用于激發(fā)t細胞的方法

用于激發(fā)t細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種體外用于激發(fā)適合施用于病毒感染患者的T細胞的方法。本發(fā)明也涉及通過所述方法獲得的組合物及其用途。
【專利說明】用于激發(fā)T細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學和傳染病治療領(lǐng)域，更具體地涉及ー種活化抗原特異性T細胞的方法及通過所述方法制備的T細胞。
【背景技術(shù)】
[0002]對T細胞識別病毒和腫瘤特異性抗原的機制的增加的理解，使得對使用特異性T細胞作為用于傳染病和惡性疾病的過繼免疫治療產(chǎn)生了很大的興趣?？梢詫⒓毎庖咧委煆V義地定義為施用免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞用于疾病的治療。細胞免疫系統(tǒng)的主要功能是對病原體，包括急性和持續(xù)性感染提供保護。
[0003]T細胞識別感染的細胞并通過殺傷這些靶細胞防止疾病發(fā)作。然而，病原體與免疫系統(tǒng)的相互作用是復雜的，這通過在存在特異性T細胞時發(fā)生慢性感染，從而病原體明顯地可以逃避T細胞監(jiān)視得到證實。
[0004]事實上T細胞檢測任何致病入侵者的能力是由其非常多樣的受體庫賦予的，受體庫允許T細胞池識別由主要組織相容性復合體(MHC)分子遞呈的大量的肽。而且，通過T細胞受體(TCR)(信號I)的信號轉(zhuǎn)導不足以產(chǎn)生充分的T細胞活化，因為共刺激分子提供了用于增殖、存活和分化所不可缺少的信號(信號2)。實際上，僅接受信號I而沒有信號2的原初T細胞被認為是無活動力(非反應(yīng))的或通過細胞凋亡而死亡。完全的T細胞活化需要信號I和2共同起作用，并且這些信號的強度決定了接著產(chǎn)生的T細胞池的大小。而且，完全分化為效應(yīng)T細胞通常依賴于第三信號，其由抗原呈遞細胞(APC)以可溶性形式提供，并提供用于需要的效應(yīng)T細胞類型的指導性信號。這個“三個信號”的概念描述了用于活化原初T細胞以及隨后形成效應(yīng)T細胞的模型。然而，免疫系統(tǒng)提供了大量多種共刺激分子并且這些多種類型的信號2和`3均以其獨特的方式有助于T細胞應(yīng)答的質(zhì)量。共刺激信號和可溶性形式的信號3可作用于T細胞活化的特定方面，如存活、細胞周期進程、待發(fā)展的效應(yīng)細胞的類型和分化成效應(yīng)細胞或記憶細胞。
[0005]現(xiàn)在普遍接受了成熟的抗原呈遞樹突細胞(DC)需要由其它淋巴細胞，包括⑶4+T細胞、NK細胞和NKT細胞“輔助”，以誘導長期生存的記憶⑶8+T細胞。這種“輔助”誘導所述成熟DC進ー步分化，這個過程稱為激活(licensing)。“輔助”信號對DC有多種作用，包括上調(diào)共刺激分子、分泌細胞因子和上調(diào)多種抗細胞凋亡分子，這些都累積性地增強DC最佳活化同源T細胞，特別是CD8+T細胞的能力。而且，“輔助”淋巴細胞也可表達或分泌直接影響T細胞存活、細胞周期進程、待發(fā)展的效應(yīng)細胞類型和分化成效應(yīng)細胞或記憶細胞的因子。
[0006]持續(xù)性或慢性病毒感染，如HIV、HBV或HCV或皰疹病毒CMV和EBV，對社會造成重大威脅，并且對感染個體的治療方案也是迫切需要的。在病毒持續(xù)感染期間，病毒與宿主的免疫反應(yīng)之間的平衡是至關(guān)重要的。免疫系統(tǒng)使病毒受到控制，而病毒通過逃避免疫反應(yīng)以避免被清除進行對抗，最終在許多情況下，平衡傾向于有利于病毒并引起疾病。在最持久的病毒感染中，病毒抗原持續(xù)存在，使病毒特異性T細胞功能失調(diào)。[0007]在過去的20年中，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染已成為流行病，超過4千萬人感染獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)，并已經(jīng)有超過2千萬人死亡。來自暴露的未感染的數(shù)據(jù)以及來自長期非進展者的數(shù)據(jù)強烈地表明HIV特異性CD8+和CD4+T的細胞功能對于保護性免疫力是必不可少的。
[0008]雖然⑶4 (+) T輔助細胞對病毒的反應(yīng)受損，HIV特異性⑶8 (+) T細胞以高頻度持續(xù)存在于HIV感染患者中，但是，與其它分化的效應(yīng)細胞毒性T淋巴細胞不同，大部分CD8 (+) T細胞持續(xù)表達腫瘤壞死因子受體家族成員⑶27。⑶27的配體(⑶70)在HIV感染宿主中也是過表達的，因此HIV特異性⑶8 (+) T細胞上⑶27表達的表達性質(zhì)和潛在功能結(jié)果是令人感興趣的。源自相同HIV特異性克隆的CD27(+)和CD27(-)T細胞的分析顯示CD27的保留不干擾效應(yīng)器功能的獲得，并且在T細胞受體刺激后，同時通過⑶27刺激的⑶27 (+)細胞比CD27(-)T細胞對細胞凋亡、白細胞介素2的產(chǎn)生和增殖表現(xiàn)更強的抗性。在轉(zhuǎn)移回HIV感染的患者后，自體HIV特異性CD27 (-) T細胞快速消失，但是源自相同克隆的CD27 (+) T細胞以高頻度持續(xù)存在。因此表明在HIV感染中CD27-CD70相互作用可提供具有存活優(yōu)勢的CD27(+) CD8 (+) T細胞，并且可補償限制或缺乏CD4 (+)T輔助以保持CD8應(yīng)答(Ochsenbein等，Exp Med.2004Dec6;200(ll): 1407-17)。
[0009]與HIV類似，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，除HIV外的持續(xù)性病毒感染的患者具有不完全分化但不僅表達⑶28也表達⑶27的中間功能效應(yīng)記憶T細胞亞型。已經(jīng)顯示這些細胞比缺乏⑶28和⑶27的成熟⑶8+T細胞具有更高的增殖能力(Decrion等，Immunology, 121, 405-415，2007)。
[0010]因此，在大部分感染慢性病毒病的個體、長期非進展者的疾病進程的延遲或停滯以及ー些暴露于病毒的個體對感染的保護中，在病毒特異性CTL反應(yīng)的效力和特異性與病毒載量的大小和臨床結(jié)果之間具有很強的相關(guān)性。増加病毒特異性CTL反應(yīng)的質(zhì)量和廣度，可能將增加慢性感染個體中病毒復制的控制，以及穩(wěn)定或改善其臨床病程。
[0011]因此，對抗病毒感染和增加CTL反應(yīng)的ー種策略是過繼T細胞治療，其中涉及效應(yīng)T細胞的轉(zhuǎn)移，以恢復宿主中特異性T細胞應(yīng)答。過繼細胞轉(zhuǎn)移治療是施用間接體外活化和擴增的自體病毒反應(yīng)性T細胞。
[0012]在目前HIV患者的過繼免疫治療的方法中，轉(zhuǎn)移的CTL下降的問題顯著。雖然外周血中轉(zhuǎn)移的CTL下降部分反映遷移到淋巴結(jié)位點，但是隨著時間的推移抗病毒活性喪失表示在HIV復制的這些局部位點CTL死亡或表現(xiàn)功能異常。對轉(zhuǎn)移的⑶8+CTL提供幫助的策略應(yīng)當改善CTL的存活并闡明CTL用于控制HIV感染和其它病毒感染的進程的治療潛力。
[0013]因此，非常需要ー種改善的制備在抗原特異性T細胞活化期間增加其増殖和存活的針對病毒感染的用于過繼免疫治療的T細胞群的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明涉及ー種體外用于激發(fā)適合施用于病毒感染患者的抗原特異性⑶4+和/或CD8+T細胞的方法。所述方法包括共培養(yǎng)來自待治療的患者的靶T細胞、樹突細胞、感染材料或感染相關(guān)蛋白質(zhì)或肽、以及淋巴細胞。所述淋巴細胞針對抗原呈遞細胞(APC)上的MHC I類和/或MHC II類抗原致敏。所述淋巴細胞通過混合白細胞反應(yīng)致敏。
[0015]本發(fā)明也涉及通過所述方法獲得的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞及其用途?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0016]圖1說明，針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體外周血單核細胞(PBMC)上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的淋巴細胞顯著增強了相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的成熟單核細胞來源的DC上⑶70的表達。
[0017]圖2說明，針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體PBMC上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的Y射線照射的淋巴細胞顯著增強了相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的成熟單核細胞來源的DC上⑶70的表達。
[0018]圖3說明，將針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體PBMC上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的淋巴細胞和相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的單核細胞來源的DC共培養(yǎng)6天誘導大量產(chǎn)生IL-12。
[0019]圖4說明，將針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體PBMC上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的淋巴細胞和相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的單核細胞來源的DC共培養(yǎng)6天誘導大量產(chǎn)生IFN- y。
[0020]圖5說明，將針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體PBMC上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的淋巴細胞和相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的單核細胞來源的DC共培養(yǎng)6天誘導大量產(chǎn)生IL-2。
[0021]圖6說明，將a)針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體PBMC上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的照射的淋巴細胞，和b)相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的單核細胞來源的DC共培養(yǎng)，誘導較高數(shù)目的來自第三方供體的表達CD27的同種異體反應(yīng)性⑶8+T細胞。
[0022]圖7說明，將針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體PBMC上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的照射的淋巴細胞加入至相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的單核細胞來源的DC中，降低了來自第三方供體的細胞凋亡(膜聯(lián)蛋白V陽性)同種異體反應(yīng)性⑶8+T細胞的數(shù)目。
[0023]圖8說明，將針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體PBMC上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的照射的淋巴細胞加入至相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的單核細胞來源的DC中，在用相對于初次刺激期間使用的DC為自體的B細胞再刺激的同種異體反應(yīng)性CD8+淋巴細胞中誘導較強(6倍)的二次增殖反應(yīng)。
[0024]圖9說明，將針對在常規(guī)MLR中照射的同種異體PBMC上表達的MHC抗原已經(jīng)致敏的照射的淋巴細胞加入至相對于在最初致敏MLR期間用做刺激細胞的照射的PBMC為自體的單核細胞來源的DC中，通過相對于在初次刺激期間使用的DC為自體的B細胞再刺激的同種異體反應(yīng)性⑶8+淋巴細胞誘導IFN- y的產(chǎn)生適度(3倍)增加。
[0025]圖10說明，在用a)活化的同種異體細胞和抗原負載擴增(a、b和C)，用抗原負載的自體DC但無活化的同種異體細胞擴增(d、e和f)以及用活化的同種異體細胞與非負載的自體DC擴增(g，h和i)后的病毒特異性CD8陽性細胞(分別對CMV、EBV或甲型流感病毒特異)的頻度。
【具體實施方式】[0026]定義
[0027]在描述本發(fā)明前，應(yīng)該理解，本文中使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的而不意于限制，本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求和其等同物限定。
[0028]必需注意，除了上下文清楚指明外，在本說明書和所附權(quán)利要求中使用的単數(shù)形式“ー個”、“ー種”和“所述”包括復數(shù)指示物。
[0029]并且，在應(yīng)用時，術(shù)語“約”用于表示給定值的+/-2%的偏差，優(yōu)選地表示數(shù)值的+/-5%，最優(yōu)選地表示數(shù)值的+/-10%。
[0030]本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抗原特異性”涉及在自身MHC分子上呈遞的短的獨特肽序列的獨特T細胞受體(TCR)的特異性識別/結(jié)合。
[0031]本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“激發(fā)”和“活化”涉及在原初抗原特異性T細胞中發(fā)生的程序化活化過程，所述原初抗原特異性T細胞由同時存在或不同時存在“輔助”細胞的抗原呈遞細胞刺激。[0032]本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“應(yīng)答細胞”涉及不同的淋巴細胞亞群，包括但不限于通過活化和/或增殖應(yīng)答共培養(yǎng)的同種異體PBMC的T細胞、NK細胞和NKT細胞。
[0033]本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“致敏細胞”涉及不同的淋巴細胞亞群，包括已經(jīng)通過共培養(yǎng)的同種異體細胞(包括PBMC)預(yù)活化的T細胞、NK細胞和NKT細胞。
[0034]本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“靶細胞”涉及通過同種異體或自體APC或抗原呈遞自體APC刺激的CD4+或CD8+T細胞?；颊吡馨图毎?靶細胞)收集的部位可以，例如為外周血或骨髄。
[0035]本發(fā)明的上下文中，與單核細胞來源的DC相關(guān)的術(shù)語“成熟”涉及用微生物產(chǎn)物(如LPS)或炎性介質(zhì)(如TNF- a和/或IL_1 ^ )刺激未成熟DC而誘導的“成熟標記物”(包括但不限于CD40、CD86、CD83和CCR7)的表達。
[0036]未成熟DC是表征為高內(nèi)吞活性和低T細胞活化潛力的細胞。未成熟DC經(jīng)常取樣于周圍環(huán)境的病原體，如病毒和細菌。未成熟DC吞曬病原體并將它們的蛋白質(zhì)降解成小碎片，在成熟時使用MHC分子將那些片段呈遞在它們的細胞表面。同時，它們上調(diào)在T細胞活化中作為共受體的細胞表面受體，如CD80、CD86和CD40，極大增強了它們活化T細胞的能力。它們也上調(diào)CCR7，所述CCR7是誘導樹突細胞經(jīng)過血流進入脾或通過淋巴系統(tǒng)進入淋巴結(jié)的趨化因子受體。在此，它們作為抗原呈遞細胞:通過向其呈遞源自病原體的抗原和非抗原特異性共刺激信號，它們活化輔助性T細胞和殺傷T細胞以及B細胞。成熟的DC可能由單核細胞、(身體中循環(huán)的白細胞)產(chǎn)生，并且依賴于正確的信號，可以轉(zhuǎn)變成DC或巨噬細胞。而單核細胞由骨髄中的干細胞形成。單核細胞來源的DC可以從外周血單核細胞體外產(chǎn)生。
[0037]本發(fā)明的上下文中，術(shù)語細胞的“非増殖”用于指使細胞不能進行細胞分裂以形成子代。然而，細胞可能能夠?qū)Υ碳の飸?yīng)答，或生物合成和/或分泌細胞產(chǎn)物(如細胞因子)。使細胞非增殖的方法是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的使細胞非增殖的方法為用抗增殖的藥物如絲裂霉素C處理或照射如Y射線照射處理。已經(jīng)被固定或透性化和不能分裂的細胞也是非增殖細胞的實例。
[0038]本發(fā)明上下文中，術(shù)語“混合淋巴細胞反應(yīng)”、“混合淋巴細胞培養(yǎng)”、“MLR”和MLC可互換使用，指的是包含同種異型不同的最少兩個不同細胞群的混合物。至少ー種同種異型不同的細胞是淋巴細胞。將所述細胞在合適的條件下一起培養(yǎng)一段時間以產(chǎn)生淋巴細胞的刺激。MLR的慣常的目的是提供同種異體刺激，如可引發(fā)淋巴細胞的増殖；但是除非特別指明，不需要在培養(yǎng)期間的増殖。在適當?shù)纳舷挛闹?，這些術(shù)語或者可以指源自這種培養(yǎng)的細胞混合物。
[0039]如文中使用的，術(shù)語“治療”指的是試圖改變待治療的個體或細胞的自然過程的臨床干預(yù)，并且可以用于預(yù)防或在臨床病理學過程期間進行。期望的效果包括防止疾病的發(fā)生或重發(fā)，緩解癥狀和減少疾病的任何直接或間接病理學后果、降低疾病進展的速度、改進或減輕疾病狀態(tài)和緩解或改善預(yù)后。
[0040]術(shù)語“抗原呈遞細胞”、“APC”等包括來自待治療患者或者來自表達與來自待治療的患者的APC上表達的MHC II類抗原相同的至少ー種MHC II類抗原的非相關(guān)血液供體的PBMC、單核細胞、B細胞或單核細胞來源的DC。
[0041]本發(fā)明的上下文中，“慢性感染”為逃避宿主的免疫系統(tǒng)的長期持續(xù)性感染。慢性感染可以由細菌或病毒引起。引起慢性感染的病毒的非限制性實例是人類免疫缺陷病毒(HIV)、こ型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、巨細胞病毒(CMV)和EB (Epstein-Barr)病韋(E)BV )。
[0042]本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“培養(yǎng)”指的是在多種培養(yǎng)基中細胞或生物體的體外增殖。應(yīng)該理解，在培養(yǎng)中生長的細胞后代可以與親代細胞(在形態(tài)、遺傳或表型上)不完全相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基的實例為RPMI培養(yǎng)基或Eagles最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EMEM)。
[0043]術(shù)語“主要組織相容性復合體”和“ MHC”指的是編碼需要用于將抗原呈遞至T細胞和用于快速移植物排斥的細胞表面分子的基因復合體。在人中，MHC復合體也已知為HLA復合體。由MHC復合體編碼的蛋白質(zhì)被稱為“MHC分子”并且被分類為I類和II類MHC分子。I類MHC分子包括由與(62- 微球蛋白非共價連接的MHC中編碼的鏈組成的膜異二聚體蛋白質(zhì)。I類MHC分子由幾乎所有有核細胞表達，并且顯示在抗原呈遞至⑶8+T細胞中起作用。I類分子包括人中的HLA-A、-B和-C。I類分子通常結(jié)合長度為8-10個氨基酸的肽。II類MHC分子也包括膜異二聚體蛋白質(zhì)。
[0044]已知II類MHC分子也參與抗原呈遞至⑶4+T細胞，并且在人中，包括HLA-DP、-DQ和DR。II類分子通常結(jié)合長度為12-20個氨基酸殘基的肽。術(shù)語“MHC限制”指的是允許T細胞僅識別被加工后的抗原的特性，并且產(chǎn)生的抗原肽與自身I類或自身II類MHC分子
聯(lián)合展示。
[0045]本文中使用的術(shù)語“疫苗”、“免疫原”或“免疫原性組合物”指的是，當施用于人或動物受試者時能賦予一定程度特異免疫力的化合物或組合物。如本公開內(nèi)容中所使用的，“細胞疫苗”或“細胞免疫原”指的是包含至少ー個細胞群(任選地失活的細胞群)作為活性成分的組合物。本發(fā)明的免疫原和免疫原性組合物是有活性的，這表示它們能刺激至少部分由宿主的免疫系統(tǒng)介導的特異性免疫學反應(yīng)(如抗病毒抗原或抗病毒反應(yīng))。免疫學反應(yīng)可以包含抗體、免疫反應(yīng)性細胞(如輔助/誘導物或細胞毒性細胞)或其任意組合，并且優(yōu)選針對在治療針對的病毒上存在的抗原?？梢酝ㄟ^施用單劑量或多劑量在受試者中引起或再刺激所述反應(yīng)。
[0046]如果能夠a)在首次被試驗的個體中產(chǎn)生針對抗原(如病毒抗原)的免疫反應(yīng)；或b)如果沒有施用化合物或組合物，將不發(fā)生個體中重組、增強或維持免疫應(yīng)答，那么所述化合物或組合物是“免疫原性的”。當施用單劑量或多劑量吋，如果能達到這些標準的任ー個，則組合物是免疫原性的。
[0047]本發(fā)明涉及同種異體致敏的同種異體淋巴細胞(ASAL)的制備，以促進抗原特異性T細胞在其通過自體抗原呈遞細胞，包括樹突細胞(DC)的活化期間的增殖和存活的增加。
[0048]本發(fā)明基于體外研究，所述體外研究使用來自人健康血液供體的外周血單核細胞(PBMC)和其亞群，證實在誘導抗原特異性人CD8+T細胞應(yīng)答中ASAL的陽性調(diào)節(jié)作用。使用同種異體的體外模型，追蹤在ASAL存在下同種異體反應(yīng)性CD8+T細胞的増殖和存活，在再刺激后増殖能力増加5倍以上，而細胞凋亡性細胞死亡降低10-5%。
[0049]加入ASAL導致強烈上調(diào)抗原呈遞DC上共刺激分子⑶70的表達和IL-12和IFN- y的產(chǎn)生，所述IL-12和IFN- y兩個因子對T細胞發(fā)展成為I型⑶4+和⑶8+T細胞有公知的積極影響。此外，加入ASAL也導致產(chǎn)生公知的T細胞生長因子IL-2。特別地，最近顯示，CD70介導的相互作用在連續(xù)輪次的整個分裂過程中促進活化的T細胞的存活，從而有助于效應(yīng)T細胞的累積。
[0050]本發(fā)明涉及ー種體外用于激發(fā)適合施用于病毒感染患者的抗原特異性⑶4+和/或CD8+T細胞的方法。所述方法包括共培養(yǎng)來自待治療患者的靶T細胞和DC (優(yōu)選單核細胞來源的DC)、自體或同種異體感染材料或感染相關(guān)蛋白質(zhì)或肽、以及針對抗原呈遞細胞(APC)上MHC I類和/或MHC II類抗原致敏的淋巴細胞。所述APC優(yōu)選地相對于所述淋巴細胞為同種異體的。所述DC可以是自體的或同種異體的。
[0051]本發(fā)明還提供了制備用于過繼免疫治療的T細胞群的方法，包括將T細胞改造(通過病毒轉(zhuǎn)導，轉(zhuǎn)染，電穿孔或其它引入遺傳物質(zhì)的方法)以表達識別靶抗原的T細胞受體或嵌合T細胞受體；在抗⑶3抗`體和致敏淋巴細胞存在下用抗原負載的DC活化這些改造的T細胞；在培養(yǎng)物中擴增這些靶細胞；以及將這些細胞再引入回患者。更具體而言，ー種體外用于激發(fā)適合施用于病毒感染患者的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞的方法，其中所述CD4+和/或CD8+T細胞已經(jīng)被遺傳操作。所述方法包括共培養(yǎng)來自待治療患者的病毒抗原受體轉(zhuǎn)染的靶T細胞與DC (優(yōu)選單核細胞來源)、抗CD3抗體以及針對抗原呈遞細胞(APC)上MHC I類和/或MHC II類抗原致敏的淋巴細胞。
[0052]可以用編碼T細胞受體(TCR)的基因轉(zhuǎn)化靶T細胞，或者通過使用能以非MHC限制的方式將興奮信號傳遞至T細胞的嵌合抗原受體(CAR)轉(zhuǎn)化靶T細胞。因此，與人類白細胞抗原基因型無關(guān)，這些由細胞外的抗原識別域與細胞內(nèi)T細胞活化域融合組成的雜合蛋白質(zhì)可以用于患者。在轉(zhuǎn)染之前，優(yōu)選將靶T細胞預(yù)先用抗CD3抗體刺激，以優(yōu)化隨后的轉(zhuǎn)導。本發(fā)明中可以使用任何合適的CAR。CAR配體可以由病毒表達。選擇和制備合適的CAR在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。
[0053]通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法，如病毒或非病毒載體(參見，例如Samtoook等，分子克隆，實驗室手冊，第3版，第1_3卷，冷泉港實驗室，冷泉港，NY)，可以將編碼TCR或CAR的基因轉(zhuǎn)導到T細胞中。病毒載體的非限制性實例包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體，非限制性非病毒載體系統(tǒng)包括質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)。
[0054]待擴增的來自患者的淋巴細胞可以源自外周血或骨髓。[0055]病毒感染可以是慢性病毒感染。引起慢性病毒感染的病毒的非限制性實例為HIV、HBV,HCV,CMV和EBV。慢性病毒感染的患者具有非活性病毒特異性CTL，因此是用于本發(fā)明的激發(fā)抗原特異性Thl細胞或CTL的方法的合適的靶。非活性HIV特異性CTL以高濃度存在于HIV患者中。非活性CTL高度表達⑶70受體⑶27，使得本發(fā)明的激發(fā)的抗原特異性Thl細胞或CTL特別適合施用于HIV患者。
[0056]ASAL為獲得自與DC和靶細胞一起培養(yǎng)的混合淋巴細胞反應(yīng)的應(yīng)答細胞。當靶細胞被遺傳操作時，也向培養(yǎng)物中加入抗⑶3抗體。ASAL選自由外周血淋巴細胞，包括⑶4+T細胞、⑶8+T細胞和自然殺傷(NK)細胞組成的組。靶細胞為優(yōu)選對于DC為自體的⑶4+和/或CD8+T細胞，以及DC優(yōu)選為單核細 胞來源的。所述單核細胞來源的DC負載有病毒材料或病毒相關(guān)蛋白質(zhì)或肽或病毒來源抗原。
[0057]加入ASAL進ー步導致表達高水平⑶27的靶⑶8+T細胞群的富集。⑶27+CD8+T細胞由于能夠提供用于增殖的抗原驅(qū)動自分泌信號，它們代表潛在的用于過繼免疫治療的更有效的CTL (細胞毒性T細胞)。這種不依賴輔助體的⑶8T細胞不需要以IL-2或⑶4+T細胞形式的外源輔助以存活和擴增。因此，本發(fā)明通過向受試者提供⑶8+T細胞群，提供了用于治療免疫介導疾病的方法，所述CD8+T細胞群在沒有或少量存在額外的細胞因子(如IL-2)或CD4+T細胞時，被程序化了強細胞毒性活性。所述方法特別用于間接體內(nèi)擴增細胞溶解性、病毒特異性CD8+T細胞，但是也用于擴增病毒特異性CD4+T細胞。
[0058]以CD8+T淋巴細胞總數(shù)的百分數(shù)表示的細胞溶解性抗原特異性CD8+T細胞的百分數(shù)優(yōu)選至少約5%,更優(yōu)選至少約10%,更優(yōu)選至少約15%,更優(yōu)選至少約20%,甚至更優(yōu)選至少約25%，甚至更優(yōu)選至少約30%和最優(yōu)選至少約35%。
[0059]更具體而言，本發(fā)明的方法涉及ー種體外用于激發(fā)適合施用于病毒感染患者的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞的方法，其中所述方法包含下述步驟:
[0060]a)將非増殖抗原呈遞細胞與相對于所述非増殖抗原呈遞細胞為同種異體的外周血單核細胞一起培養(yǎng)，
[0061]b)在允許單核細胞成熟為成熟DC的組合物(下面進ー步描述所述組合物)中培養(yǎng)單核細胞，和
[0062]c)培養(yǎng)來自步驟a)的淋巴細胞，包括但不限于⑶4+T細胞、⑶8+T細胞和/或自然殺傷(NK)與來自步驟b)的成熟DC。
[0063]通過首先在包含GM-CSF和IL_4的組合物中培養(yǎng)單核細胞約2_7天(優(yōu)選約5天)以獲得未成熟DC，隨后加入能使未成熟DC成為成熟DC的第二組合物，通過培養(yǎng)至少約12-72小時(優(yōu)選約24-48小時)而獲得單核細胞來源的DC。所述第二組合物包含能使未成熟DC成為成熟的單核細胞來源的DC的組分，所述成熟單核細胞來源的DC可用于活化⑶4+和⑶8+T細胞。在一種實施方式中，所述第二組合物包含TNFa、IL-1 3、干擾素 Y、干擾素 P 和 TLR3 配體，如聚 1:C(Mailliard 等，Alpha-type-lpolarizedDしs:a novel immunization tool with optimized しi'L_inducing activity?しancerRes.2004;64:5934-5937.) o在另ー種實施方式中，所述第二組合物包含干擾素y、TLR3和/或TLR4配體和TLR7和/或TLR8配體和/或TLR9配體。TLR3配體的非限制性實例是聚I:C, TLR7/8配體的非限制性實例是R848，以及TLR9配體的非限制性實例是CpG。
[0064]同種異體淋巴細胞的致敏作用是通過傳統(tǒng)的混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR或MLC-混合淋巴細胞培養(yǎng))誘導的，所述傳統(tǒng)的混合淋巴細胞反應(yīng)包括培養(yǎng)失活的抗原呈遞細胞與相對于抗原呈遞細胞為同種異體的外周血單核細胞(PBMC)。進行MLR是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(Jordan WJ, Ritter MA.0ptimal analysis of composite cytokine responses duringalloreactivity.J Immunol Methods2002; 260:1-14)。在 MLR 中，來自兩個個體的外周血淋巴細胞在組織培養(yǎng)中混合在一起數(shù)天。來自不相容個體的淋巴細胞將相互刺激以顯著増殖(例如通過氚標記的胸腺嘧啶攝取進行測定)，而來自相容個體的淋巴細胞則不相互刺激。在單向MLC中，來自個體之一的淋巴細胞(通常用毒素，如絲裂霉素處理，或者用照射，如Y射線照射處理)被失活，從而僅使未處理的剰余的細胞群應(yīng)答外源組織相容性抗原而増殖。
[0065]在MLR中使用的抗原呈遞細胞選自由PBMC和單核細胞來源的DC組成的組。單核細胞來源的DC來自患者或來自健康供體，即可以為自體的或同種異體的。
[0066]感染材料或感染相關(guān)蛋白質(zhì)或肽選自由來自患者的滅活病毒顆粒、與患者的病毒感染相同類型的同種異體病毒顆粒以及分離和純化的病毒蛋白質(zhì)或肽組成的組。分離和純化的病毒蛋白質(zhì)或肽對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。在一種實施方式中，病毒材料是通過用編碼病毒蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)染而負載到單核細胞來源的DC中的病毒蛋白質(zhì)。
[0067]在本發(fā)明的方法中，將細胞(來自待治療患者的T細胞、單核細胞來源的樹突細胞、病毒材料或病毒相關(guān)蛋白質(zhì)或肽、以及針對抗原呈遞細胞(APC)上的MHC I類和/或MHCII類抗原致敏的淋巴細胞)共培養(yǎng)至少約20天, 優(yōu)選約6-20天,更優(yōu)選約8-14天。
[0068]在本發(fā)明的方法的一種實施方式中，向細胞培養(yǎng)物中加入抗CD3抗體、外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗IL-4和/或IL-21以優(yōu)化細胞增殖和存活。
[0069]通過將激發(fā)的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞與新DC、新致敏的淋巴細胞一起培養(yǎng)，以及任選地向細胞培養(yǎng)物中加入抗⑶3抗體和/或外源性1レ2、1レ7、1レ15、抗1レ4和/或IL-21也可以再刺激所述激發(fā)的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞
[0070]本發(fā)明也涉及通過上述方法獲得的免疫原性組合物以及通過上述方法獲得的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞。
[0071]抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞適合施用于患者，并且優(yōu)選地具有至少以下特征之一:
[0072]一能増殖但不會快速達到細胞凋亡
[0073]—表達低水平的細胞凋亡標記物膜聯(lián)蛋白V
[0074]一在細胞表面表達⑶27和/或⑶28
[0075]本發(fā)明也涉及通過本發(fā)明的方法獲得的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞用作為藥物和在制備藥物中使用。
[0076]此外，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明或如上所限定的方法獲得的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞的用途，用于治療病毒感染，如慢性病毒感染，或用于引發(fā)人中的抗感染免疫學反應(yīng)，以及用于制備用于治療病毒感染，如慢性病毒感染的藥物，或用于制備用于引發(fā)人中的抗病毒免疫學反應(yīng)的藥物?？梢栽诘谝淮未碳ず蠡蛘咴谠俅碳ぶ?，施用所述CD4+和/或CD8+T細胞。在一種實施方式中，所述CD4+和/或CD8+T細胞與治療性抗病毒疫苗組合施用。
[0077]在人受試者的治療中使用用于過繼細胞治療的T細胞群的方法是本領(lǐng)域臨床醫(yī)生已知的。根據(jù)文中描述的和本領(lǐng)域中已知的方法制備的T細胞群可以用于這種方法。例如，使用CMV特異性T細胞的過繼細胞治療用于治療CMV感染(Einsele等，Blood; 2002 (99) 3916-3922)和 HIV 特異性 CD8+T 細胞用于 HIV 感染患者(Ochsenbein等，J.Exp.Med.; 2004 (200) 1407-1417)。
[0078]在體外初始DC介導的激發(fā)期間暴露于ASAL時，在再刺激后，抗原激發(fā)T細胞經(jīng)歷增殖增加和細胞凋亡降低。因此，本發(fā)明也涉及如果在疫苗接種前和/或疫苗接種期間過繼轉(zhuǎn)移回患者，用于基于疫苗接種而增強次級T細胞應(yīng)答的方法。
[0079]本發(fā)明也提供用于改善病毒疫苗治療的方法。許多病毒表達可以潛在作為用于被免疫系統(tǒng)破壞的靶的外源抗原。病毒疫苗在受試者中產(chǎn)生包含體液成分和細胞成分的全身病毒特異性免疫反應(yīng)。所述反應(yīng)通過皮下、肌內(nèi)或經(jīng)ロ施用疫苗組合物由受試者自身免疫系統(tǒng)引發(fā)?？贵w或免疫細胞結(jié)合病毒抗原并裂解病毒。然而，在疫苗接種被病毒感染折磨的患者時，仍然需要増加T細胞應(yīng)答性。因此，在疫苗接種前或疫苗接種時，過繼轉(zhuǎn)移預(yù)活化的具有高増殖潛力的細胞凋亡抗性病毒特異性T細胞可以增強體內(nèi)疫苗介導的免疫反應(yīng)。
[0080]根據(jù)本發(fā)明的組合物可以與治療性抗病毒疫苗組合施用。
[0081]通過本發(fā)明的方法獲得的細胞可以直接施用于生物體，如人，以在抗原特異性T細胞活化時增加其増殖和存活。這些細胞，常常與藥學可接受的載體以用于將細胞引入最終與哺乳動物血液或組織細胞接觸的任何途徑施用。
[0082]適合用于腸胃外施用，例如通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑施用的制劑和載體包括含水等滲無菌注射溶液以及含水和非含水無菌懸浮液，所述含水等滲無菌注射溶液可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使所述制劑與預(yù)接受者的血液等滲的溶質(zhì)，所述含水和非含水無菌懸浮液可以包括懸浮劑、增溶剤、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐剤。靜脈內(nèi)施用是施用本發(fā)明的CD4+和/或CD8+T細胞的優(yōu)選方法。
[0083]在本發(fā)明的上下文`中，施用于患者的⑶4+和/或⑶8+T細胞的劑量應(yīng)當足以增強患者的免疫反應(yīng)。因此，向患者施用足以引起對病毒抗原有效的免疫反應(yīng)和/或減輕、降低、治愈或至少部分阻止疾病的癥狀和/或并發(fā)癥的量的細胞。足夠達到所述效果的量被定義為“治療有效劑量”。所述劑量通過產(chǎn)生的細胞的活性和患者的狀況，以及待治療的患者的體重或表面積確定。在確定在治療或預(yù)防疾病中待施用的細胞的有效量時，醫(yī)生需要評價疾病的進展和針對任何相關(guān)病毒抗原的免疫反應(yīng)的誘導。
[0084]本發(fā)明包含上述公開的實施方式的任意組合。
[0085]本發(fā)明通過下述非限制性實例進行進ー步說明。
[0086]實施例
[0087]實施例1.⑶70的表達
[0088]材料和方法:在組織培養(yǎng)瓶中通過在無血清X-VIV015培養(yǎng)基中以1:1的比例，將來自健康血液供體的Y射線照射的PBMC與來自同種異體供體(相對于健康血液供體)的未照射的PBMC共培養(yǎng)5-7天，在標準單向混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)中產(chǎn)生同種異體致敏的同種異體淋巴細胞(ASAL)。對于未成熟DC的增埴,在密度梯度(Lymphoprep, Nycomed,奧斯陸，挪威)上分離獲自健康血液供體的外周血單核細胞(PBMC)。分離的PBMC在AM-V培養(yǎng)基(Invitrogen，佩斯里，英國)中重新懸浮，以2.5X IO6個細胞每孔鋪在24孔塑料培養(yǎng)板中，并使其粘附2小吋。除去非粘附的細胞，并將剰余的粘附的單核細胞在添加重組人 GM-CSF 和 IL-4 (R&D Systems, Abingdon,英國；均為 1，000U/mL)的AM-V培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天。在孵育的最后24小時，通過添加含有IFN-a (3，000U/mL)、IFN- y (I, 000U/mL)、TNF- a (50ng/mL)、IL-1 ^ (25ng/mL)(均來自 R&D Systems)和 p_1:C(Sigma-Aldrich; 20 u g/mL)的培養(yǎng)基誘導未成熟DC的成熟。
[0089]通過FACS分析確定，成熟的DC群均含有70%以上的CD83+DC。
[0090]洗滌后，成熟的DC與同種異體致敏的未照射的或Y射線照射(25Grey)的同種異體淋巴細胞在X-VIV015培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24小吋，并通過FACS進行分析。通過在無血清培養(yǎng)基(X-VIV015)中用Y射線照射的PBMC作為刺激細胞和未照射的PBMC作為應(yīng)答細胞進行原代單向MLR5-6天，進行同種異體反應(yīng)性淋巴細胞的致敏。PE結(jié)合的抗人CD70抗體用于FACS研究。
[0091]結(jié)果:如圖1所示，已經(jīng)在常規(guī)MLR中針對照射的PBMC被激發(fā)的同種異體淋巴細胞(同種異體致敏的同種異體淋巴細胞，ASAL)顯著增強了相對于在MLR中使用的照射的PBMC為自體的成熟單核細胞來源的DC上⑶70的表達。
[0092]如圖2所示，類似地，Y射線照射的同種異體淋巴細胞增強了⑶70的表達。
[0093]如圖3、4和5所示，成熟DC與致敏的同種異體淋巴細胞的共培養(yǎng)誘導大量產(chǎn)生IL-12、IFN-Y 和 IL-2。
[0094]實施例2
[0095]材料和方法:參見實施例1的材料和方法。
[0096]在共培養(yǎng)DC、照射的同種異體致敏的淋巴細胞和PBMC (相對于DC為同種異體的)6天后，(用抗體包被的磁珠進行陰性選擇)分離CD8+淋巴細胞，然后用B細胞(相對于在初次刺激期間使用的DC為自體的)再刺激，對CD27的表達和膜聯(lián)蛋白V染色。用FACS進行隨后的分析。
[0097]結(jié)果:如圖6所示，在用B細胞再刺激CD8+細胞時，在初次刺激期間加入同種異體致敏的淋巴細胞大大增加了 CD27的表達。
[0098]當用B細胞再刺激CD8+細胞時，在初次刺激期間加入同種異體致敏的淋巴細胞大大降低了膜聯(lián)蛋白V (細胞凋亡標記物)的表達(參見圖7)。
[0099]實施例3
[0100]材料和方法:參見實施例2的材料和方法。
[0101]在用B細胞再刺激之前，將激發(fā)和分離的⑶8+細胞用3H-胸苷脈沖。
[0102]結(jié)果:如圖8所示，在再刺激后，在初次刺激期間加入同種異體致敏的淋巴細胞強烈地增加了⑶8+細胞的增殖反應(yīng)(通過摻入3H-胸苷測定，cpm/min，第3天)。
[0103]實施例4
[0104]材料和方法:參見實施例3的材料和方法。
[0105]在共培養(yǎng)B細胞和預(yù)活化的⑶8+細胞2天后，收集培養(yǎng)上清液，通過常規(guī)ELISA(R&D Systems)分析 IFN-Y 的產(chǎn)生。
[0106]結(jié)果:圖9示出再刺激后，在初次刺激期間加入同種異體致敏的淋巴細胞大大增加了⑶8+細胞的IFN-Y的產(chǎn)生。
[0107]實施例5 =ASAL増加了在初次體外刺激后產(chǎn)生的抗原特異性CD8+T細胞的頻度
[0108]材料和方法:使用密度介質(zhì)分離來自健康血液供體的外周血單核細胞(PBMC)，并且根據(jù)標準程序使用單克隆抗體和流式細胞術(shù)對HLA-A2進行分型，并冷凍。解凍后，將PBMC在塑料孔中孵育，以通過塑料吸附富集單核細胞，在漂洗掉非粘附的細胞后，在含有GM-CSF和IL-4的細胞培養(yǎng)基中孵育5天。然后將未成熟DC在細胞因子混合物(含IL-1 ^、TNF- a、IFN- a和INF- y )和來自CMV、EBV和甲型流感病毒的抗原重疊MHC I類結(jié)合肽的混合物(PX14ProMix CEF pool (標準)；來自Proimmune LTD,牛津,英國的肽文庫。這種混合物不限于ー種HLA類型)中孵育48小時(DC的成熟以及用抗原肽脈沖)。
[0109]平行地，在混合白細胞反應(yīng)(MLR)中產(chǎn)生活化的同種異體PBMC，其中PBMC來自不同的血液供體。在第7天，解凍新ー批的PBMC，并如上所述，用脈沖的DC和活化的同種異體PBMC擴增7天。然后將細胞在含有IL-2的細胞培養(yǎng)基中孵育7天使T細胞受體在細胞表面重新出現(xiàn)(在活化期間T細胞內(nèi)化它們的受體)。然后(如上所述)將細胞用脈沖的DC再刺激，I小時后進行五聚體染色，以及24小時后，根據(jù)制造商的說明進行IFN-Y形成細胞的測定(用于人IFN-Y的ELISpot PLUS，Mabtech，斯德哥爾摩，瑞典)。病毒特異性細胞的數(shù)目測定為IFN-Y點每加入的IO6個細胞。加入藻紅蛋白結(jié)合的五聚體A*02:01-NLVPMVATV(用于 CMV)、A*02:01-GLCTLVAML (用于 EBV)和 A*02:01-NLVPMVATV (用于甲型流感病毒)(均來自Proimmune Ltd)，在室溫下黑暗溫育10分鐘后，加入針對⑶3和⑶8的單克隆抗體(來自BD Biosciences, San Jos6，CA，美國)。在冰上黑暗孵育20分鐘后，將細胞在流式細胞儀(FACSCanto，使用FACDdiva軟件，BD Biosciences)中分析。病毒特異性T細胞的頻度表示為％的⑶8陽性細胞。
[0110] 結(jié)果:結(jié)果示于圖10和下表1中。
[0111]在用活化的同種異體細胞擴增和在無活化的同種異體細胞的對照培養(yǎng)物中孵育后，病毒特異性CD8陽性細胞(分別對CMV、EBV或A型流感病毒特異)的頻度升高。如圖10中所示。
[0112]表1.顯示在用活化的同種異體PBMC擴增后的病毒特異性細胞的頻度(表示為IFN-Y點每IO6個細胞)
[0113]
實驗 _IFN-Y 產(chǎn)生(細胞/IO6) ( ELISPOT )—
用活化的同種異體PBMC擴增并用脈>5000
沖的DC再刺激的CMV特異性細胞__
無活化的同種異體PBMC擴增并用脈250
沖的DC再刺激的CMV特異性細胞__
用活化的同種異體PBMC擴增并用脈60*
沖的DC再刺激的非病.特異性細胞
[0114]*僅DC給出68個細胞/IO6的背景
[0115]雖然文中詳細公開了特定實施方式，其已經(jīng)通過實施例方式僅用于說明目的完成，并且不意于限制隨后所附權(quán)利要求的范圍。具體而言，本發(fā)明的發(fā)明人預(yù)期可以對本發(fā)明進行多種替代、改變和修飾而不背離權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。
【權(quán)利要求】
1.ー種體外用于激發(fā)適合施用于病毒感染患者的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞的方法，所述方法包括共培養(yǎng)來自待治療患者的靶T細胞、單核細胞來源的樹突細胞、病毒材料或病毒相關(guān)蛋白質(zhì)或肽、以及針對相對于淋巴細胞為同種異體的抗原呈遞細胞(APC)上的MHC I類和/或MHC II類抗原致敏的淋巴細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述致敏由包括培養(yǎng)非増殖抗原呈遞細胞與外周血單核細胞(PBMC)的混合白細胞反應(yīng)誘導，其中，所述PBMC相對于非增殖抗原呈遞細胞是同種異體的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述抗原呈遞細胞選自由PBMC和單核細胞來源的樹突細胞組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述單核細胞來源的樹突細胞來自患者或來自健康供體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過首先在包含GM-CSF和IL-4的組合物中培養(yǎng)單核細胞約1-7天以獲得未成熟樹突細胞，以及隨后加入能使未成熟樹突細胞成為成熟樹突細胞的第二組合物通過培養(yǎng)至少約12小吋，獲得單核細胞來源的樹突細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述第二組合物包含TNFa、IL-1 P、干擾素Y、干擾素a或0和TLR3配體 ，如聚1: C和/或TLR4配體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述第二組合物包含TNFa、干擾素Y、TLR3配體和/或TLR4配體和TLR7和/或TLR8激動劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述TLR3配體是聚1:C，所述TLR8激動劑是R848。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述感染材料或感染相關(guān)蛋白質(zhì)或肽選自由來自患者的滅活病毒顆粒、與患者的病毒相同類型的同種異體病毒顆粒、以及已知的分離的和純化的病毒蛋白質(zhì)或肽組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述病毒材料為通過用編碼病毒蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)染而負載至成熟樹突細胞中的病毒蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項所述的方法，其中，所述細胞培養(yǎng)至少約20天，優(yōu)選約6-20天，更優(yōu)選約8-14天。
12.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項所述的方法，其中，向細胞培養(yǎng)物中加入抗CD3抗體和/或外源性 IL-2、IL-7、IL-15、抗 IL-4 和/或 IL-21。
13.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項所述的方法，其中，通過將激發(fā)的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞與新樹突細胞、新致敏的淋巴細胞一起培養(yǎng)和任選地向細胞培養(yǎng)物中加入抗⑶3抗體和/或外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗IL-4和/或IL-21再刺激激發(fā)的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞。
14.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項所述的方法，其中，所述病毒感染為慢性病毒感染。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述慢性病毒感染選自由HIV、HBV、HCV、CMV和EBV組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法獲得的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞。
17.適合施用于患者的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞，其中所述⑶4+和/或⑶8+T細胞: 一具有増殖能力但不會快速達到細胞凋亡 一表達低水平的膜聯(lián)蛋白V，和/或 一在其細胞表面表達⑶27和/或⑶28。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞作為藥物。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞用于治療病毒感染或用于在人中引發(fā)抗病毒免疫學反應(yīng)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞，其中，所述CD4+和/或CD8+T細胞與治療性病毒疫苗組合施用。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞，其中，在第一次刺激后施用所述⑶4+和/或CD8+T細胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的抗原特異性CD4+和/或CD8+T細胞，其中，在再刺激后施用所述CD4+和/或CD8+T細胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求16或17任一項所述的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞的用途，用于制備藥物。
24.根據(jù)權(quán)利要求16或17任一項所述的抗原特異性⑶4+和/或⑶8+T細胞的用途，用于制備用于治療慢性病毒感染的藥物或用于引發(fā)人中抗病毒免疫學反應(yīng)的藥物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，其中，所述CD4+和/或CD8+T細胞與治療性抗病毒`疫苗組合施用。
26.根據(jù)權(quán)利要求24-25中任一項所述的用途，其中，在第一次刺激后施用所述CD4+和/或⑶8+T細胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求24-25中任一項所述的用途，其中，在再刺激后施用所述CD4+和/或⑶8+T細胞。
【文檔編號】A61K39/12GK103533955SQ201280018223
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月13日
【發(fā)明者】亞歷克斯·卡爾松-帕拉, 安娜-卡林·瓦爾格倫, 本特·安德松 申請人:因繆尼卡姆股份公司