皇冠提取物、提取方法和它作為膽固醇酯轉移酶蛋白質（cetp）抑制劑的用途

皇冠提取物、提取方法和它作為膽固醇酯轉移酶蛋白質（cetp）抑制劑的用途
【專利摘要】本發明公開了用于本發明的目的的被稱為DLBS1449的皇冠提取物和/或包括所述皇冠提取物的草藥餾分和藥物制劑。根據本發明教導的草藥提取物有效用于抑制膽固醇酯轉移酶蛋白質（CETP）的表達和活性，增加HDL膽固醇水平，降低LDL膽固醇水平，而不升高血壓，因此所述提取物被進一步用于動脈粥樣硬化的治療中。
【專利說明】皇冠提取物、提取方法和它作為膽固醇酯轉移酶蛋白質(CETP)抑制劑的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于本發明的目的的被稱為DLBS1449的皇冠的提取物，包含提取方法及該提取物的生物活性，所述提取物顯示出針對膽固醇酯轉移酶蛋白質(CETP)表達和活性的抑制活性。
【背景技術】
[0002]膽固醇酯轉移酶蛋白質(CETP)為74-kDa的糖蛋白，并具有疏水特性、該蛋白主要在肝臟中合成，并分泌到血漿中。此外，CETP還在淋巴、脂肪組織、心、腎和小腸中以較低濃度表達2。CETP在膽固醇逆轉運(RCT)過程中起作用，其中，該蛋白介導高密度脂蛋白(HDL)顆粒中的膽固醇酯向低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)顆粒中的甘油三酯的轉換許多先前的研究顯示CETP促進膽固醇酯在LDL顆粒中積聚的過程，這造成了抑制對來自血液循環的膽固醇的去除過程4。在流行病學研究中報道了，具有遺傳性CETP缺陷的主體具有更高量的HDL膽固醇和更低量的LDL膽固醇。因此，CETP在用于血脂異常和動脈粥樣硬化治療的藥物研究中成為潛在的治療目標。
[0003]目前，關于CETP的研究旨在研究CETP活性及它對人類血漿中HDL膽固醇和甘油三酯水平的變化的影響5’6。由CETP表達的下降而引起的高含量的HDL膽固醇非常重要，其中報道HDL膽固醇水平與動脈粥樣硬化風險因子存在反向聯系7。HDL的防動脈粥樣硬化的性質在RCT過程發揮作用，所述RCT過程中，在周圍細胞中的過量的膽固醇被分配到肝臟中，以被分泌6。已經生產并研究了一些CETP抑制劑，例如膽固醇酯轉移酶蛋白質抑制肽和CETP反義寡脫氧核苷 酸(ODN) 8’9。然而，這兩種抑制劑仍在研究中。此外，已經有被開發到臨床試驗階段的作為CETP抑制劑的藥物，即torcetrapib。然而，考慮到在服用該藥物的患者中高數目的死亡率，該產品在臨床試驗中未提供正面結果 ' 進一步研究發現，torcetrapib造成患者血壓升高,這導致死亡。
[0004]在本發明中教導了一種草本植物皇冠的提取方法和用途。本地已知為神冠果(Mahkota Dewa)的皇冠為印度尼西亞原生植物，通常作為觀賞植物存在于庭院中，或作為耐陰植物存在于花園中。令人驚奇地，通過利用它的莖、果肉或葉子，這種植物能夠被用作CETP抑制劑。在本發明前，沒有任何研究說明如本發明中所要求保護的皇冠提取物作為CETP抑制劑的使用或益處。

【發明內容】

[0005]將在優選的實施方式中說明本發明所提供的目標和/或方案。說明的實施方式用于理解本發明的目的，并不限制能夠從本發明的實踐中所了解到的變化和/或組合和/或修改的其它實施方式的可能性。將從此處權利要求中詳細描述的元素和組合中實現本發明所教導的目標和/或方案。
[0006]如在實施方式中所解釋并在本申請中被廣泛描述的那樣，為實現所述方案并與本發明的目的一致，本發明的第一個方面涉及通過在有機溶劑中提取而制備的皇冠提取物，所述皇冠提取物有效作用為膽固醇酯轉移酶蛋白質(CETP )抑制劑。
[0007] 本發明的第二個方面涉及有效增加HDL膽固醇水平并降低LDL膽固醇水平的有效量或劑量的皇冠提取物和/或它的餾分或它的化合物組，所述提取物和/或餾分或化合物組作為單獨活性成分或以組合使用。
[0008]本發明的第三個方面涉及藥物組合物，包括(I)作為單獨活性成分或以組合使用的有效量或有效劑量的皇冠的提取物或它的餾分，(2)藥學可接受且生理學適合的載劑、賦形劑或添加劑，所述載劑、賦形劑或添加劑作用為CETP抑制劑，但不限于此。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]這里將描述本發明中的【專利附圖】

【附圖說明】。
[0010]圖1為顯示0~100 i! g/ml濃度的DLBS1449對CETP基因表達水平的影響的圖。
[0011]圖2為顯示DLBS1449在蛋白水平上對CETP的活性的影響的圖。
[0012]圖3為顯示了 DLBS1449在蛋白水平上對CETP和ApoA-1的影響的作為免疫印跡結果的蛋白帶。
[0013]圖4為顯示DLBS1449處理對CETP轉錄調節過程中涉及的LXR- a和SREBP-1基因表達的影響的圖。
[0014]圖5為顯示DLBS1449處理對膽固醇逆轉運(RCT)過程中涉及的LDL-R、SR-Bl和ApoB基因表達的影響的圖。
[0015]圖6為顯示DLBS1449對CYP11B2基因表達影響的圖。
[0016]圖7為顯示DLBS1449對CYP11B1基因表達影響的圖。
[0017]圖8為顯示不飽和脂肪酸花生四烯酸和亞油酸以及它們與DLBS1449的組合對CETP基因表達的影響的圖。
【具體實施方式】
[0018]將通過提供實施例詳細地說明本發明，本發明的范圍并未被限制為所提供的實施例。
[0019]從皇冠中獲得根據本發明的教導的提取物和/或餾分。因此，將說明提取過程和DLBS1449作為CETP抑制劑的影響。
[0020]A.阜.冠的提取過程
[0021]本發明教導了皇冠的提取過程，其中可獲得具有作為CETP抑制劑活性的提取物。本發明教導的皇冠的提取過程使用具有有機溶劑的浸化和/或滲透系統。在10-60°C、優選25-500C的溫度，用8至12倍于原料重量的有機溶劑提取皇冠的干切片，優選它的果肉，和/或將所述干切片在萃取器中滲透。用于該過程中的有機溶劑包括但不限于純態(96%)或具有各種含量的水作為稀釋劑的醇類，包括但不限于甲醇和乙醇，有機溶劑的濃度優選為70%至96%。提取過程持續2到6個小時，伴隨在60rpm攪拌，或者可調整攪拌速度。通過過濾從漿狀物分離液體提取物。為了獲得干的提取物，在40至80°C的溫度和70至550mbar范圍的壓力下通過旋轉蒸發儀液體蒸發液體提取物，或者可調整所述溫度和壓力。此外，使用真空爐干燥所述濃縮物2至4個小時，以獲得干燥的提取物。用于本發明的目的的干燥的提取物被稱為DLBS1449。
[0022]已經進一步表征通過本發明中教導的方法獲得的DLBS1449，并且結果顯示獲得的DLBS1449至少包含，例如脂肪酸、皂苷和酚的化合物組，及其它能夠起到特定生物效應的次級代謝產物或它們的組合。此外，還使用薄層色譜(TLC)法定量地鑒定DLBS1449。該TLC法使用硅膠板作為固定相，以及氯仿:甲醇(10: I)作為移動相。TLC結果顯示包含具有Rf0.16~0.35的化合物組的DLBS1449起到特定的生物活性，這在說明書中將進一步說明。
[0023]B.DLBS1449對CETP表汰和活件的影響
[0024]用于本發明的細胞培養物為人類肝癌細胞H印G2，其中CETP主要在肝臟細胞中合成。在添加10%的血清、100 u g/ml的青霉素-鏈霉素抗生素和ImM丙酮酸鈉的極限必需a培養基中培養。然后，將這些細胞在37°C、5%C02中培養24個小時。 [0025]方法
[0026]對CETP某閔表汰的體外影響
[0027]在六孔板中培養H印G2細胞，直到達到70%的細胞密度。然后進行培養基的改變，使用不含血清的培養基，然后培養24個小時。然后，用0(對照)、25、50、75和100 y g/ml濃度的DLBS1449處理這些細胞24個小時。
[0028]RNA分離和實時PCR
[0029]使用Trizol溶液，根據該溶液所帶步驟，分離用DLBS1449處理的IfepG2細胞的總RNA。然后用NanoDrop儀器測量總RNA，并用電泳法顯示。此外，使用PCR溫度循環儀器在已優化的特定條件下通過RT-PCR過程使用具有良好的質量的RNA合成cDNA。
[0030]測量CETP活件
[0031]使用CETP抑制劑藥篩選試劑盒(美國BioVision)，根據獲自所述試劑盒的手冊進行測量。使用的DLBS1449的濃度為0、25、50、75和100 y g/ml，重復三次，并且將未加入CETP的DLBS1449的相同的樣品用作對照。
[0032]結果和討論
[0033]使用PCR的研究顯示DLBS1449能夠在mRNA水平降低CETP基因表達。當提高DLBS1449的給藥水平時，CETP基因表達的降低更大(圖1)。如圖2顯示，除了在mRNA水平降低CETP基因表達，DLBS1449還具有在蛋白水平作為CETP活性抑制劑的能力。該抑制活性為與劑量有關的方式。以前的研究主張CETP抑制是提高HDL膽固醇水平的策略之一 5’6。CETP的缺乏使得從HDL到VLDL及LDL膽固醇的膽固醇酯轉移過程被抑制，因而減少了 VLDL和LDL顆粒的形成，并且提高了 HDL水平。其中HDL膽固醇的量提高的這種條件造成了與抑制在動脈壁上的斑或粉瘤的形成有關的抗動脈粥樣硬化6。因此，通過如本發明所教導的抑制CETP表達和活性，認為DLBS1449能夠提高血液中的HDL膽固醇水平，并且由于LDL膽固醇水平的降低，可防止動脈粥樣硬化的可能性。進一步在體內分析了膽固醇水平的提高。
[0034]C.DLBS1449對CETP活件、HDL和LDL昍固醇及甘油三酯的體內影響
[0035]為了確保DLBS1449給藥對CETP活性、HDL、LDL和甘油三酯水平的影響，對雄性新西蘭白兔進行體內研究。
[0036]方法
[0037]將試驗動物分成兩組，對照組和用DLBS1449處理的處理組。對照組中的兔子未用DLBS1449處理，其它在處理組中的兔子以35mg/l，5kg體重的劑量口服給藥DLBS1449。對兔子給藥DLBS1449四周。在給藥該提取物前后進行CETP活性、HDL和LDL膽固醇和甘油三酯水平的測量。使用的樣品為取自每個兔子耳朵的血漿。對于每種影響參數使用特定的試劑盒進行測量。
[0038]結果和討論
[0039]如表2顯示，研究結果顯示對兔子DLBS1449給藥4周造成CETP活性降低0.3%，而在對照組中，CETP活性提高5.13%。還發現LDL膽固醇的降低，其中處理組中降低了 6.8%，高于對照組中3.2%的降低。從表2還可知，對照兔子中HDL膽固醇水平降低了 13.3%;另一方面，在處理的兔子中，HDL膽固醇水平提高了 15.9%。此外，發現每個試驗動物組中甘油三酯水平提高，然而，處理組中的提高低于對照組，它們分別為3.5%和16.5%。
[0040]結果顯示DLBS1449能夠有效控制兔子血液中的膽固醇水平，其中，HDL水平提高，CETP活性及LDL和甘油三酯的水平降低。該體內研究結果與體內研究結果一致，顯示DLBS1449能夠被用作CETP抑制劑。
[0041]表1試驗的兔子的各影響參數的特征和初始水平
【權利要求】
1.一種通過下述方法獲得的皇冠提取物和/或所述提取物的餾分或源自所述皇冠提取物的化合物組，所述方法包括: Ca)使用有機溶劑以及在10至60°C的溫度下攪拌來提取皇冠， (b)蒸發在步驟(a)中使用的所述有機溶劑。
2.根據權利要求1所述的提取物，其中提取過程使用有機溶劑，所述有機溶劑包括但不限于具有70%至96%的濃度的乙醇。
3.根據權利要求1所述的提取物，至少包括脂肪酸，以及皂苷和酚及其它次級代謝產物的化合物的組，或其用于特定生物效應的組合。
4.根據權利要求1所述的提取物，單獨或以組合作為活性成分，所述提取物以有效量或劑量以抑制CETP基因表達和活性。
5.根據權利要求1所述的提取物，單獨或以組合作為活性成分，所述提取物以有效量或劑量提高HDL膽固醇水平。
6.根據權利要求5所述的提取物，其中所述皇冠提取物提高ApoA-1蛋白水平并抑制SR-Bl基因表達。
7.根據權利要求1所述的提取物，單獨或以組合作為活性成分，所述提取物以有效量或劑量降低LDL膽固醇水平。
8.根據權利要求7所 述的提取物，其中所述皇冠提取物提高LDL-R基因表達并抑制ApoB基因表達。
9.根據權利要求1所述的提取物，其中所述皇冠提取物不造成血壓升高。
10.根據權利要求9所述的提取物，其中所述提取物抑制CYPl1B2和CYPl IBl的基因表達。
11.根據權利要求1所述的提取物作為與抑制動脈粥樣硬化的形成相關的抗動脈粥樣硬化劑在用于制備藥物組合物、補充劑、食物或飲料中的用途，所述提取物以有效量存在，以單獨形式或組合作為活性成分，其中包括藥學可接受且生理學適合的載劑、賦形劑或添加劑。
12.—種藥物組合物，所述藥物組合物包括以單獨形式或組合用作活性成分的根據權利要求I所述的提取物，并包括藥學可接受且生理學適合的載劑、賦形劑或添加劑，其中所述藥物組合物在無菌或未滅菌的產品中以固體、半固體或液體形式制造。
13.一種用于促進健康益處的食物或飲料產品，包括單獨或以組合作為活性成分的根據權利要求1所述的提取物和/或餾分。
【文檔編號】A61K36/53GK103619345SQ201280019093
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年4月19日 優先權日:2011年4月19日
【發明者】達維·安格貢·塞普蒂納·蘇吉普坦, 阿塞佩·阿勒平, 雷蒙德·R·錢德拉維納塔 申請人:地塞醫藥有限公司