肉毒桿菌毒素凍干制劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種肉毒桿菌毒素凍干制劑，該凍干制劑不包含源自動物的蛋白質穩定劑。本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑可維持肉毒桿菌毒素的活性，還能在貯存，運送及操作肉毒桿菌時可能發生的高溫條件下展示出良好的長期的貯存穩定性。
【專利說明】肉毒桿菌毒素凍干制劑
【技術領域】
[0001]本發明涉及肉毒桿菌毒素凍干制劑，該凍干制劑不包含源自動物的蛋白質穩定劑。
【背景技術】
[0002]肉毒桿菌毒素為厭氧性細菌梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)的多肽產物，是能夠特異性地作用于神經細胞的毒性物質。雖然肉毒桿菌毒素本為ー種能致死的毒性物質，然而最近用于治療頸部肌張カ障礙、眼瞼痙攣、多汗癥、斜視、失弛緩癥(achalasia)、神經源性膀胱、泌尿系統疾病、偏頭痛等。將肉毒桿菌毒素應用于藥物組合物的例子有現在由本發明人所銷售的Meditoxin Inc.。
[0003]諸多具有藥理效果的蛋白質具有粘附于固體表面的特性。因此，將其注入容器中時，部分蛋白質會粘附于容器內壁上而帶來活性成分的損失。此外，蛋白質易被氧化或被降解成小片段，因此有必要添加穩定劑，使之當作能夠防止蛋白質氧化或降解的物質。
[0004]最近，作為肉毒桿菌毒素的穩定劑可使用白蛋白和明膠。白蛋白可通過減少注入容器時由蛋白質的粘附或稀釋所造成的蛋白質的變性來降低蛋白質活性成分的損失。明膠為將膠原蛋白水解而獲得的物質，有時可代替白蛋白而使用。然而，由于白蛋白和明膠是源自動物的蛋白質，有種危險是可能會攜帯來源于血液的病原體或潛在感染劑。因此，需要一種非源于動物且不會損失肉毒桿菌毒素活性的穩定劑。
[0005]為此，本發明人通過韓國公布專利公告第2009-0005963號已公開了在常溫下具有長期穩定性的、包含肉毒桿菌毒素、蛋氨酸及聚山梨酯20的肉毒桿菌毒素的藥物液態組合物。然而，所述液態組合物很難在常溫以上的高溫下維持肉毒桿菌毒素的穩定性。
【發明內容】
[0006]技術問題
本發明在于提供ー種在常溫以上的高溫下能長期地維持貯存穩定性的肉毒桿菌毒素凍干制劑。
[0007]技術方案
對于傳統的肉毒桿菌毒素制劑來說，在冷藏或常溫下可維持肉毒桿菌毒素的穩定性。然而，在高溫下很難長期地維持肉毒桿菌毒素的活性。因此，本發明人研發出在寬的溫度范圍如冷凍溫度、冷藏溫度、常溫和高溫下也能長期地維持肉毒桿菌毒素的活性、且具有優秀的貯存穩定性的肉毒桿菌毒素凍干制劑。
[0008]由此，本發明提供ー種藥物凍干制劑，該藥物凍干制劑包含I)肉毒桿菌毒素；2)聚山梨酯；3)蛋氨酸；及選自4)糖、糖醇和離子化合物中的至少ー種成分。
[0009]有益效果
本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑可以維持肉毒桿菌毒素的活性，而且在保藏、運送以及操作時可能出現的高溫條件下還能展示出良好的長期的貯存穩定性。【具體實施方式】
[0010]本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑包含傳統的液態制劑中所包含的I)肉毒桿菌毒素；2)聚山梨酯；3)蛋氨酸；其特征在于，該肉毒桿菌毒素凍干制劑還包含作為附加成分的、選自4)糖、糖醇及離子化合物中的至少ー種。
[0011]將肉毒桿菌毒素制成凍干劑型時，所述附加成分起到不僅能夠維持肉毒桿菌毒素的活性，還在常溫以上的高溫下穩定活性的作用。對于包含I)肉毒桿菌毒素；2)聚山梨酯；3)蛋氨酸的組合物，進行凍干時該組合物的穩定性會下降，而且被制成液態制劑時在常溫以上的高溫下其穩定性也會下降。反之，本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑不僅在常溫以上的高溫下能夠維持肉毒桿菌毒素的活性，而且還具有良好的長期的貯存穩定性。
[0012]本發明的凍干制劑所包含的肉毒桿菌毒素可來源于梭狀芽孢桿菌。本發明的凍干制劑所包含的肉毒桿菌毒素可通過公知方法從上述菌株中分離并純化而得，或將市場上可見的產品用作所述肉毒桿菌毒素。
[0013]本發明的凍干制劑所包含的肉毒桿菌毒素可從肉毒桿菌血清型(Serotype)A, B、C、D、E、F及G中任意選取。根據免疫識別法，可以將肉毒桿菌毒素分為血清型A、B、C、D、E、F及G。所有的血清型肉毒桿菌毒素會阻斷神經肌接頭中的信號傳遞分子こ酰膽堿的分泌來產生麻痹神經的效果，然而不同的血清型可作用于不同的動物種類，而且具有不同的麻痹程度、持續時間等。
[0014]此外，梭狀芽孢桿菌細菌在產生毒素蛋白時，通過形成各種能夠輔助并保護肉毒桿菌毒素蛋白的功能的血凝素(Hemagglutinin)和非血凝素蛋白、以及各種復合物來產生肉毒桿菌毒素蛋白。本發明的凍干制劑所包含的肉毒桿菌毒素可包含含有復合蛋白的復合物形式和未含有復合蛋白的形 式。肉毒桿菌毒素的活性不會因是否含有所述復合蛋白而受影響。
[0015]在本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑中，聚山梨酯為肉毒桿菌毒素的穩定劑的一種，是非離子型表面活性剤，在制藥或食品領域主要用作乳化剤。根據氧乙烯基團總數量，聚山梨酯的種類包括聚山梨酷20、40、60、80和100。對于本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑，可使用上述所有的聚山梨酷。相對于肉毒桿菌毒素100単位，聚山梨酯的含量為0.01~2mg的。在此范圍內，不僅可在常溫以上的高溫下維持肉毒桿菌毒素的活性，還可以維持長期的貯存穩定性。
[0016]此外，蛋氨酸，ー種穩定劑，作為肉毒桿菌毒素的穩定劑，可代替動物蛋白質如白蛋白或明膠來使用。相對于肉毒桿菌毒素100單位，蛋氨酸的含量為0.01~10mg。在此范圍內，不僅可在常溫以上的高溫下維持肉毒桿菌毒素的活性，還可以維持長期的貯存穩定性。
[0017]與傳統的液態制劑不同，除了蛋氨酸和聚山梨酯外，本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑還包含4)糖、糖醇及離子化合物中的至少ー種。
[0018]已知，糖能防止高分子的變性。可用于本發明的凍干制劑包括，如海藻糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、棉子糖、乳糖、葡萄糖等，但不限于此。相對于肉毒桿菌毒素100単位，所述糖的含量為0.1~50mg。在此范圍內，不僅可在常溫以上的高溫下維持肉毒桿菌毒素的活性，還可以維持長期的貯存穩定性。[0019]已知，糖醇可在液態下或在凍干時能穩定高分子并防止其變性。可用于本發明的凍干制劑包括，如環糊精、甘露醇、山梨糖醇、甘油、木糖醇、肌醇等，但不限于此。相對于肉毒桿菌毒素100単位，所述糖醇的含量為0.1~50mg。在此范圍內，不僅可在常溫以上的高溫下維持肉毒桿菌毒素的活性，還可以維持長期的貯存穩定性。
[0020]此外，離子化合物指鹽或緩沖液。離子化合物可通過特異性或非特異性的結合與高分子反應。鹽可以增強熱穩定性，増加溶解度，而且可以減少聚集程度。然而，需要注意的是，在高濃度的鹽中蛋白質可易于變性。因此，可用于本發明的凍干制劑包括，如氯化鈉、磷酸鈉、磷酸銨、硫酸鎂、こ酸鈉、乳酸鈉、琥珀酸鈉、丙酸鈉、磷酸鉀等，但不限于此。相對于肉毒桿菌毒素100單位，所述離子化合物的含量為0.1~10mg。在此范圍內，不僅可在常溫以上的高溫下維持肉毒桿菌毒素的活性，還可以維持長期的貯存穩定性。
[0021]本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑可從特定的培養基內所培養的梭狀芽孢桿菌的培養物中制備而得，但本發明不限于此。通過一系列酸沉淀從培養物溶液中對肉毒桿菌毒素復合物進行純化來獲得由活性高分子量毒素蛋白及相關血凝素蛋白組成的肉毒桿菌毒素復合物晶體。將所述晶體復合物溶解于含有鹽水和穩定劑的溶液中，然后將其凍干而制成肉毒桿菌毒素凍干制劑。 [0022]實施例
通過參考后續的實施例可明確本發明的優點和特征、以及獲得所述優點和特征的方法。然而，本發明不會受以下所公開的任一試驗實施例的限制，而且可通過多種形式來實現。這些試驗實施例是為了使本發明公開完整，并讓本領域的技術人員理解本發明的范疇而所提供。本發明的范圍應根據所附的權利要求書的范圍而定。
[0023]【實施例1】肉毒桿菌毒素凍干制劑的制備
本發明的肉毒桿菌毒素凍干制劑是將已滅菌處理的、包含肉毒桿菌毒素、蛋氨酸和聚山梨酷、以及糖或糖醇和/或離子化合物的溶液進行凍干處理而制得。
[0024](肉毒桿菌毒素的穩定性測試)
肉毒桿菌毒素的穩定性可通過貯存一段期間后的活性的持續性來判斷，而肉毒桿菌毒素的活性的持續性可通過小鼠LD5tl的致死率來測定。在40°C、相対濕度70%下將所述凍干制劑劑型貯存30天，然后溶解于生理鹽水中。而后，給3只小鼠腹腔注射相當于2.5LD50 IU的肉毒桿菌毒素。當2只或以上小鼠死亡時，就能確認穩定性在持續，在下面表中以死亡率表示。小鼠的死亡率達50%或以上時，可評估出維持了肉毒桿菌毒素的活性。
[0025](滴定法)
如下進行滴定法。在2個裝有試樣的瓶中分別加入2.8ml生理鹽水。從所述瓶中提取
4.4ml試樣，然后將1.45ml生理鹽水加入于試樣中而獲得測試溶液I。將1.45ml生理鹽水加入于4.4ml測試溶液I中而獲得測試溶液2。通過相同方法，重復稀釋溶液8次來制得各測試溶液。給17~22g重量的小鼠(⑶1，雌性)腹腔注射測試溶液3~6，每種測試溶液各注射10只，每只各注射0.1ml，經過3天后測定死亡率。用概率法對結果進行統計處理而獲得小鼠LD5tl和滴度。
[0026]【實施例2】肉毒桿菌毒素的穩定劑的選取 (I)蛋氨酸和聚山梨酯組合的選取
從已知的作為肉毒桿菌毒素的穩定劑的成分的人血清白蛋白和聚山梨酯組合中選取代替人血清白蛋白的穩定劑。
[0027]表1
【權利要求】
1.ー種藥物凍干制劑，其包括: 肉毒桿菌毒素、聚山梨酯和蛋氨酸；以及 選自糖、糖醇和離子化合物中的ー種或多種成分。
2.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素選自肉毒桿菌血清型ム、8、(:、0、￡、？及6。
3.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在于，所述肉毒桿菌毒素為不含復合蛋白的形式或含有復合蛋白的復合物形式。
4.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在于，所述聚山梨酯為聚山梨酯20、40、60、80和100中的任ー種。
5.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在于，相對于100単位肉毒桿菌毒素，所述聚山梨酯的含量為0.01~2mg。
6.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在于，相對于100単位肉毒桿菌毒素，蛋氨酸的含量為0.01~10mg。
7.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在于，所述糖為選自海藻糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、棉子糖、乳糖和葡萄糖中的ー種或多種。
8.根據權利要求1所述 的藥物凍干制劑，其特征在于，相對于100単位所述肉毒桿菌毒素，所述糖的含量為0.1~50mg。
9.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在干，所述糖醇為選自環糊精、甘露醇、山梨糖醇、甘油、木糖醇和肌醇中的ー種或多種。
10.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在于，相對于100単位所述肉毒桿菌毒素，所述糖醇的含量為0.1~50mg。
11.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在干，所述離子化合物為選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸銨、硫酸鎂、こ酸鈉、乳酸鈉、琥珀酸鈉、丙酸鈉和磷酸鉀中的ー種或多種。
12.根據權利要求1所述的藥物凍干制劑，其特征在于，相對于100単位所述肉毒桿菌毒素，所述離子化合物的含量為0.1~10mg。
【文檔編號】A61P13/10GK103596580SQ201280016784
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年3月30日 優先權日:2011年3月31日
【發明者】鄭賢壕, 楊基奕, 李昌勛, 金學友, 金勝范, 白承煥 申請人:株式會社美得拓石