ,49F2-30 抗體的輕鏈可變區的CDR2是SASYRYT (SEQ ID NO:33)，49F2-30抗體的輕鏈可變區的CDR3是QQHYSTP(SEQ ID NO:34)。
[0414]3.嵌合抗體的表達載體的制備
[0415]3-1)編碼人Ig恒定區的cDNA的克隆
[0416]按照試劑盒所附的說明書，使用商購可得的試劑盒“Zero Blunt TOPO PCRCloning試劑盒”(Invitrogen，目錄號:1325137)從人PBMC的總RNA克隆人IgGl重鏈恒定區和人Ig κ輕鏈恒定區的cDNA，將其各自克隆至pCR4Blunt-T0P0載體，并引入大腸桿菌感受態細胞，以產生大腸桿菌轉化體。從該轉化體獲得上述質粒，將質粒DNA樣品送至OperonBiotechnology C0., Ltd.(Tokyo)進行序列分析以確認質粒中的cDNA堿基序列。
[0417]3-2)嵌合9H5-4(10F7-38，14A8-85)抗體的表達載體的制備
[0418]為了制備編碼嵌合PTPRS抗體的重鏈的cDNA，將在2-2中獲得的小鼠9H5-4抗體的重鏈可變區與已將人IgG重鏈恒定區整合至其中的pEE6.4載體(Lonza Biologies,Slough, UK)融合，通過PCR法擴增小鼠9H5-4抗體的重鏈可變區，獲得具有約450個堿基的長度的PCR產物。此時，引物是如下引物。利用1.5%的低熔點瓊脂糖法純化獲得的PCR產物。
[0419]用于表達嵌合9H5-4抗體的重鏈的引物
[0420]I)正向引物:chilOF7VH_IF(Hind3)
[0421]序列:5，tttAAG CTT gcc gcc acc ATG GAG TTG GGA CTG AGC TGG3，(39-mer)(SEQ ID NO:73)
[0422]2)反向引物:chilOF7VH-462R(ApaI)
[0423]序列:5’cga tgg gcc ctt ggt get age TGA GGA GAC TGT GAG AGTGGT3’ (42-mer)(SEQ ID NO:74)
[0424]通過PCR法從2-2中獲得的小鼠9H5-4抗體重鏈可變區獲得了 “編碼9H5-4重鏈可變區的PCR產物”。利用Hind III和Apa I限制性內切酶消化編碼9H5-4重鏈可變區的PCR產物，并利用1.5%瓊脂糖凝膠法進行純化。將其溶解于ddH20以提供編碼重鏈可變區的cDNA片段的溶液。
[0425]通過使用引物chi 10F7VH-1F (Hind3)和 chi 10F7VH-462R (Apal)(已使用 Hind 111和Apal作為克隆位點將用于克隆到ρΕΕ6.4載體(Lonza Biologies, Slough, UK)中的優選限制性位點(Hind III和Apal)和理想的Kozak序列(GCCGCCACC)引入所述引物)，通過PCR從pCR4Blunt-T0P0質粒克隆(包含9H5-4的Vh編碼區)擴增獲得的cDNA的9H5-4的Vh編碼區。chi9H5-4VH-pEE6.4載體包括人IgGl的重鏈恒定區。使用Hind III和Apal將Vh PCR片段框內插入pEE6.4載體中。利用cDNA堿基序列分析研究了構建體，將質粒DNA樣品送至Operon Biotechnology C0., Ltd.(Tokyo)進行序列分析以確認質粒中的cDNA堿基序列。
[0426]為了制備編碼嵌合9H5-4抗體的輕鏈的cDNA,利用基于重疊延伸(overlapextension) PCR的技術，從其中已融合2_3中獲得的小鼠9H5-4抗體輕鏈可變區與3_2中獲得的人Ig κ輕鏈恒定區的PCR片段擴增長度為約730個堿基的PCR產物。
[0427]利用Hind III和EcoRI限制性核酸內切酶消化編碼9H5-4輕鏈可變區的PCR產物，并利用1.5%瓊脂糖凝膠法進行純化。將其溶解于ddH20以提供編碼輕鏈可變區的cDNA片段的溶液。
[0428]通過使用引物chi 11G9VL-1F (Hind)和chillG9VL_726R(RI)(已將用于克隆進入PEE14.4載體(Lonza Biologies)的優選限制性位點(Hind III和EcoRI)和理想的Kozak序列引入所述引物)，通過PCR從pCR4Blunt-T0P0質粒克隆(包含9H5-4的Vl編碼區)擴增了所獲得的9H5-4的Vl編碼cDNA。Chi9H5_4VL-pEE14.4載體包括κ輕鏈恒定區。使用Hind III和EcoRI將Vl PCR片段框內插入ρΕΕ14.4載體。通過cDNA堿基序列分析研究了構建體。
[0429]用于表達嵌合9H5-4抗體的輕鏈的引物
[0430]I)正向引物:chillG9VL_IF(Hind)
[0431]序列:5，accAAG CTT gcc gcc acc ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC3，(39-mer)(SEQ ID NO:75)
[0432]2)反向引物:chillG9VL-408R
[0433]序列:5，agccac agt tcg TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC 3，(33-mer) (SEQ IDNO:76)
[0434]3)正向引物:chillG9VL_385F
[0435]序列:5，CTGGAMTC AM cga act gtg get gca cca tct 3" (33-mer) (SEQ ID NO:77)
[0436]4)反向引物:chillG9VL_726R(RI)
[0437]序列:5，aaaGAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa3，(30-mer) (SEQ ID NO:78)
[0438]3-2)嵌合13G5-57(13G5_52)抗體的表達載體的制備
[0439]為了制備編碼嵌合PTPRS抗體的重鏈的cDNA，已將2_2中獲得的小鼠13G5-57抗體的重鏈可變區與已將人IgG重鏈恒定區整合入其中的pEE6.4載體(LonzaBiologies, Slough, UK)融合。以與9H5-4抗體相似的方式，獲得和純化PCR產物。此時，弓丨入是如下引物。
[0440]用于表達嵌合13G5-57抗體的重鏈的引物
[0441]I)正向引物:chil3G5.57VH-1F(Hind3)
[0442]序列:5，tttAAG CTT gcc gcc acc ATG AAC TTG GGG CTC AGC TTG3，(39-mer)(SEQ ID NO:79)
[0443]2)反向引物:chil3G5.57VH-456R(ApaI)
[0444]序列:5，cgatgg gcc ctt ggt get age TGA GGA GAC GGT GAC TGAGGT3’ (42-mer)(SEQ ID NO:80)
[0445]為了制備編碼嵌合13G5-57抗體的輕鏈的cDNA，利用基于重疊延伸PCR的技術從其中已融合2-3中獲得的小鼠13G5-57抗體輕鏈可變區與3_2中獲得的人IgK輕鏈恒定區的PCR片段擴增長度為約730個堿基的PCR產物。
[0446]用于表達嵌合13G5-57抗體的輕鏈的引物
[0447]I)正向引物:chillG9VL_IF(Hind)
[0448]序列:5，accAAG CTT gcc gcc acc ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC3，(39-mer)(SEQ ID NO:81)
[0449]2)反向引物:chillG9VL-408R
[0450]序列:5，agccac agt tcg TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC 3，(33-mer) (SEQ IDNO:82)
[0451]3)正向引物:chillG9VL_385F
[0452]序列:5，CTGGAMTC AM cga act gtg get gca cca tct 3，(33-mer) (SEQ ID NO:83)
[0453]4)反向引物:chillG9VL_726R(RI)
[0454]序列:5，aaaGAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa3，(30-mer) (SEQ ID NO:84)
[0455]以與制備嵌合9H5-4抗體的表達載體相似的方式,制備嵌合13G5-57抗體的這樣的重鏈和輕鏈的表達載體。
[0456]3-2)制備嵌合22H8-84抗體的表達載體
[0457]為了制備編碼嵌合PTPRS抗體的重鏈的cDNA，已將2_2中獲得的小鼠22H8-84抗體的重鏈可變區與已將人IgG重鏈恒定區整合入其中的pEE6.4載體(LonzaBiologies, Slough, UK)融合。以與9H5-4抗體相似的方式，獲得并且純化PCR產物。此時，引物是如下引物。
[0458]用于表達嵌合22H8-84抗體的重鏈的引物
[0459]I)正向引物:chi22H8VH_IF(Hind3)
[0460]序列:5，tttAAG CTT gcc gcc acc ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT3* (39-mer)(SEQ ID NO:85)
[0461]2)反向引物:chi22H8VH-456R(ApaI)
[0462]序列:5，cgatgg gcc ctt ggt get age TGA GGA GAC GGT GAC TGAGGT3’ (42-mer)(SEQ ID NO:86)
[0463]為了制備編碼嵌合22H8-84抗體的輕鏈的cDNA，利用基于重疊延伸PCR的技術從其中已融合2-3中獲得的小鼠22H8-84抗體輕鏈可變區與3_2中獲得的人IgK輕鏈恒定區的PCR片段擴增長度為約730個堿基的PCR產物。
[0464]用于表達嵌合22H8-84抗體的輕鏈的引物
[0465]I)正向引物:chi22H8VL_IF(Hind)
[0466]序列:5，accAAG CTT gcc gcc acc ATG GAG ACA GAC ACA ATC CTG3，(39-mer)(SEQ ID NO:87)
[0467]2)反向引物:chi22H8VL-420R
[0468]序列:5，agccac agt tcg TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC 3，(33-mer) (SEQ IDNO:88)
[0469]3)正向引物:chi22H8VL_397F
[0470]序列:5，CTGGAG CTG AAA cga act gtg get gca cca tct 3，(33-mer) (SEQ IDNO:89)
[0471]4)反向引物:chi49F2VL_726R(RI)
[0472]序列:5，aaaGAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa3，(30-mer) (SEQ ID NO:90)
[0473]以與制備嵌合9H5-4抗體的表達載體相似的方式,制備嵌合22H8-84抗體的這樣的重鏈和輕鏈的表達載體。
[0474]3-2)編碼嵌合PTPRS抗體的重鏈的cDNA的制備
[0475]為了制備編碼嵌合PTPRS抗體的重鏈的cDNA，利用基于重疊延伸PCR法的方法在其中已融合2-2中獲得的小鼠49F2-30抗體的重鏈可變區與3_1中獲得的人IgG重鏈恒定區的PCR片段中改變兩個PCR片段，利用作為雜交操作的結果允許雙纖絲分子(doublefilamentmolecule)部分形成的方法擴增長度為1434個堿基的PCR產物。此時，引物(SEQID NOS:17至24)為表1中顯示的引物。利用1.5%低熔點瓊脂糖法純化所獲得的PCR產物。
[0476]表1
[0477]
【權利要求】
1.一種單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，所述抗體結合人受體類型蛋白酪氨酸磷酸酶σ (APTPRS)的細胞外結構域。
2.權利要求1的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，其結合漿細胞樣樹突細胞。
3.一種單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，所述抗體由以登錄號FERM BP-11356保藏的雜交瘤9 Η5-4、以登錄號FERM ΒΡ-11357保藏的雜交瘤10F7-38、以登錄號FERMΒΡ-11358保藏的雜交瘤13G5-52、以登錄號FERM ΒΡ-11359保藏的雜交瘤13G5-57、以登錄號FERM BP-11360保藏的雜交瘤14Α8-85、以登錄號FERM BP-11361保藏的雜交瘤22Η8-84、以登錄號FERM ΒΡ-11362保藏的雜交瘤49F2-30、或以登錄號FERM ΒΡ-11363保藏的雜交瘤55Ε7-79 產生。
4.一種產生權利要求1或2的任意單克隆抗體的雜交瘤。
5.一種單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，所述抗體由以登錄號FERM BP-11356保藏的雜交瘤9Η5-4、以登錄號FERM ΒΡ-11357保藏的雜交瘤10F7-38、以登錄號FERMΒΡ-11358保藏的雜交瘤13G5-52、以登錄號FERM ΒΡ-11359保藏的雜交瘤13G5-57、以登錄號FERM BP-11360保藏的雜交瘤14Α8-85、以登錄號FERM BP-11361保藏的雜交瘤22Η8-84、以登錄號FERM ΒΡ-11362保藏的雜交瘤49F2-30或以登錄號FERM ΒΡ-11363保藏的雜交瘤55Ε7-79 產生。
6.一種用于產生單克隆抗體的方法,其包括培養權利要求5的雜交瘤，和從培養物收集單克隆抗體。
7.一種用于產生細胞的方法，所述細胞產生結合人PTPRS的單克隆抗體，所述方法包括: 1)向經免疫接種的動物施用表達包括人PTPRS的細胞外結構域的外源蛋白質的細胞，和 2)從經免疫接種的動物的抗體產生性細胞選擇產生結合人PTPRS的抗體的抗體產生性細胞。
8.權利要求7的方法，其中表達人PTPRS的細胞是表達地保持編碼包括人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列的外源多核苷酸的細胞。
9.權利要求8的方法，其中所述細胞是動物細胞。
10.權利要求9的方法，其中所述細胞是人來源的細胞。
11.權利要求10的方法，其中所述人來源的細胞是ΗΕΚ-293Τ細胞。
12.前述權利要求7至11中任一項的方法，其還包括克隆所述獲得的抗體產生性細胞。
13.一種用于產生結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體的方法，所述方法包括培養通過權利要求9的方法獲得的抗體產生性細胞，和從培養物收集單克隆抗體。
14.一種識別人PTPRS的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，所述抗體可通過下列步驟來獲得: 1)向經免疫接種的動物施用外源地表達包括人PTPRS的細胞外結構域的蛋白的細胞； 2)從經免疫接種的動物的抗體產生性細胞選擇產生結合人PTPRS的抗體的抗體產生性細胞；和 3)培養(2)中選擇的抗體產生性細胞，和從培養物收集識別人PTPRS的抗體。
15.(a) 一種用于產生結合人PTPRS的抗體的免疫原，其包含動物細胞或其膜級分，所述動物細胞外源地且表達地保持編碼包括人PTPRS的細胞外結構域的氨基酸序列的多核苷酸。
16.權利要求15的免疫原，其中所述動物細胞是人來源的細胞。
17.一種用于檢測漿細胞樣樹突細胞的方法，其包括將結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段與受試細胞接觸，和檢測已結合所述細胞的單克隆抗體，或包括其抗原結合區的片段。
18.一種用于檢測漿細胞樣樹突細胞的試劑，其包含結合人PTPRS的細胞外結構域的單克隆抗體，或包括其抗原結合區的片段。
19.一種用于抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的方法，其包括將下列組分的任一種與漿細胞樣樹突細胞接觸: (a)結合人PTPRS以抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，和 (b)已對其移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白，或包括其抗原結合區的片段。
20.一種用于抑制活體中的漿細胞樣樹突細胞的活性的方法，其包括給所述活體施用下列組分的任何組分: (a)結合人PTPRS以抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段，和 (b)已對其移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白或包括其抗原結合區的片段。`
21.權利要求19或20的方法，其中所述漿細胞樣樹突細胞的活性是干擾素產生性活性和干擾素產生性細胞的存活之一或兩者。
22.一種用于抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的試劑，其包括下列組分的任何組分作為活性成分: (a)結合人PTPRS以抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體或包括其抗原結合區的片段， (b)已對其移植了(a)的單克隆抗體的互補決定區的免疫球蛋白或包括其抗原結合區的片段。
23.一種用于抑制權利要求22的干擾素產生性細胞的活性的試劑，其中所述漿細胞樣樹突細胞的活性是干擾素產生性活性和干擾素產生性細胞的存活之一或兩者。
【文檔編號】A61K39/395GK103703372SQ201280020580
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年4月27日 優先權日:2011年4月28日
【發明者】山崎智英, 趙晶, 石田晃司, 柴田恭枝, 趙民權, 遠藤真由木 申請人:Sbi生物技術有限公司