用于產生蛋白復合物的方法和包含該蛋白復合物的疫苗組合物的制作方法

用于產生蛋白復合物的方法和包含該蛋白復合物的疫苗組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及產生用于疫苗組合物的熱休克蛋白復合物的方法。特別地，提供了用于通過使細胞經受特定的誘導應激的刺激增強在細胞中產生的熱休克蛋白復合物的水平和免疫原性的方法。本發明還延及根據本發明的方法產生的熱休克蛋白復合物在制備用于預防和治療傳染病和癌性病癥的疫苗組合物中的用途。
【專利說明】用于產生蛋白復合物的方法和包含該蛋白復合物的疫苗組合物
發明領域
[0001]本發明涉及用于產生熱休克蛋白復合物的方法。本發明還延及根據本發明的方法產生的熱休克蛋白復合物在制備用于預防和治療傳染病和癌性病癥的疫苗組合物中的用途。
[0002]發明背景
[0003]熱休克蛋白(hsp，HSP)是廣泛分布遍及植物和動物界的高度保守的蛋白家族。基于它們的分子量，主要的熱休克蛋白被分成6個不同的家族:小(hsp20-30kDa) ；hsp40 ；hsp60 ；hsp70 ；hsp90和hsplOO。熱休克蛋白在原核和真核細胞二者中遍在表達，其中它們在多肽的折疊和去折疊中行使分子伴侶的功能。熱休克蛋白的另外的作用是伴隨肽從一個細胞區室至另一個細胞區室和，在病變細胞的情況下，熱休克蛋白還已知伴隨病毒或腫瘤相關肽至細胞表面用于呈遞至免疫系統。
[0004]盡管熱休克蛋白最初在經受熱應激的細胞中被鑒定出，但它們的產生可由一些其他形式的應激，諸如感染、滲透應激、細胞因子應激和類似的應激造成。因此，基于它們的表達不單由熱應激造成，熱休克蛋白還通常被稱為應激蛋白(SP)。然而，由不同應激刺激誘導的基因的轉錄分析顯示細胞暴露于不同的誘導應激的刺激之后誘導不同組的基因(Bacon&Marsh (2007) Curr.Mol.Med.7:277-86)。此外，單個應激調節子是獨立被誘導(vanBogelen 等人(1987) J.Bact.169:26-32 和 Wilkes 等人(2009)Applied and Environmental Microbiol.75:981 - 990)并被調節的(Holmes 等人(2010)Microbiology 156:158-166)。特別地,vanBogelen顯示了不同誘導應激的刺激引起不同的熱休克蛋白基因被表達并當四種誘導應激的刺激被檢測時，只有一種類型的誘導應激的刺激造成了這些基因的特異性表達。
[0005]盡管熱休克蛋白本身可被用作疫苗組合物中的免疫原性決定簇，當施用至受試對象時，觀察到熱休克蛋白和肽、特別是抗原肽片段之間形成的復合物介導增強的免疫應答。此外，已知熱休克蛋白可產生可被分類為組成型產生的熱休克蛋白復合物或誘導型熱休克蛋白復合物的復合物。組成型產生的熱休克蛋白復合物是包含在正常穩態條件下產生的熱休克蛋白的熱休克蛋白復合物。誘導型熱休克蛋白復合物是當細胞被暴露于應激條件時產生的。當處于應激狀態時，細胞上調應激蛋白的產生，這些上調的熱休克蛋白被稱為誘導型熱休克蛋白。此外，這些誘導型熱休克蛋白與肽片段形成復合物，所述復合物被認為比細胞不處于應激條件下時形成的復合物更具免疫原性。此類誘導型熱休克蛋白復合物高出組成型熱休克蛋白復合物的增強的免疫原性在W001/13943中被例證。不希望被理論束縛，本發明人預測在誘導型熱休克蛋白復合物中觀察到的增強的免疫原性不是由于復合物的實際的應激蛋白組分的不同，而是由于引起細胞內的蛋白去折疊或變性的應激條件。熱休克蛋白因此與蛋白或蛋白片段復合以阻止它們去折疊，或再折疊它們，并與蛋白片段復合作為細胞抗原加工通路的部分。
[0006]包含熱休克蛋白復合物(其還可被稱為應激蛋白復合物)的疫苗組合物作為免疫原性決定簇是廣為人知的。由于它們顯示了給予抗感染和疾病的廣泛的、保護性免疫的前景，此類疫苗具有顯著的潛力。熱休克蛋白復合物作為抗特定癌癥的疫苗是有效的也已被廣泛證明。已顯示從熱-休克BCG細胞中分離的源自病原體的應激蛋白復合物在被接種的宿主中誘導T-輔助性I (Thl)淋巴細胞介導的免疫應答，其在小鼠肺結核的氣溶膠攻擊模型中給予抗活的攻擊的保護性免疫(國際PCT專利申請號W001/13944)。此外，已在W002/20045、W000/10597和W001/13943中顯示了從病原體或被病原體感染的細胞中分離的應激蛋白復合物作為抗傳染病的疫苗中的免疫原性決定簇是有效的。
[0007]有多種途徑產生用于治療和預防傳染病的包含應激蛋白復合物的疫苗組合物。W095/24923公開了包含源自宿主真核細胞的熱休克蛋白和源自病原體的抗原肽片段的組成型熱休克蛋白復合物。W001/13943公開了在使用誘導應激的刺激諸如熱或細胞因子諸如腫瘤壞死因子(TNF)之后被誘導的熱休克蛋白復合物。所述應激蛋白可包含源自宿主細胞的應激蛋白，或可選地，源自入侵病原體的應激蛋白，所述應激蛋白被復合至源自入侵病原體的肽。W001/13944公開了在經受誘導應激的刺激的病原體之后產生的應激蛋白復合物，其中該應激蛋白和相關肽片段直接源自該病原體。
[0008]發明概述
[0009]在大量的實驗之后，本發明人驚人地觀察到，使用多種誘導應激的刺激，典型地熱應激和呼吸應激或熱應激和基于酸的應激產生的誘導型熱休克蛋白復合物，當與暴露于單一類型的誘導應激的刺激之后產生的誘導型應激蛋白復合物相比，增強了細胞中產生的誘導型應激蛋白復合物的量。特別地，本發明人`已觀察到，在將一個或多個細胞暴露于多種應激刺激之后產生的熱休克蛋白-肽復合物(HspC)的量可導致所產生的熱休克蛋白-肽復合物的數量的4倍增加。由于預防性或治療性疫苗的大規模生產將需要大量的熱休克蛋白復合物，較高產量的熱休克蛋白-肽復合物的產生具有顯著的商業相關性。此外，本發明人還驚人地鑒定了，使用多種誘導應激的刺激諸如熱應激和呼吸應激或熱應激和基于酸的應激產生的誘導型熱休克蛋白-肽復合物，比僅使用單一的誘導應激的刺激諸如單獨的熱休克產生的誘導型熱休克蛋白復合物更具免疫原性。
[0010]根據本發明的第一方面，提供了用于產生在應激蛋白和肽之間形成的應激蛋白復合物的方法，所述方法包括以下的步驟、由以下的步驟組成、或基本上由以下的步驟組成:
[0011]-培養細胞，
[0012]-將所述細胞暴露于多種誘導應激的刺激，和
[0013]-從該細胞中純化應激蛋白復合物。
[0014]在某些實施方案中，肽為肽片段。在某些實施方案中，肽為抗原肽或抗原肽片段。在某些實施方案中，肽源自典型造成傳染病的病原生物體，例如原核生物(例如，革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌)、原生動物、病毒、寄生物或真菌。
[0015]在某些實施方案中，其中肽源自細菌，該細菌選自以下組成的組:埃希氏菌屬(Escherichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、博代氏菌屬(Bordetella)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線菌屬(Actinomycetes)、鏈霉菌屬(Streptomycetes)、諾卡菌屬(Nocardia)、腸桿菌屬(Enterobacter )、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弗朗西斯氏菌屬(Fancisella)、巴氏桿菌屬(Pasturella)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、布蘭漢氏球菌屬(BranhameIIa)> 放線桿菌屬(Actinobacillus)、鏈桿菌屬(StreptobaciIIus)> 李斯特菌屬(Listeria)、鞘桿菌屬(Calymmatobacterium)、布魯氏菌屬(Brucella)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、密螺旋體屬(Treponema)、沙門氏菌屬(Salmonella)、克雷伯菌屬(Kleibsiella)、弧菌屬(Vibrio)、變形菌屬(Proteus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、包柔螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、螺菌屬(Spirillum)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、志賀菌屬(Shigella)、軍團桿菌屬(Legionella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)>立克次體屬(Rickettsia)、衣原體屬(Chlamydia)、包柔螺旋體屬(Borrelia)和支原體屬(Mycoplasma)。
[0016]在某些實施方案中，其中肽源自病毒，該病毒選自以下組成的組:人類免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳頭瘤病毒、卡波濟氏肉瘤相關皰疹病毒、單純性皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、西尼羅病毒、圣路易斯腦炎病毒、裂谷熱病毒、流感病毒、冠狀病毒、鼻病毒、腺病毒、SIV、輪狀病毒、人乳頭瘤病毒、蟲媒病毒、麻疹病毒、脊髓灰質炎病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、水痘帶狀皰疹病毒、水痘病毒、漢坦病毒和巨細胞病毒。
[0017]在某些實施方案中，肽為腫瘤特異性抗原。
[0018]在某些實施方案中，將細胞暴露于多種誘導應激的刺激包括將細胞暴露于至少兩種誘導應激的刺激。典型地，細胞被暴露于兩種不同類型的誘導應激的刺激，但可被暴露于三種或多種不同類型的誘導應激的刺激。在某些實施方案中，誘導應激的刺激可選自但不限于以下組成的組:熱應激、呼吸應激(氧饑餓或增加)、氧化應激(H202、Fe)、基于酸的應激諸如PH改 變、重金屬應激、滲透應激、代謝物限制和養分饑餓諸如碳或鐵限制。在某些優選的實施方案中，誘導應激的刺激為熱應激和以下的至少一種應激:呼吸應激、氧化應激(H202、Fe)、基于酸的應激(pH4)、重金屬應激、滲透應激、代謝物限制和養分饑餓諸如碳或鐵限制，且特別地可以是熱應激和呼吸應激或熱應激和基于酸的應激。典型地至少兩種誘導應激的刺激被順序地施加至細胞。在某些實施方案中，至少兩種誘導應激的刺激被順序地施加。
[0019]在某些實施方案中，本發明因此提供了用于產生在應激蛋白和抗原肽之間形成的復合物的方法，所述方法包括以下的步驟、由以下的步驟組成、或基本上由以下的步驟組成:
[0020]-培養細胞，
[0021]-將所述細胞暴露于熱應激，
[0022]-將所述細胞暴露于呼吸應激，和
[0023]-從該細胞中純化熱休克蛋白復合物。
[0024]典型地，所述細胞被同時暴露于熱應激和呼吸應激。
[0025]在可選的實施方案中，本發明提供了一種用于產生在應激蛋白和抗原肽之間形成的復合物的方法，所述方法包括以下的步驟、由以下的步驟組成、或基本上由以下的步驟組成:
[0026]-培養細胞，[0027]-將所述細胞暴露于熱應激，
[0028]-將所述細胞暴露于基于酸的應激，和
[0029]-從該細胞中純化熱休克蛋白復合物。
[0030]典型地，將所述細胞同時暴露于熱應激和基于酸的應激，即，將該細胞暴露于熱應激并同時暴露于基于酸的應激。
[0031]在某些實施方案中，熱應激或熱休克包括將培養的細胞所暴露的熱增加至細胞正常生長溫度之上約5°C至10°C的溫度。因此，如果細胞典型在37°C生長，那么熱應激可包括將細胞所暴露的溫度增加至約44°C。在某些實施方案中，通過升高發酵罐內的溫度獲得所述溫度的增加，例如其可被用于在約42°C至44°C培養所培養的細胞。在某些實施方案中，通過以在0.25°C至0.5°C每分鐘或約0.25°C至0.5°C每分鐘的速率(0.25-0.5°C /min)從正常生長溫度增加溫度獲得溫度的增加。在某些實施方案中，使細胞經受從約30分鐘至
2.5小時范圍的時間段的熱應激。在某些實施方案中，典型可持續I至2小時之間發生熱應激。
[0032]在某些實施方案中，呼吸應激指的是減少培養的細胞所暴露的氧的量。典型地，這包括限制引起所培養的細胞正常生理生長或穩態的對所培養的細胞的氧供給。在某些實施方案中，隨著培養溫度的增加，這可通過去除溶氧張力(DOT)的級聯控制獲得。在優選的實施方案中，可進一步通過手動減少攪拌速率限制溶氧張力，例如，減少至約320至350rpm。Clark 等人，(1985) Biotechnology and Bioengineering, 27:1507-1511 中描述了如何能夠通過攪拌速率控制發酵罐中的溶氧張力。在另外的實施方案中，通過用二氧化碳或氮部分或全部替代獲得氧限制。在某些優選的實施方案中，將呼吸應激施加至發酵罐中的細胞。在某些實施方案中，呼吸應激指的是增加被培養的細胞所暴露的氧的量。
[0033]在某些實施方案中，基`于酸的應激或酸應激包含減少所培養的細胞的pH至培養細胞所處的正常PH之下的pH，正常pH是引起細胞的正常生理生長或穩態的pH。在某些實施方案中，PH被降低至5.5、5、4.5或4。可通過添加酸，例如鹽酸至細胞降低pH。在某些實施方案中，將基于酸的應激施加至發酵罐中的細胞。
[0034]可同時或順序地將細胞暴露于多種誘導應激的刺激。因此，在某些實施方案中，在暴露于第二應激，諸如呼吸應激或基于酸的應激之前使細胞經受熱應激。在另外的實施方案中，使細胞同時經受熱應激和第二應激，諸如呼吸應激或基于酸的應激。在另外的實施方案中，可首先使細胞經受另外的應激諸如呼吸應激或基于酸的應激并隨后經受熱應激。
[0035]可通過使用施加誘導應激的刺激的標準方法確定優選的應激組合并隨后定量誘導的應激蛋白，諸如GroEL和DnaK。典型地，優選的應激組合增加誘導GroEL和DnaK 二者。可被用于定量誘導的應激蛋白的標準方法包括蛋白凝膠分析、光密度測定法、免疫印跡和ELISA。
[0036]病原細胞
[0037]在某些實施方案中，細胞為病原細胞。在某些實施方案中，病原細胞為非哺乳動物細胞，特別是可以為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌的原核細胞。在某些另外的實施方案中，病原細胞為微生物細胞、原生動物細胞或寄生蟲細胞。
[0038]在某些實施方案中，原核細胞是選自但不限于以下組成的組的細菌:埃希氏菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、博代氏菌屬、棒狀桿菌屬、分枝桿菌屬、奈瑟氏菌屬、嗜血桿菌屬、放線菌屬、鏈霉菌屬、諾卡菌屬、腸桿菌屬、耶爾森氏菌屬、弗朗西斯氏菌屬、巴氏桿菌屬、莫拉克斯氏菌屬、不動桿菌屬、丹毒絲菌屬、布蘭漢氏球菌屬、放線桿菌屬、鏈桿菌屬、李斯特菌屬、鞘桿菌屬、布魯氏菌屬、芽胞桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、密螺旋體屬、沙門氏菌屬、克雷伯菌屬、弧菌屬、變形菌屬、歐文氏菌屬、包柔螺旋體屬、鉤端螺旋體屬、螺菌屬、彎曲桿菌屬、志賀菌屬、軍團桿菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬、立克次體屬、衣原體屬、包柔螺旋體屬和支原體屬。
[0039]在某些實施方案中，細菌選自以下組成的組:奈瑟氏菌屬(例如腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis) MC58)、分枝桿菌(Mycobacteria)、梭狀芽胞桿菌屬(例如艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile))、酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和鏈球菌屬，例如肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)。當與從被暴露于僅一種類型的誘導應激的刺激的細胞中獲得的應激蛋白復合物相比，熱應激和呼吸應激的組合已顯示在奈瑟氏菌屬、分枝桿菌、酵母屬和梭狀芽胞桿菌屬中導致較高水平的應激蛋白復合物的產生。因此，在某些實施方案中，細胞是奈瑟氏菌屬(例如腦膜炎奈瑟氏菌MC58)、分枝桿菌、酵母屬(例如釀酒酵母)或梭狀芽胞桿菌屬(例如艱難梭狀芽胞桿菌)，且多種誘導應激的刺激包括熱應激和呼吸應激。當與從被暴露于僅一種類型的誘導應激的刺激的細胞中獲得的應激蛋白復合物相比，熱應激和基于酸的應激的組合已顯示在肺炎鏈球菌中導致較高水平的應激蛋白復合物的產生。因此，在某些實施方案中，細胞是鏈球菌屬，例如肺炎鏈球菌，且多種誘導應激的刺激包括熱應激和基于酸的應激。當與從被暴露于僅一種類型的誘導應激的刺激的細胞中獲得的應激蛋白復合物相比時，從被暴露于兩種不同類型的誘導應激的刺激的細胞中獲得的應激蛋白復合物還顯示了改進的免疫原性。
[0040]需氧細胞
[0041]在某些實施方案中，細胞是需氧細胞，例如病原需氧細胞。在細胞培養中的正常生長期間，細胞將具有對氧的最佳需求。例如，需氧細胞將需要氧用于生長和存活。氧水平的消耗將限制需氧細胞生長的能力。生長培養基中不存在氧時將最可能導致細胞的死亡。任何特定的細胞都將具有優選的溶氧張力(D0T)，這是被提供用于培養中的細胞的生長與穩態的氧供給。例如，細胞培養物可在具有> 10%至50%之間范圍的溶氧張力(DOT)下生長。在某些優選的實施方案中，溶氧張力(DOT)可以以或約>20%或約>30%的水平被提供。
[0042]兼性厭氧細胞
[0043]在某些實施方案中，細胞是兼性厭氧細胞，例如病原厭氧細胞。兼性厭氧生物體是通常通過需氧呼吸產生ATP的生物體。然而，當不存在氧時，兼性厭氧菌可轉向發酵。兼性厭氧菌因此在存在氧時存活，而專性厭氧菌則死亡。此外，生長環境中的氧濃度和可發酵的物質將影響兼性厭氧菌使用需氧呼吸還是發酵以獲得能量。氧水平的消耗將因此限制兼性厭氧菌生長的能力。然而，在生長培養基或環境中不存在氧可導致向厭氧生長的轉變。因此，將兼性厭氧細胞暴露于呼吸應激將包括小心管理細胞所暴露的溶氧張力(DOT)以誘導呼吸應激。呼吸應激的施加還可包括將可發酵物質從生長環境中去除。
[0044]厭氧細胞
[0045]在某些實施方案中，細胞是厭氧細胞，例如病原厭氧細胞。在本發明的某些實施方案中，應激蛋白復合物可源自厭氧病原體(專性厭氧菌)，特別是在氧存在時不能生長的厭氧細菌。因此，將呼吸應激施加至專性厭氧菌則需要將氧添加至培養基而不是去除，以給予氧化應激相關的誘導應激的刺激。因此，可通過將厭氧細胞培養物生長在以>10%至50%之間的范圍的溶氧張力(DOT)存在下使厭氧細胞培養物暴露于呼吸應激。在某些優選的實施方案中，可以以或約>20%或約>30%的水平提供溶氧張力(DOT)。
[0046]因此，在某些實施方案中，本方法包括用于產生在源自厭氧病原體的應激蛋白和抗原肽或抗原肽片段之間形成的復合物的方法，所述方法包括以下的步驟、由以下的步驟組成、或基本上由以下的步驟組成:
[0047]-在不存在氧的環境中培養厭氧病原細胞，
[0048]-將所述細胞暴露于熱應激，
[0049]-進一步將所述細胞暴露于呼吸應激，所述應激包括增加培養的細胞所暴露的氧的量，和
[0050]-從厭氧病原細胞中純化應激蛋白復合物。
[0051]在某些實施方案中，將所述細胞同時暴露于熱應激和呼吸應激，即，將該細胞暴露于熱應激并同時暴露于基于酸的應激。
[0052]在某些實施方案中，氮可存在于培養基中以補償氧的缺乏。
[0053]癌性細胞
[0054]在某些實施方案中，細胞為癌性細胞。因此，在某些實施方案中，本發明提供了一種用于產生在應激蛋 白和抗原肽之間形成的復合物的方法，所述方法包括以下的步驟、由以下的步驟組成、或基本上由以下的步驟組成:
[0055]-培養癌性細胞，
[0056]-將所述細胞暴露于熱應激，
[0057]-將所述細胞暴露于呼吸應激或基于酸的應激，和
[0058]-從癌性細胞中純化熱休克蛋白復合物。
[0059]典型地，將所述細胞同時暴露于熱應激和基于酸的應激或呼吸應激，即，將該細胞暴露于熱應激并同時暴露于基于酸的應激。
[0060]被遺傳修飾的細胞
[0061]在某些實施方案中，本發明延及已例如通過缺失hspR和/或hrcA被遺傳修飾以組成型表達熱休克蛋白的一個或多個細胞。根據本發明可使所述細胞進一步經受一種或多種另外的誘導應激的刺激。典型的另外的誘導應激的刺激包括呼吸應激諸如氧限制、PH應激(例如PH4的酸應激)和代謝物限制諸如碳或鐵限制。
[0062]原核熱休克蛋白家族DnaJ、DnaK、GroEL和GroES在操縱子中被編碼，操縱子中的初始基因為抑制被包含在操縱子中的熱休克蛋白基因的表達的控制基因。例如在鏈霉菌屬(Streptomyces)和螺桿菌屬(Helicobacter)中，hspR基因的表達抑制DnaJ和DnaK的表達。缺失hspR基因因此導致被遺傳修飾的組成型表達熱休克蛋白的微生物(見Bucca等人(2003)Mol.Microbiol50 (I) 153-166)。然而，應該注意的是兩個主要的熱休克蛋白家族DnaK和GroEL被兩個不同的調節子hspR和hrcA調節。在這些熱休克調節子中，hsp70/DnaK調節子在hspR的控制下，而hsp60/groEL調節子則在hrcA的控制下。最大上調Dnak和GroEL熱休克蛋白表達將需要缺失這兩個基因(Holmes等人(2010)Microbiologyl56:158-166 和 Aravindhan V.等人(2009)FEMS MicrobialLett.29242-49)。同源操縱子已在最近被測序的一些微生物包括鏈霉菌屬的其他菌株和結核分枝桿菌和常用的相關疫苗菌株BCG中被鑒定出。
[0063]其他抑制子基因也可控制其他應激蛋白的表達，且這些也可被遺傳修飾以提供組成型表達應激蛋白的被修飾的微生物。這些包括，但不限于，轉錄控制基因sigma和rho和應激基因調節蛋白基因hrcA、MerR和HmrR。
[0064]因此，本發明可進一步延及已被遺傳修飾以敲除控制熱休克蛋白表達的至少一個抑制子基因或使其失能的被遺傳修飾的病原體的用途，其中在分離和/或純化誘導型熱休克蛋白復合物用于在疫苗組合物中用作免疫原性決定簇之前使所述被遺傳修飾的病原體經受呼吸應激或酸應激。
[0065]在某些實施方案中，細胞是被遺傳修飾以致它們表達源自癌性細胞的異源蛋白的細胞。在可選的實施方案中，細胞是被遺傳修飾以致它們表達源自在宿主中引起傳染病的病原體的異源蛋白的細胞。
[0066]被感染的細胞
[0067]在某些實施 方案中，細胞是被病原生物體感染的宿主細胞。復合物可從源自宿主細胞的熱休克蛋白復合至源自入侵病原體的肽片段、或從都源自入侵病原體的熱休克蛋白和肽片段形成。
[0068]因此，在某些實施方案中，本發明提供了一種用于產生在熱休克蛋白和肽片段之間形成的復合物的方法，所述方法包括以下的步驟、由以下的步驟組成、或基本上由以下的步驟組成:
[0069]-培養被病原體感染的細胞，
[0070]-將所述細胞暴露于多種誘導應激的刺激，和
[0071]-從所培養的細胞中純化熱休克蛋白復合物。
[0072]在某些實施方案中，多種誘導應激的刺激包括至少2種被同時施加至細胞的誘導應激的刺激，并可包括熱應激和呼吸應激或熱應激和基于酸的應激。
[0073]本發明的方法有利地提供了被純化的熱休克蛋白復合物的混合物，其中該熱休克蛋白復合物的混合物包含熱休克蛋白的不同亞型。即，熱休克蛋白復合物的熱休克蛋白組分可以是不同熱休克亞型家族的熱休克蛋白。例如，可存在源自選自但不限于以下的類的熱休克蛋白的混合物:HSP60、HSP70和/或HSP90、或存在于真核細胞或病原細胞的任何其他熱休克蛋白類。在某些實施方案中，熱休克蛋白復合物包含或由GroEL(相當于哺乳動物細胞中HSP60的原核熱休克蛋白)和/或DnaK (相當于哺乳動物細胞中HSP70的原核熱休克蛋白)熱休克蛋白家族的熱休克蛋白組成是優選的。因此，在本發明的某些實施方案中，本文所使用的純化方法被用于純化蛋白復合物，其中熱休克蛋白組分包含DnaK和GroEL。
[0074]誘導和純化熱休克蛋白復合物
[0075]在某些實施方案中，從已經受誘導應激的刺激的細胞獲得的細胞裂解物中純化或分離熱休克蛋白復合物，所述細胞例如，病原細胞、癌性細胞或被病原體感染的細胞。
[0076]典型地，應激蛋白復合物包含不同熱休克蛋白類的熱休克蛋白。在某些實施方案中，熱休克蛋白為亞型DnaK和/或GroEL。所述純化和/或分離的熱休克蛋白復合物，或包含該熱休克蛋白復合物的制品或混合物，可隨后典型被用作疫苗組合物中的免疫原性決定簇以引起抗應激蛋白復合物源自其中的病原體或癌性細胞、或抗感染應激蛋白復合物源自其中的細胞的病原體的免疫應答和相關的保護性免疫。[0077]在某些實施方案中，純化熱休克蛋白復合物包括:
[0078](i)提供來自培養物細胞的澄清的細胞裂解物，其中該細胞裂解物包含應激蛋白復合物，
[0079](ii)使細胞裂解物經受使用離子交換的純化，其中將該細胞裂解物緩沖到目的熱休克蛋白復合物的Pl的2個單位以內的pH，且其中使用鹽梯度洗脫熱休克蛋白復合物，和
[0080](iii)獲得包含熱休克蛋白復合物的富集的制品。
[0081]在某些實施方案中，緩沖液包含可以以約0.1mM至IOOmM的濃度提供的二價陽離子。在某些實施方案中，二價陽離子為鎂鹽和/或錳鹽。在某些實施方案中，緩沖液還包含可以以約0.1mM至IOOmM的濃度提供的ADP (二磷酸腺苷)。
[0082]在某些實施方案中，熱休克蛋白復合物包含DnaK和/或GroEL類的熱休克蛋白。
[0083]疫苗組合物
[0084]典型地，通過本發明上述方面獲得的所述純化的熱休克蛋白復合物可被用作用于介導抗應激蛋白復合物源自其中的病原體的免疫應答的疫苗復合物中的免疫原性決定簇。
[0085]在多個另外的方面，本發明因此延及疫苗組合物、或介導或引起免疫應答的組合物，其包含通過本發明方法獲得的熱休克蛋白復合物。所述疫苗組合物典型被施用至哺乳動物，特別是人，以給予抗病原體的保護性免疫。然而，由于來自不同物種的應激蛋白的公認的高水平的同源性，疫苗組合物可被用于接種很多種動物。
[0086]如此，本發明另外的方面提供了疫苗組合物，包含通過本發明方法獲得的純化的熱休克蛋白復合物作為免疫原性決定簇。
[0087]在某些另外的方 面，本發明提供了根據本發明的疫苗組合物、或使用本發明的方法獲得的純化的和/或分離的熱休克蛋白復合物的混合物，用于在藥物中使用。
[0088]在本發明某些另外的方面，提供了根據本發明任何前述方面產生的熱休克蛋白復合物在制備用于預防或治療傳染病或癌性或惡性病癥的藥劑中的用途。
[0089]在某些另外的方面，本發明提供了用于在治療或預防傳染病或癌性或惡性病癥的疫苗組合物中使用的熱休克蛋白復合物。
[0090]在某些實施方案中，熱休克蛋白復合物或包含該熱休克蛋白復合物的疫苗組合物被作為預防性疫苗施用。在某些另外的實施方案中，純化的應激蛋白復合物或包含該純化的應激蛋白復合物的疫苗組合物被作為治療性疫苗施用。
[0091 ] 在多個另外的方面，本發明延及熱休克蛋白復合物或包含該熱休克蛋白復合物的制品或混合物、或包含該熱休克蛋白復合物的疫苗組合物，用作加強疫苗以增強宿主中產生的抗受試對象典型通過感染的方式或由于先前施用初次疫苗而暴露的病原體或癌抗原的免疫應答。
[0092]本發明的組合物可以被凍干或以含水的形式，即溶液或懸浮液。該類型的液體制劑允許組合物直接從它們的包裝形式施用，不需要在含水介質中重構，并因此用于注射是理想的。可將組合物存放在小瓶中，或將它們存放在現成的被充滿的注射器中。可提供具有或不具有注射針的注射器。注射器將包含組合物的單個劑量，而小瓶可包含單個劑量或多個劑量(例如，2個劑量)。
[0093]在多個另外的方面，本發明提供了用于產生疫苗組合物的方法，所述方法包括將本發明的純化的熱休克蛋白復合物、或包含該純化的熱休克蛋白復合物的制品或混合物與至少一種藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑一起混合的步驟。
[0094]在本發明的一個實施方案中，提供了用于在治療或預防病原性疾病的藥劑中使用的疫苗組合物，所述病原性疾病諸如由選自包括但不限于以下的組的病原細菌的感染造成的疾病:百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、破傷風梭狀芽胞桿菌(Clostridiumtetani)、艱難梭狀芽胞桿菌、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae b)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、霍亂弧菌(Vibrio Cholerae)和腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)。在本發明另外的實施方案中，提供了用于在治療或預防病原性疾病的藥劑中使用的疫苗組合物，所述病原性疾病諸如由選自包含但不限于以下的組的病原性或致癌病毒的感染引起的疾病:流感、肝炎、皰疹、人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類乳頭瘤病毒(HPV)、呼吸道合胞體病毒(RSV)、多瘤病毒、巨細胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(EBV)、輪狀病毒、諾如病毒、冠狀病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、卡波濟氏肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)、單純性皰疹病毒(HSV)、呼吸道合胞體病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、西尼羅病毒(WNV)、圣路易斯腦炎病毒(SLEV)、裂谷熱病毒(RVFV)、流感病毒、冠狀病毒、鼻病毒、腺病毒、SIV、輪狀病毒、蟲媒病毒、麻疫病毒、脊髓灰質炎病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、水痘帶狀皰疹病毒、水痘病毒、漢坦病毒和巨細胞病毒。
[0095]在本發明又另外的實施方案中，提供了用于在治療或預防癌癥和腫瘤疾病的藥劑中使用的疫苗組合物。
[0096]另外，本發明又另外的方面延及使受試對象典型地人對由以下造成的疾病免疫的方法:百日咳桿菌、破傷風梭狀芽胞桿菌、艱難梭狀芽胞桿菌、白喉棒狀桿菌、b型流感嗜血桿菌、結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌、傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏菌和病原性和致癌病毒，該方法包含對宿主施用本發明疫苗的免疫保護劑量。
`[0097]在每個疫苗劑量中抗原(即，免疫原性決定簇)的量被選擇為在被接種疫苗的受試對象中誘導免疫保護應答而不具有顯著不良副作用的量。抗原的量將取決于所采用的特定的免疫原和其呈遞的方式而不同。然而，當與包含使用本領域已知的生產方法獲得的蛋白復合物的相似量的疫苗組合物相比時，將被理解的是抗本發明的純化的復合物介導的增強的免疫應答將意味著，抗使用本方法產生的復合物將介導增強的免疫應答。
[0098]本發明還提供了本發明的熱休克蛋白復合物在接種受試對象以誘導抗源自病原體的傳染病或癌性或惡性病癥的免疫的方法中的用途。
[0099]因此，本發明又另外的方面提供了接種受試對象抗源自病原體的傳染病或癌性病癥的方法，所述方法包括步驟:
[0100]-提供包含根據本發明的任一方法提供的熱休克蛋白復合物作為免疫原性決定簇的疫苗組合物，所述熱休克蛋白復合物源自期望對其產生保護性免疫的已經受誘導熱休克和呼吸或基于酸的應激的刺激的癌性細胞、病原細胞或被病原體感染的細胞或表達異源抗原的細胞，且包含不同的熱休克蛋白類型作為混合物，和
[0101]-以足夠在受試對象中引起抗熱休克蛋白復合物的免疫應答的治療有效的或預防有效的量將包含熱休克蛋白復合物的疫苗組合物施用至受試對象。[0102]如本文所用的，術語“疫苗組合物”指包含以可以更好的應對隨后的攻擊、病原性感染或腫瘤發生這樣的方式刺激免疫系統的免疫原性決定簇的任何組合物。將被領會的是疫苗通常包含免疫原性決定簇和任選地佐劑，該佐劑用于非特異性地增強針對免疫原性決定簇的免疫應答。
[0103]在某些實施方案中，受試對象是動物，典型是人。還可將本發明的方法用于純化應激蛋白復合物，用于在治療其他動物諸如馬、牛、山羊、綿羊、豬和禽的疫苗組合物中使用。
[0104]在某些實施方案中，本發明的誘導型熱休克蛋白復合物源自其的微生物病原體可根據其造成的疾病或感染被選擇。可預防性地或治療性地使用本發明提供的疫苗組合物。然而，由于它們的生產經濟性和它們引起抗一種或多種肽和熱休克蛋白源自其的病原體的保護性免疫應答的能力，本發明人認識到組合物作為預防性疫苗可特別有用。
[0105]本發明人還驚人地鑒定出使用本發明的方法獲得的熱休克蛋白復合物可被用作“加強”接種，所述加強接種增強了在受試對象中提供的抗病原體或癌性病癥的免疫，其中通過用活的或減毒的疫苗接種、或通過其中免疫原性決定簇為應激蛋白-肽復合物的疫苗組合物接種給予初次免疫。
[0106]因此，本發明又另外的方面提供了用于在受試對象中加強抗源自病原體的傳染病或癌性病癥的保護性免疫應答的方法，其中所述保護性免疫應答通過先前施用活的或減毒的疫苗或包含源自期望對其產生免疫的病原體的肽的應激蛋白復合物引起，所述方法包括步驟:
[0107]-提供包含根據本發明任何前述方法制備的一種或多種熱休克蛋白復合物的組合物，所述純化的一種或多種熱休克蛋白復合物源自期望對其產生保護性免疫的癌性細胞、病原體感染的細胞或病原體且包含不同的應激蛋白類型作為混合物，和
[0108]-以足夠在受試對象中引起抗一 種或多種應激蛋白復合物的免疫應答的量將組合物施用至受試對象。
[0109]在某些另外的實施方案中，本發明的包含熱休克蛋白復合物的疫苗可被用于加強先前已用其他亞單位、多-亞單位、碳水化合物或綴合物疫苗免疫的動物中的免疫應答。在又另外的實施方案中，本發明的熱休克蛋白復合物疫苗可被用于加強先前已用核酸或活疫苗免疫的動物中的抗目的抗原的免疫應答。在又另外的實施方案中，本發明的包含熱休克蛋白復合物的疫苗組合物提供了用于加強先前已被免疫抗病原體或癌癥特異性抗原的受試對象中所介導的免疫應答。
[0110]在某些另外的方面，本發明延及用于加強動物中免疫應答的包含通過本發明的方法誘導的熱休克蛋白復合物的疫苗組合物，其中動物先前已被接種包含至少一種源自病原體的抗原、病原體、特別是減毒病原體或癌癥特異性抗原的疫苗組合物。
[0111]在某些另外的方面，本發明延及用于加強動物中免疫應答的包含通過本發明產生的熱休克蛋白復合物的疫苗組合物，其中動物先前已被暴露于源自與熱休克蛋白復合物源自的細胞相同或相關細胞的病原體或癌癥抗原。
[0112]在某些另外的實施方案中，本發明提供了用于制備已用本發明的純化的應激蛋白復合物脈沖的細胞疫苗諸如樹突狀細胞(DC)的組合物。施用此被脈沖的樹突狀細胞至受試對象將導致T-細胞介導的針對熱休克蛋白復合物的應答。當治療患有癌性或惡性病癥的受試對象時，此療法可以是特別有效的。在此類實施方案中，熱休克蛋白復合物典型地源自癌性細胞。
[0113]在某些實施方案中，本發明的疫苗組合物可用誘導免疫應答的組合物、或被用于引起免疫應答的組合物替代，所述組合物典型地包含與本文描述的疫苗組合物中提供的免疫原性決定簇相同的免疫原性決定簇。
[0114]附圖簡述
[0115]圖1A顯示從用熱休克和氧限制(呼吸應激)二者應激的細胞中誘導熱休克蛋白的時間進程。泳道2顯示誘導前的蛋白水平且泳道3-7顯示30分鐘的時間間隔的0-2小時應激誘導。從泳道3至7中的60和70KD條帶處可以看出蛋白(GroEL和DnaK)的遞增的量，這些表示GroEL(70kDa)和DnaK(60kDa)的量的增加。泳道8和9顯示hsp60和hsp70標準品的遞增的量，這些是被誘導的主要的熱休克蛋白。泳道I和11包含分子量(MW)標志物。
[0116]圖1B顯示單獨的熱休克(泳道I)與熱休克和呼吸應激(氧限制)(泳道2)之后熱休克蛋白產量的比較。泳道MW顯示分子量標志物且標記了“Hsp標準品(Hsp stds)”的泳道顯示純化的hsp60和hsp70蛋白。泳道I和2的比較顯示泳道2中具有顯著較高的熱休克蛋白誘導水平,這通過存在對應于在hsp60和hsp70標志物泳道(Hsp標準品)中看到的條帶的顯著較暗的條帶被描繪。
[0117]圖2 (A-F)顯示對從僅經受熱休克(組I和2)和經受熱休克和呼吸應激的組合(組3)的細胞制成的熱休克蛋白復合物的免疫應答，如通過熒光標記的臨床相關的奈瑟氏菌屬的菌株的抗體依賴性的調理吞噬(OPA)測定的(圖A-F)。陽性對照(柱I)顯示使用來自接種同源菌株的外膜囊泡(OMV)制品的動物的血清的結果。組I顯示使用來自接種僅使用誘導刺激的熱應激產生的、使用基于HEPES的緩沖液通過離子交換純化的復合物的動物的血清的結果。組2顯示使用來自接種僅使用誘導刺激的熱應激產生的、使用基于Tris的緩沖液通過離子交換純化的復合物的動物的血清的結果。圖3顯示使用來自接種使用熱休克和呼吸應激刺激的組合產生的、使用與組2中所用的相同的Tris緩沖液純化的復合物的動物的血清的結果。
[0118]圖3顯示從用一些不同的應激刺激即氧化、滲透、重金屬和酸應激進行應激的肺炎鏈球菌細胞誘導應激蛋白的時間進程。在使用抗GroEL和DnaK的抗體分析用于與熱休克組合中使用的誘導應激的刺激或熱和呼吸應激的組合的蛋白印跡中可以看出熱休克蛋白(hsp60和hsp70)的遞增的量。
[0119]圖4顯示從被熱和酸應激的組合應激5或15分鐘的肺炎鏈球菌細胞中應激蛋白的誘導。熱休克恒定在42°C且酸休克是在pH4.5、5和5.5。從泳道7和8中使用抗hsp60和hsp70抗體的蛋白印跡的比較可以確定熱休克和pH5的最優組合,其與顯示僅經受單一的誘導應激的刺激的細胞的泳道I至4相比，顯示了 GroEL和DnaK二者明顯被改善的誘導。
[0120]圖5顯示對從經受單獨的熱應激(HS疫苗)或熱和酸應激的雙重應激組合(DS疫苗)的細胞制成的應激蛋白復合物的免疫應答，如通過熒光標記的肺炎鏈球菌菌株Rxl的抗體依賴性的調理吞噬測定(OPA)測定的。陽性對照是來自用來自同源菌株(Rxl)的完整殺死的細胞免疫的小鼠的血清，且從單一應激(僅熱休克)中分離的應激蛋白復合物另外以比雙重應激疫苗(50 μ g)高的劑量(68 μ g)被檢測。
[0121]圖6顯示對從經受單獨的熱應激(HS疫苗)或熱和酸的雙重應激組合(DS疫苗)的細胞制成的應激蛋白復合物的免疫應答的寬度，如通過針對不同的、異源的血清型的臨床相關的肺炎鏈球菌菌株的酶聯免疫測定(ELISA)測定的。陽性對照是來自用來自菌株Rxl的完整殺死的細胞免疫的小鼠的血清，且來自單一應激(僅熱休克)的應激蛋白復合物另外以比雙重應激疫苗(50 μ g)高的劑量(68 μ g)被檢測。
[0122]發明詳述
[0123]本發明提供了應激蛋白-肽復合物，其中該應激蛋白在細胞經受多種誘導應激的刺激、典型為熱休克和呼吸應激或熱休克和基于酸的應激之后被誘導產生。
[0124]本發明人已鑒定，用至少兩種誘導應激的刺激應激細胞導致誘導顯著較高的水平的熱休克蛋白，由本發明人評價的產量的這一增加包括超過暴露于單一的誘導應激的刺激后產生的蛋白水平的至少2倍增加、優選3或4倍。這對于不同的誘導應激的刺激諸如熱應激和呼吸應激是特別令人驚訝的，由于它們通常被認為被不同的遺傳和轉錄元件進行控制。因此，將原核細胞暴露于熱應激之后，對該誘導應激的刺激的響應中產生的熱休克蛋白的量可進一步通過將細胞暴露于第二誘導應激的刺激被(并顯著)增強是完全出人意料的。
[0125]此外，本發明人還驚人地鑒定了，使用本發明方法產生的熱休克蛋白復合物比在單一誘導應激的刺激之后獲得的相似的復合物，或當與組成型產生的熱休克蛋白復合物相比時，更具免疫原性。因此，通過本發明的方法產生的熱休克蛋白復合物比使用本領域已知的標準生產方法產生的熱休克蛋白復合物更具免疫原性并可被用于產生改進的疫苗制品。
[0126]熱休克蛋白復合物
[0127]在某些實施方案中，熱休克蛋白復合物可以是包含復合至肽或肽片段的熱休克蛋白的熱休克蛋白復合物(HspC)。在某些實施方案中，熱休克蛋白可以是源自將被純化的細胞裂解物的任何合適的熱 休克蛋白。在某些實施方案中，熱休克蛋白可選自包含但不限于以下的組的任一家族:hsp20_30kD ；hsp40 ；hsp60 ；hsp70 ；hsp90 ;和hsplOO。在某些另外的實施方案中，應激蛋白可以是被分類作為分子伴侶蛋白的蛋白。此蛋白可包括，但不限于選自以下組成的組的蛋白:DnaK、DnaJ> GroEL、GroES> hspX、acr2、AAA+、clpA/B、HtpG、TRIC、CCT、IbpA、IbpB、I丐網蛋白、hsp40、hsp70、hsp72、hsp90、grp94> grp75> BiP/grp78> grp75/mt、gp96和小熱休克蛋白(hsp)。在某些實施方案中，熱休克蛋白是GroEL和/或DnaK是優選的。
[0128]在某些實施方案中，當提供了復合物的混合物時，這可包含一個特定家族的熱休克蛋白，例如，hsp70或hsp60家族,盡管混合物包含源自不同家族的不同的熱休克蛋白復合物是優選的。本發明的方法提供了用于純化包含復合至(抗原)肽的熱休克蛋白的所有復合物的方法，不論肽的身份、分子量或大小。
[0129]在某些實施方案中，目的熱休克蛋白復合物包含源自被遺傳修飾以組成型表達應激蛋白基因、和/或表達異源蛋白諸如抗原肽或肽片段的宿主細胞的熱休克蛋白復合物。在某些另外的實施方案中，細胞可以是表達異源基因的宿主細胞，例如，攜帶包含感興趣的抗原基因的表達載體構建體的酵母細胞。在又另外的實施方案中，細胞可以是源自人或動物受試對象的癌性細胞。
[0130]在某些另外的實施方案中，富集熱休克蛋白復合物(HspC)的制品(HEP)包含來自不同應激蛋白家族或類的熱休克蛋白，諸如DnaK、GroEL、hsp60、hsp65、hsp70和hsp90,使用本發明的方法將所述家族共純化作為混合物。[0131]在某些另外的實施方案中，富集熱休克蛋白復合物(HspC)的制品(HEP)可以是具有特定分子量的熱休克蛋白復合物。在某些實施方案中，應激蛋白復合物具有50KDa至900KDa范圍的分子量。
[0132]疫苗組合物的施用
[0133]在某些實施方案中，本發明的疫苗組合物還可包含至少一種佐劑。在某些實施方案中，佐劑選自但不限于以下組成的組:弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、Quil A、Detox, ISCOM和角鯊烯。另外的適合的佐劑包括礦物凝膠或鋁鹽諸如氫氧化鋁或磷酸鋁，但也可以是鈣、鐵或鋅鹽，或可以是酰化酪氨酸、或酰化糖的不溶性懸浮液，或可以是陽離子或陰離子衍生糖類、聚磷腈、生物可降解的微米球、單磷酰脂A(MPL)、脂質A衍生物(例如，具有減弱毒性的)、3-0_脫酰基MPL、quiI A、皂苷、QS21、弗氏不完全佐劑(DifcoLaboratories, Detroit, MI)> Merck Adjuvant65 (Merck and Company, Inc.，USA)、AS-2、ASOl、AS03、AS04、AS15(GSK, USA)、MF59 (Chiron, Sienna, Italy)、CpG 寡核苷酸、生物粘合劑和粘膜粘附劑、微米粒子、脂質體、外膜囊泡、聚氧乙烯醚制劑、聚氧乙烯酯制劑、胞壁酰肽或咪唑喹啉化合物。
[0134]本發明的疫苗組合物或應激蛋白復合物可通過任何合適的途徑被施用至需要治療的受試對象。典型地，胃腸外施用組合物。其他可能的胃腸外施用途徑的示例包括，但不限于，靜脈內的、心臟內的、動脈內的、腹膜內的、肌內的、腔內的、皮下的、經粘膜、吸入或經皮。施用的途徑還可包括局部和腸內，例如，粘膜的(包括肺的)、口的、鼻的或直腸的。制劑可以為液態，例如，生理鹽溶液，包括PH6.8-7.6的非磷酸鹽緩沖液，或凍干的或冷凍干燥的粉末。
[0135]在某些實施方案中，組合物可作為可注射的組合物遞送。對于靜脈注射，應激蛋白復合物將以胃腸外可接受的水溶液的形式，其是無熱源的并具有適合的pH、等滲性和穩定性。具有本領域相關技術的人員將充分能夠使用例如等滲的載運體(vehicle)諸如氯化鈉注射液、林格注射液或乳酸鈉林格注射液制備合適的溶液。根據需要，可包含防腐劑、穩定齊?、緩沖劑、抗氧化劑和/ 或其他添加劑。
[0136]在某些實施方案中，注射方法可以是無針的或可使用穿透真皮的針。在某些另外的實施方案中，疫苗適于口服施用，或可被經皮施用、或通過肺部遞送。在某些實施方案中，疫苗組合物作為預防性疫苗被施用。在某些實施方案中，疫苗組合物作為治療性疫苗被施用。在又另外的實施方案中，疫苗組合物被施用作為初次免疫計劃介導的任何先前施用的疫苗的加強疫苗。
[0137]以上提及的技術和方案和根據本發明可被使用的其他技術和方案的示例可在 Remington’ s Pharmaceutical Sciences,第 18 版，Gennaro, A.R.,LippincottWilliams&Wilkins ;第 20 版 ISBN0-912734-04-3 和 Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems; Ansel, H.C.等人第 7 版，ISBN0-683305-72-7 中找到，其完整公開內容通過引用并入本文。
[0138]本發明的疫苗組合物或熱休克蛋白復合物還可通過微米球、脂質體、其他微米粒子遞送系統或放置在某些組織包括血液中的緩釋制劑被施用。
[0139]劑量方案可包括本發明的組合物的單次施用，或組合物的多次施用劑量。組合物還可與用于本發明組合物被施用以治療的病癥的治療的其他療法和藥劑順序地或分別地被施用。
[0140]施用的實際量、和施用的速率和時間進程，將取決于被治療的問題的性質和嚴重程度。治療的處方，例如，劑量等的決定，最終在全科醫師和其他醫生的職責之內并聽憑全科醫師和其他醫生的處理，并通常考慮到待被治療的疾患、個體患者的狀況、遞送的部位、施用的方法和從業者已知的其他因素。
[0141]定義
[0142]如本文定義的，術語“誘導應激的刺激”意思是能夠在經受刺激的一個或多個細胞內誘導應激應答的刺激。如本文定義的，術語“多種(plurality of)誘導應激的刺激”或“多種(multiple)誘導應激的刺激”指的是至少兩種誘導應激的刺激并指兩種、三種或更多種誘導應激的刺激。誘導應激的刺激可包括，但不限于，呼吸應激、在有限的養分水平下的培養、暴露于細胞因子(諸如腫瘤壞死因子(TNF)或干擾素Y (IFN-伽馬))、病原體的滲透休克(特別地，一旦其通過添加高濃度的電解質諸如氯化鈉至培養基中被培養至穩定生長期)、基于酸的應激、PH變化、代謝物限制或養分饑餓諸如鐵或碳限制、在高壓下的培養、暴露于重金屬和暴露于氧化劑。
[0143]除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明領域技術人員通常理解的含義。
[0144]除非上下文另外要求，否則遍及說明書的術語“包含(comprise)”或“包括(include )” 或諸如“包含(comprises )” 或“包含(compri sing)”、“包括(includes)” 或“包括(including)”的變化形式將被理解為暗示包括所陳述的整體(integer)或整體的組,但不排除任何其他整體或整體的組。
[0145]如本文使用的，除非上下文另外清楚要求，否則術語諸如“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括單數和復數指代對象。因此，例如，提及“一種活性劑”或“一種藥物活性劑”包括單個活性劑和兩種或多種不同的活性劑組合，而提及“一種載體”包括兩種或多種載體的混合物和單個載體，和類似的載體。
[0146]如本文使用的，術語“治療(treatment)”和相關術語諸如“治療(treat)”和“治療(treating)”是指引起抗免疫原性決定簇的保護性免疫應答以給予抗疫苗組合物的免疫原性決定簇源自其的病原體或癌細胞的長期保護性免疫。術語“治療(treatment)”因此指的是能夠有益于受試對象的任何方案。治療可以涉及現存的病癥或可以是預防性的(預防性治療)。治療可包括有療效的、減輕的或預防性效果。
[0147]如本文使用的，術語“治療有效量”是指誘導抗傳染病或癌性病癥的保護性免疫應答所需的本發明的應激蛋白復合物或疫苗組合物的量。如本文使用的，術語“預防有效量”指的是阻止傳染病或癌性病癥的首次發作、進展或復發所需的多種應激蛋白復合物或疫苗組合物的量。術語“治療”不必然暗示受試對象被治療直至完全痊愈。相似地，“預防”不必然是指受試對象將最終不感染疾病狀況。
[0148]本發明上下文中的“受試對象”包括并包含哺乳動物諸如人、靈長類動物和家畜(例如，綿羊、豬、牛、馬、驢)；實驗室試驗動物諸如小鼠、兔、大鼠和豚鼠；和陪伴動物諸如狗和貓。為了本發明的目的，哺乳動物是人是優選的。如本文使用的，術語“受試對象”可與術語“患者”互換。
[0149]如本文使用的，當涉及免疫應答所使用的術語“建立(mount)”、“建立(mounted)”、“引起(elicit)”或“引起(elicited)”是指抗被施用至受試對象的疫苗組合物的免疫原性決定簇產生的免疫應答。通常疫苗組合物的免疫原性決定簇包含使用本發明的方法獲得的分離的和/或純化的應激蛋白復合物。
[0150]如本文使用的，術語“免疫應答”包括由T細胞共刺激的調制影響的T細胞介導的和/或B細胞介導的免疫應答。術語免疫應答還包括由T細胞激活諸如抗體產生(體液應答)和細胞因子應答細胞諸如巨噬細胞的激活間接實現的免疫應答。
[0151]本說明書中涉及的所有文件通過引用并入本文。本發明描述的實施方案的多種修改和變化形式對本領域技術人員將是明顯的，而不偏離本發明的范圍。盡管本發明已結合特定的優選的實施方案被描述，應該理解的是請求保護的本發明不應被不適當地限制于此特定的實施方案。事實上，對本領域技術人員明顯的實施本發明的描述方式的多種修改預期被本發明覆蓋。在本說明書中提及的任何現有技術不被認為，且不應被認為承認或任何形式的暗示該現有技術在任何國家形成公知常識的部分。
實施例
[0152]現在將參考下面的實施例描述本發明，實施例被提供用于闡述的目的且不意在被解釋為限制本發明。
[0153]實施例1-受到多種應激刺激的革蘭氏陰性生物體中應激蛋白的改進的誘導和免疫原性
[0154]于37°C在180rpm搖動下將奈瑟氏菌屬的菌株(乳糖奈瑟氏球菌(N.1actamica)和MC58)最初生長在含有IOOmL的Frantz培養基的500mL不帶有擋板的Erlenmeyer燒瓶中12小時，并隨后接種至包含補充必需氨基酸的54L Frantz培養基的60L發酵罐中。于37°C在具有通過最大500rpm攪拌級聯保持在>30%的溶氧張力(DOT)的情況下生長培養物。使用電偶溶解氧探頭(New Brunswick Scientific)或氧化還原傳感器(Mettler Toledo)測量DOT。通過以0.25 - 0.50C /mi`n的速率升高發酵罐的溫度至44°C熱應激最終的發酵培養物。在一些培養物中，通過氧限制(呼吸應激)施加熱休克以外的另外的應激。這通過當培養物的溫度升至44°C時去除溶氧張力(DOT)級聯控制并手動降低攪拌速率至約320-350rpm實現。將用于產物分析的樣品在應激前、應激后0、1和2小時移出，并通過使用標準設備和操作說明(Invitrogen)由SDS-PAGE分析和蛋白印跡分析熱休克蛋白的誘導。
[0155]圖1中顯示所獲得的典型的結果，其清楚地顯示了通過使用呼吸應激作為熱應激的補充，GroEL和DnaK的時間依賴性的誘導(圖1A，泳道2_7)，如通過與重組的標準品(圖1A，泳道8-10)共遷移可以鑒定的并如通過蛋白印跡可以確認的。通過經受僅熱休克(泳道I)及熱和呼吸應激的組合(泳道2)的培養物的直接比較(圖1B)清楚地顯示了不同應激刺激的出人意料的累加效應，泳道2顯示了主要的熱休克蛋白家族hsp60和hsp70的明顯的增強。
[0156]如PCT專利申請號W02010/026432中描述的，還將被應激的細胞沉淀物重懸在PBS中，使用Emulsiflex C5勻漿器裂解細胞并被用于通過離子交換色譜分析法制備富集熱休克蛋白復合物(HspC)的疫苗組合物。如W02010/026432中描述的將疫苗用于免疫8只小鼠的組并使用補體結合和調理吞噬測定定量抗體應答的功能性。圖2中顯示所獲得的典型的結果，其清楚地顯示了與包含源自經受單獨的熱休克的培養物(組2)的熱休克蛋白復合物作為免疫原性決定簇的疫苗組合物相比，由包含源自經受熱應激和呼吸應激二者的培養物(組3)的熱休克蛋白復合物作為免疫原性決定簇的疫苗組合物引起的改進的免疫應答，如通過調理吞噬測定的(圖2)。測定了針對一些熒光標記的異源奈瑟氏菌屬菌株的被誘導的交叉反應的免疫原性并對作為陽性對照的同源OMV疫苗歸一化。圖2A-F闡述了針對一些臨床相關的奈瑟氏菌屬菌株，即M01-240013、M01-240101、M01-240149、M01-240185和M01-240355和H44/76-SL引起的改進的交叉反應的免疫原性，覆蓋了廣泛的異源循環血清型。
[0157]實施例2-受到多種應激刺激的革蘭氏陽性生物體中應激蛋白的改進的誘導和免疫原性
[0158]將分枝桿菌疫苗菌株BCG Danish (Statens Serum Institute)生長在補充有0.1%吐溫80和消泡劑乳液C (Sigma)的Sauton培養基中。使用生長在37°C具有360rpm振動并具有通過最大500rpm的攪拌級聯保持在>20%的溶氧張力(DOT)的條件下的21培養物在3L生物反應器(Braun)中實施發酵。通過以0.25 - 0.5°C /min的速率升高發酵罐的溫度至44°C熱應激(熱休克)最終的發酵培養物I小時。在一些培養物中，通過當培養物的溫度升至44°C時去除溶氧張力(DOT)級聯控制并手動降低攪拌速率至約320-350rpm實現氧限制(氧化應激)。
[0159]獲得的結果顯示了通過使用除熱應激之外的呼吸應激，主要的熱休克蛋白GroEL和DnaK的清楚的累加誘導。如W02001/026432中描述的使用離子交換色譜分析法制備富集熱休克蛋白的疫苗組合物并免疫小鼠和兔的組。抗體應答再次顯示了由疫苗組合物引起的改進的免疫應答，其中免疫原性決定簇包含源自經受熱應激和呼吸應激二者的培養物的熱休克蛋白復合物，如通過使用被免疫的動物的血清的蛋白印跡和ELISA所測定的。改進的免疫原性導致增加的抗活H37Rv的氣霧劑攻擊的保護，與單個應激的BCG相比，用來自雙重應激的疫苗組合物免疫的小鼠中肺菌落形成單位還具有0.81og的下降。
[0160]實施例3-受到多種 應激刺激的兼性厭氧菌中應激蛋白的改進的誘導和免疫原性
[0161]于37°C，將肺炎鏈球菌的實驗室菌株Rxl生長在振蕩培養箱中5%0)2氣氛中的PH7.5的Hoeprich培養基中。使用0.5ml的原種(0D0.3)將培養物接種在40ml培養基中并在50rpm下生長5_6小時(0D0.2)。隨后，使培養物經受多種誘導應激的刺激，包括在40°C熱休克30-60分鐘、通過去除CO2源的呼吸休克、通過添加HCl以調節培養物至pH5的pH應激和鐵限制。通過使用標準設備和操作說明(Invitrogen)由SDS-PAGE分析和蛋白印跡分析培養物樣品的熱休克蛋白的誘導。使用由不同應激刺激誘導的GroEL(hsp60)和DnaK(hsp70)的比較(圖3)選擇最有前景的組合。圖4顯示使用所選擇的熱休克和酸應激的組合(泳道8、9和12、13)獲得的結果，其顯示了 GroEL和DnaK 二者的誘導超過由單獨的熱休克(泳道3)或酸應激(泳道4-6)誘導的明顯的改進。
[0162]如W02001/026432中描述的使用離子交換色譜分析法從經受熱休克或熱應激和酸應激的雙重應激組合的Rxl培養物中制備富集熱休克蛋白的疫苗組合物(HEP)并用于免疫小鼠的組。所引起的抗體應答清楚顯示了由來自多種刺激的疫苗組合物介導的改進的免疫應答，如使用來自被免疫的動物的血清通過蛋白印跡、ELISA (圖5)和OPA (圖6)測定的。
[0163]從經受僅在42°C的熱休克或熱休克和酸休克(pH5)的雙重應激組合的肺炎鏈球菌中分離HEP并用于免疫小鼠。還以高于來自雙重應激的疫苗(50 μ g)的劑量(68μ g和50 μ g)使用了來自單一應激的HEP疫苗，并與作為陽性對照的完整殺死的病原體的疫苗比較。來自由雙重應激誘導的肺炎鏈球菌細胞的HEP疫苗(DS疫苗)清楚顯示了超過單一應激的疫苗(HS疫苗)的改進的免疫原性，即使當后者以顯著較高的劑量使用時(圖5&6)。該改進的免疫原性不僅在通過OPA測定評價所引起的抗體的親和力和親合力中被觀察到(圖5)，而且還在通過ELISA評價所產生的抗體抗臨床相關的不同血清型的肺炎鏈球菌菌株的交叉反應性寬度中被觀察到(圖6)。用于說明由從經受雙重應激的細胞中分離出的HEP疫苗誘導的改進的免疫寬度的異源菌株，覆蓋了肺炎球菌疾病中存在于目前商業13價而非7價疫苗中的血清型(血清型19A)和未被這些疫苗覆蓋的逃逸變體并具有新興的臨床重要性的血清型(血清型8和22F)。由雙重應激HEP疫苗誘導的保護性免疫的寬度還顯著好于使用完整細胞殺死疫苗觀察到的。
[0164]實施例4-受到多種應激刺激的專性厭氧菌中應激蛋白的改進的誘導和免疫原性
[0165]于37°C并在50rpm下，將艱難梭狀芽胞桿菌的雙毒素突變體的實驗室菌株生長在振蕩培養箱中H2:CO2:N2 (比例10:10:80)氣氛中的ρΗ6.8的TY培養基中以獲得0D0.5-0.7，并隨后于44°C通過在環境空氣中孵育2小時使培養物經受熱應激和呼吸應激的組合。通過使用標準設備和操作說明( InvitiOgen)由SDS-PAGE分析和蛋白印跡分析培養物樣品的熱休克蛋白的誘導。如W02001/026432中描述的使用離子交換色譜分析法制備富集熱休克蛋白的疫苗組合物并免疫小鼠的組。抗體應答再次顯示了由疫苗組合物介導的改進的免疫應答，其中免疫原性決定簇包含源自經受熱應激和呼吸應激二者的培養物的熱休克蛋白復合物，如通過蛋白印跡和阻斷細菌粘附至上皮細胞培養物的滴定法所測定的。
[0166]實施例5-真菌微生物中多種應激對應激蛋白的改進的誘導
[0167]于30°C,在 51 的臺式 BioFlo310 發酵罐(New Brunswick Scientific)中，將釀酒酵母菌株ATCC20602生長在以通過2-800rpm的攪拌速度獲得的30%的溶解氧濃度的pH5的Difco YM生長培養基中。24小時之后，通過停止氧供給并升高溫度至40°C I小時使培養物經受熱應激和呼吸應激的組合。通過使用標準設備和操作說明(Invitrogen)由SDS-PAGE分析和蛋白印跡分析培養物樣品的熱休克蛋白的誘導。
【權利要求】
1.一種用于產生在應激蛋白和肽之間形成的應激蛋白復合物的方法，所述方法包含步驟: (i)培養細胞， (?)將所述細胞暴露于多種誘導應激的刺激，和 (iii)從所述細胞中純化所述應激蛋白復合物。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述多種誘導應激的刺激包含選自以下組成的組的至少兩種誘導應激的刺激:熱應激、呼吸應激、氧化應激、基于酸的應激、重金屬應激、滲透應激、代謝物限制和養分饑餓。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述多種誘導應激的刺激包括熱應激。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述熱應激包含將所述被培養的細胞所暴露的熱增加至大于所述細胞的正常生長溫度約5°C -10°C的溫度。
5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述多種誘導應激的刺激包括呼吸應激。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述呼吸應激包含從引起所述被培養的細胞正常生理生長或穩態的氧的量降低所述細胞所暴露的氧的量。
7.如權利要求5或6所述的方法，其中所述細胞在被暴露于所述呼吸應激之前被暴露于所述熱應激。
8.如權利要求5或6所述的方法，其中所述細胞被同時暴露于所述熱應激和所述呼吸應激。
9.如權利要求5或6所述的方法，其中所述細胞在被暴露于所述熱應激之前被暴露于所述呼吸應激。
10.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述多種誘導應激的刺激包括基于酸的應激。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述基于酸的應激包含從引起所述被培養的細胞正常生理生長或穩態的pH降低所述細胞所暴露的pH。
12.如權利要求10或11所述的方法，其中所述細胞在被暴露于所述基于酸的應激之前被暴露于所述熱應激。
13.如權利要求10或11所述的方法，其中所述細胞被同時暴露于所述熱應激和所述基于酸的應激。
14.如權利要求10或11所述的方法，其中所述細胞在被暴露于所述熱應激之前被暴露于所述基于酸的應激。
15.如權利要求2至14中任一項所述的方法，其中使所述細胞經受I至2小時范圍時間段的所述熱應激。
16.如任何前述權利要求所述的方法，其中所述細胞選自以下組成的組:病原細胞、癌性細胞、被病原生物體感染的細胞、被遺傳修飾以組成型表達熱休克蛋白的細胞、被遺傳修飾以致它們表達源自癌性細胞的異源蛋白的細胞和被遺傳修飾以致它們表達源自在宿主中造成傳染病的病原體的異源蛋白的細胞。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述細胞是病原細胞。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述病原細胞選自以下組成的組:革蘭氏陽性原核細胞、革蘭氏陰性原核細胞、微生物細胞、原生動物細胞、病毒、真菌和寄生蟲細胞。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述原核細胞選自以下組成的組:埃希氏菌屬(Escherichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、博代氏菌屬(Bordetella)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線菌屬(Actinomycetes)、鏈霉菌屬(Streptomycetes)、諾卡菌屬(Nocardia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弗朗西斯氏菌屬(Fancisella)、巴氏桿菌屬(Pasturella)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、布蘭漢氏球菌屬(BranhameIIa)> 放線桿菌屬(Actinobacillus)、鏈桿菌屬(StreptobaciIIus)> 李斯特菌屬(Listeria)、鞘桿菌屬(Calymmatobacterium)、布魯氏菌屬(Brucella)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、密螺旋體屬(Treponema)、沙門氏菌屬(Salmonella)、克雷伯菌屬(Kleibsiella)、弧菌屬(Vibrio)、變形菌屬(Proteus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、包柔螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、螺菌屬(Spirillum)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、志賀菌屬(Shigella)、軍團桿菌屬(Legionella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)>立克次體屬(Rickettsia)、衣原體屬(Chlamydia)、包柔螺旋體屬(Borrelia)和支原體屬(Mycoplasma)。
20.如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述細胞選自以下組成的組:奈瑟氏菌屬、分枝桿菌屬、酵母屬和梭狀芽胞桿菌屬。
21.如權利要求10至15中任一項所述的方法，其中所述細胞是鏈球菌屬。
22.如任何前述權利要求所述的方法，其中所述肽是腫瘤特異性抗原。
23.如權利要求3或4所述的方法，其中所述細胞是厭氧病原細胞且所述多種誘導應激的刺激包括將所述細胞暴露于氧化應激，所述氧化應激包含增加所述被培養的細胞所暴露的氧的量。`
24.如任何前述權利要求所述的方法，其中所述純化所述應激蛋白復合物的步驟包含步驟: -提供包含所述應激蛋白復合物的澄清的細胞裂解物， -使所述細胞裂解物經受使用離子交換的純化，其中將所述細胞裂解物緩沖至目的應激蛋白復合物的Pl的2個單位以內的pH，且其中使用鹽梯度洗脫所述應激蛋白復合物，和 -獲得包含所述熱休克蛋白復合物的富集的制品。
25.如任何前述權利要求所述的方法，其中所述熱休克蛋白復合物包含選自以下組成的組的一種或多種熱休克蛋白:hsp20_30kD、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90、hspl00、|丐網蛋白、hsp72、grp94> grp75BiP/grp78>grp75/mt 和 gp96。
26.如任何前述權利要求所述的方法，其中所述熱休克蛋白復合物包含GroEl和DnaK。
27.如任何前述權利要求所述的方法，其中所述應激蛋白復合物具有50KDa至900KDa范圍的分子量。
28.一種疫苗組合物，包含通過權利要求1至27中任一項所述的方法獲得的應激蛋白復合物。
29.通過權利要求1至27中任一項所述的方法產生的純化的應激蛋白復合物在制備用于治療傳染病或癌性或惡性病癥的藥劑中的用途。
30.通過權利要求1至27中任一項所述的方法產生的應激蛋白復合物，所述應激蛋白復合物用于治療傳染病或癌性或惡性病癥。
31.一種接種受試對象抗源自病原體的傳染病或癌性病癥的方法，所述方法包括步驟: -提供包含根據權利要求1至27中任一項所述的方法產生的純化的應激蛋白復合物作為免疫原性決定簇的疫苗組合物，和 -以足夠在受試對象中引起抗所述應激蛋白復合物的免疫應答的量將治療有效量或預防有效量的所述疫苗組合物施用至受試對象。
32.—種加強受試對象中由初次免疫接種程序介導的抗源自病原體的傳染病或癌性病癥的保護性免疫應答的方法，其中所述保護性免疫應答通過先前暴露于所述病原體或癌性病癥或通過先前施用疫苗所引起，所述疫苗選自以下組成的組:活疫苗、減毒疫苗、如權利要求28中所述的疫苗組合物、核酸疫苗和蛋白疫苗，所述方法包含步驟: -提供包含根據權利要求1至27中任一項所述的方法產生的純化的應激蛋白復合物作為免疫原性決定簇的組合物，和 -以足夠在受試對象中增強抗所述應激蛋白復合物的免疫應答的量將治療有效量或預防有效量的所述組合物施用 至受試對象。
【文檔編號】A61K39/385GK103458923SQ201280014573
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年3月23日 優先權日:2011年3月23日
【發明者】卡米洛·科拉科, 伊恩·麥肯蒂 申請人:免疫生物學有限公司