Tfeb磷酸化抑制劑及其應(yīng)用的制作方法

Tfeb磷酸化抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及TFEB磷酸化抑制劑。這種分子在所有需要誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的疾病中有治療應(yīng)用，所述疾病例如溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
【專利說(shuō)明】TFEB磷酸化抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及TFEB磷酸化抑制劑。這種分子在所有需要誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的疾病中有治療應(yīng)用，所述疾病例如溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
[0002]背景和現(xiàn)有技術(shù)
[0003]自體吞噬是依賴于兩個(gè)不同類型細(xì)胞器(自噬體和溶酶體)的協(xié)同作用的分解代謝過(guò)程(I)。饑餓期間，細(xì)胞的兩個(gè)細(xì)胞器(compartment)膨脹以促進(jìn)降解和再循環(huán)過(guò)程。
[0004]所述溶酶體維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，包含細(xì)胞清除、脂質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)、能量代謝、質(zhì)體膜修復(fù)、骨重塑和抵御病原體。所有這些過(guò)程需要溶酶體對(duì)環(huán)境信號(hào)的獲得性和動(dòng)態(tài)反應(yīng)。事實(shí)上，生理信號(hào)(例如衰老和禁食)和病理病癥(包含溶酶體貯積癥(LSD)、神經(jīng)退行性疾病)、損傷和感染可以產(chǎn)生所述溶酶體的獲得性反應(yīng)(34、35、36)。
[0005]對(duì)調(diào)解溶酶體功能和潛在的溶酶體適應(yīng)機(jī)制的理解仍然處在初始階段。調(diào)解溶酶體生物發(fā)生的主要作用物是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子一 TFEB (2)。鑒定的TFEB轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)有參與底物降解的溶酶體水解酶，調(diào)解溶酶體與其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)的相互作用的溶酶體膜蛋白，和參加溶酶體酸化的液泡H+-ATP酶(νΑΤΡ酶)復(fù)合物的組成(37，2)。
[0006]W02010/092112涉及在所謂清除元件(CLEAR element)上起作用以增強(qiáng)細(xì)胞降解通路的分子；其中有TFEB。
[0007]W02010/044885 涉及 mTOR 調(diào)節(jié)劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本 申請(qǐng)人:顯示了在饑餓中，細(xì)胞活化控制自體吞噬通路的主要步驟的轉(zhuǎn)錄程序，所述自體吞噬通路包含自噬體形成、自噬體一溶酶體融合和底物降解。預(yù)先鑒定為溶酶體生物發(fā)生的主要基因的所述轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB) (2)通過(guò)驅(qū)動(dòng)自體吞噬和溶酶體基因的表達(dá)來(lái)調(diào)整這種程序。TFEB是對(duì)饑餓的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要作用物，并且通過(guò)體外和體內(nèi)陽(yáng)性調(diào)節(jié)自噬體形成和自噬體一溶酶體融合來(lái)控制自體吞噬。
[0009]本 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)特異性絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)TFEB的核定位和活性。與饑餓相似，基于藥理或基因突變對(duì)特異性磷酸化的抑制通過(guò)活化TFEB來(lái)誘導(dǎo)自體吞噬。這些數(shù)據(jù)公開(kāi)了通過(guò)控制兩種協(xié)同細(xì)胞器的生物發(fā)生和合作而參與調(diào)節(jié)溶酶體一自體吞噬通路的新的、激酶依賴性機(jī)制。
[0010] 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)TFEB磷酸化的藥物抑制能用于體內(nèi)活化細(xì)胞的溶酶體和自體吞噬系統(tǒng)，并且因而其代表了治療不同病癥的工具。
[0011]TFEB活性和其核移位與其磷酸化狀態(tài)有關(guān)。特別地，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)存在時(shí)，由mTORCl的TFEB磷酸化抑制TFEB的活性。相反，藥物抑制mTORCl，以及饑餓和溶酶體破壞，通過(guò)提高其核移位來(lái)活化TFEB。另外，對(duì)mTORCl的溶酶體破壞或藥物抑制的溶酶體和自體吞噬基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在TFEB-/-細(xì)胞中被抑制。[0012]從Peila-Lopis等的觀點(diǎn)來(lái)看上述發(fā)現(xiàn)甚至更令人驚訝，Peia-Lopis等發(fā)現(xiàn)mTOR能磷酸化TFEB但是結(jié)論相反(38)，這指示了 mTOR介導(dǎo)的TFEB磷酸化促進(jìn)核移位，并且因此抑制mTOR造成抑制TFEB活性。
[0013]最后， 申請(qǐng)人:顯示了能利用TFEB調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的藥理學(xué)活化以促進(jìn)由于毒性分子積累造成的疾病中的細(xì)胞清除，所述疾病例如溶酶體貯積癥和常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。
[0014]因而，本發(fā)明的目的是TFEB磷酸化抑制劑在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的TFEB磷酸化抑制劑作用在TFEB磷酸化通路的激酶上，更優(yōu)選所述激酶是mTOR和/或PI3K。這種抑制劑的示例是表4第I部分PI3K-mT0R通路中列舉的化合物。
[0015]在另一個(gè)實(shí)施方式中，抑制劑抑制直接磷酸化TFEB分子的激酶，所述激酶優(yōu)選絲氨酸特異性胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)，更優(yōu)選ERK2激酶。這種抑制劑的示例是表4第2部分Ras-ERK通路中列舉的化合物。
[0016]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑抑制促分裂原活化蛋白激酶。這種抑制劑的示例是表4第3部分促分裂原活化蛋白激酶中列舉的化合物。
[0017]在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述抑制劑抑制極光(Aurora)激酶。這種抑制劑的示例是表4第4部分極光激酶中列舉的化合物。
[0018]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑抑制受體酪氨酸激酶。這種抑制劑的示例是表4第5部分受體酪氨酸激酶中列舉的化合物。
[0019]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑抑制Polo樣激酶。這種抑制劑的示例是表4第6部分Polo樣激酶中列舉的化合物。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑抑制JAK-STAT通路的激酶。這種抑制劑的示例是表4第7部分JAK-STAT通路中列`舉的化合物。
[0021]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶。這種抑制劑的示例是表4第8部分細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶中列舉的化合物。
[0022]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激酶。這種抑制劑的示例是表4第9部分Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中列舉的化合物。
[0023]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑抑制Src家族激酶。這種抑制劑的示例是表4第10部分Src家族激酶中列舉的化合物。
[0024]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑抑制蛋白激酶C家族的激酶。這種抑制劑的示例是表4第11部分蛋白激酶C家族中列舉的化合物。
[0025]上述TFEB磷酸化抑制劑用于治療需要誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的疾病中有優(yōu)勢(shì)，優(yōu)選用于治療任意下列病變:溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
[0026]溶酶體貯積癥的示例是:激活因子缺乏癥/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、α -甘露糖苷貯積癥、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇病(包含I型、II型和III型)、GMl神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/青少年型、成年型/慢性)、I細(xì)胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、假性赫爾利多營(yíng)養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合癥、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合征、A型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質(zhì)酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏病/晚嬰型CLN2/TPP1病、Kufs/成人發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積病、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、青少年山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
[0027]肝病的示例是:α I抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
[0028]肌肉疾病的示例是:自體吞噬液泡肌病和過(guò)度自噬X連鎖肌病。
[0029]代謝疾病的示例是:高膽固醇血癥和脂肪肝病。
[0030]神經(jīng)退行性疾病的示例是:阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費(fèi)爾特_雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)和脊髓性小腦萎縮癥。
[0031]本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用上述TFEB磷酸化抑制劑以增加細(xì)胞生成內(nèi)源或重組溶酶體酶的產(chǎn)量。
[0032]本發(fā)明的另一個(gè)目的是生`成溶酶體內(nèi)源或重組酶的方法，所述方法包含:(I)細(xì)胞中使上述TFEB磷酸化抑制劑與自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)接觸；(2)誘導(dǎo)所述自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)；和(3)增加所述溶酶體酶的產(chǎn)量。
[0033]本發(fā)明的另一個(gè)目的是治療疾病的方法，所述方法通過(guò)給予患者治療有效量的上述TFEB磷酸化抑制劑。優(yōu)選由誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)能緩解所述疾病。更優(yōu)選所述疾病選自:溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。上面提供了這種疾病的示例。
[0034]在優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明治療疾病的方法包含如下步驟:(I)給予上述抑制劑；(2)在細(xì)胞中誘導(dǎo)自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)；和(3)增強(qiáng)細(xì)胞清除。
[0035]在實(shí)施例和非限定示例中描述本發(fā)明。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1:TFEB誘導(dǎo)自體吞噬。(A)穩(wěn)定地過(guò)量表達(dá)TFEB的HeLa細(xì)胞用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并且如所示來(lái)處理。各實(shí)驗(yàn)分析大約100個(gè)細(xì)胞，重復(fù)三次。圖顯示了 GFP陽(yáng)性囊泡的定量。(B-F)在TFEB-3xf lag穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)(+)和對(duì)照細(xì)胞(-)中LC3的Western印跡分析(B)。圖表示了使用imagej軟件從三個(gè)獨(dú)立印跡中分析LC3II的表達(dá)(相對(duì)于肌動(dòng)蛋白);(C)就指定時(shí)間(h=小時(shí))使用血清和氨基酸饑餓(Starv)的TFEB穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)細(xì)胞的Western印跡分析，(D-F)在⑶正常培養(yǎng)基、(E)饑餓培養(yǎng)基或者(F)補(bǔ)充有巴伐洛霉素的饑餓培養(yǎng)基(4h;400nM)中培養(yǎng)的TFEB-RNAi和雜亂RNAi (對(duì)照(ctr))處理的對(duì)照細(xì)胞中分離的細(xì)胞裂解液。圖表示三個(gè)獨(dú)立印跡中LC3II表達(dá)的定量(相對(duì)于肌動(dòng)蛋白)，并且條帶濃度使用imagej軟件分析定量。(G) TFEB mRNA水平通過(guò)qPCR分析，使用從靶向TFEB的3種不同siRNA寡核苷酸(寡核苷酸#1、#2、#3)或者用雜亂siRNA寡核苷酸(對(duì)照(ctr))轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制備的cDNA。(H)用空(對(duì)照)或TFEB載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定表達(dá)GFP-mRFP-LC3的固定HeLa細(xì)胞的代表性共聚焦照片。最少計(jì)數(shù)2000個(gè)細(xì)胞，并且所述值表示獲自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的囊泡的平均數(shù)值(相對(duì)于對(duì)照，％)。AL(自噬溶酶體)=mRFP陽(yáng)性/GFP陰性囊泡；總體:mRFP陽(yáng)性囊泡。(所有誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。T檢驗(yàn)(未配對(duì))p值O〈0.05，O <0.01)
[0037]圖2:饑餓調(diào)節(jié)TFEB的核移位和活性。(A)散點(diǎn)圖顯示不同條件下培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中51個(gè)自體吞噬相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平中倍數(shù)變化差異的對(duì)數(shù)值。X軸=對(duì)照組。Y軸=處理組。圓圈表示增加(紅色)或降低(綠色)的倍數(shù)變化的基因。如指示進(jìn)行比較。(B)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析。柱狀圖顯示了 qPCR試驗(yàn)檢測(cè)的免疫沉淀的DNA的量。數(shù)值對(duì)進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)化，并且對(duì)模擬對(duì)照的相對(duì)富集作圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。(C)在正常、饑餓和TFEB-siRNA饑餓細(xì)胞中TFEB靶基因表達(dá)的qPCR分析。GAPDH和HPRT表示持家基因，而ATG10、ATG9A和ATG4D表示對(duì)照基因(非TFEB靶標(biāo)基因)。(D-F)穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)TFEB的HeLa細(xì)胞不處理或者營(yíng)養(yǎng)饑餓4h。(D)就TFEB核定位分析各包含50-100個(gè)細(xì)胞的5個(gè)區(qū)域。P值O=〈0.01。(E)細(xì)胞使用核/胞質(zhì)分級(jí)分離，并用Flag抗體印跡。H3和微管蛋白分別用作核和胞質(zhì)的標(biāo)記。(F)核部分用Flag和H3(加樣對(duì)照)抗體印跡。(G)核提取物中Flag、微管蛋白和H3的Western印跡分析，所述核提取物從正常、饑餓和饑餓/正常培養(yǎng)基刺激Ih (正常)或者培養(yǎng)基刺激前用AP-2 (AKT抑制劑)、雷帕霉素(mTOR抑制劑)和U0126(MEK抑制劑)處理Ih的細(xì)胞中制備?？偺崛∥镉糜诖_證抑制劑的效率。(H)用組成型活性MEK (caMEK)質(zhì)?；蛴每蛰d體轉(zhuǎn)染的TFEB siRNA或TFEB雜亂對(duì)照細(xì)胞中溶酶體和自體吞噬基因的qPCR分析。如圖所示進(jìn)行饑餓。(所有誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。T檢驗(yàn)(未配對(duì))P 值 O〈0.05，O <0.01)
[0038]圖3:絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)TFEB活性。(A)表達(dá)突變型TFEB_3xFlag的HeLa細(xì)胞中的TFEB亞細(xì)胞定位，用F lag抗體免疫染色。分析來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的各自包含50-100個(gè)細(xì)胞的5個(gè)區(qū)域。⑶用空、正常和突變TFEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的qPCR分析。(C，D)蛋白提取物中LC3II(C)和Lampl (D)的Western印跡分析，蛋白提取物來(lái)自等量的空(pCDNA)、TFEB-3xFlag或TFEBS142A_3xFlag載體轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。如圖所示加入巴伐洛霉素。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，并且對(duì)肌動(dòng)蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化蛋白水平的定量。(E)穩(wěn)定表達(dá)GFP-mRFP-LC3和用pcDNA、Tfeb或Ser-Tfeb轉(zhuǎn)染24h的HeLa細(xì)胞中的自噬溶酶體分析(AL=RFP陽(yáng)性/GFP陰性)。如圖1H所述定量。(F)HeLa細(xì)胞中使用抗Erk抗體的Western印跡分析，所述HeLa細(xì)胞用HA_Erk2和/或TFEB_3xFlag轉(zhuǎn)染，在全血清中維持或營(yíng)養(yǎng)饑餓4h，并且用抗Flag抗體免疫沉淀。裂解液用抗FLAG免疫沉淀，并且用抗Erk抗體印跡。(G)體外激酶試驗(yàn)。在ATP- Y 32P以及TFEB蛋白的氨基酸120 - 170的肽(TFEB-S-142)或絲氨酸142用丙氨酸取代的相似的肽(TFEB-A-142)存在下培養(yǎng)重組激酶。以所述肽整合的放射性的量來(lái)測(cè)量磷酸化效率(“磷酸化靈敏度” )。(H)過(guò)量表達(dá)TFEB的HeLa穩(wěn)定克隆用ERK1/2特異性siRNA寡核苷酸或者對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染。48h后，細(xì)胞不處理、血清饑餓或者血清和氨基酸(a.a.)饑餓4h，收集并進(jìn)行核分離和Flag免疫印跡?？偭呀庖河肊RK抗體探測(cè)。所有誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值O =〈0.05。
[0039]圖4 =TFEB介導(dǎo)的自體吞噬誘導(dǎo)的體內(nèi)分析。(A)在進(jìn)食的、16h禁食和24h禁食的小鼠中GFP陽(yáng)性囊泡的免疫熒光分析。圖中顯示了囊泡的定量。(B)來(lái)自進(jìn)食和禁食動(dòng)物的肝樣品中TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的qPCR分析(n=3;誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值O〈0.05)。Gapdh和Hprt用作參照基因。(C，D)在用AAV2/9Tcfeb_HA感染并且處死前禁食16h的2個(gè)月齡的野生型小鼠中TFEB亞細(xì)胞定位的分析。(C)HA免疫熒光分析。圖顯示了核HA信號(hào)的定量。就各個(gè)肝計(jì)數(shù)100個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。n=3小鼠/組。*=〈0.001。
(D)在用于核分級(jí)分離的肝樣品中的HA、微管蛋白(Tubulin)和H3的Western印跡分析?？偢瘟呀庖河肏A抗體探測(cè)以確證進(jìn)食和禁食動(dòng)物中相似的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。(E)注射有AAV2/9Tcfeb-HA的小鼠的肝提取物中LC3、肌動(dòng)蛋白、p-ERKl/2和ERK1/2的Western印跡分析。(F)來(lái)自2月齡GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠的凍存的肝切片中GFP Western印跡分析和DAPI染色，所述轉(zhuǎn)基因小鼠用AAV-Tcfeb-HA或用鹽水溶液(對(duì)照組)注射，并且處死前自由進(jìn)食或禁食24h。圖中顯示了 GFP陽(yáng)性囊泡的定量。(G)從條件型Tcfeb-3xFLAG轉(zhuǎn)基因小鼠(Tcfeb-3Xflag; AlbCRE)分離的肝樣品中自體吞噬和溶酶體TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的qPCR分析，其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)由肝特異性CRE重組酶(即白蛋白-CRE)驅(qū)動(dòng)。(H)來(lái)自Alb-CRE、Tcfeb-3xFlag和Tcfeb_3xFlag; Alb-CRE小鼠的肝蛋白提取物中LC3和肌動(dòng)蛋白的Western印跡分析。
[0040]圖5 =TFEB瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)自體吞噬。(A)用編碼flag標(biāo)簽的TFEB蛋白的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h，細(xì)胞收集、裂解，并且就LC3、Flag和肌動(dòng)蛋白免疫反應(yīng)性分析IOmg蛋白樣品。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，并且使用imagej軟件分析定量條帶濃度。(誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值O〈0.05) (B)用空載體或用TFEB-3xFlag載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞。24小時(shí)后，細(xì)胞用溶酶體抑制劑(抑胃酶肽/E64，lOyg/ml，西格瑪公司(SIGMA))處理4h。10 μ g細(xì)胞裂解液用于LC3和肌動(dòng)蛋白免疫印跡。
[0041]圖6:在過(guò)量表達(dá)TcFEB的MEF中自體吞噬的誘導(dǎo)。(A，B)用表達(dá)TcFEB的慢病毒感染的MEF和對(duì)照細(xì)胞的電子顯微鏡照片。(a)在TcFEB表達(dá)上觀察到自體吞噬結(jié)構(gòu)，其包含自噬體(AV)和自噬溶酶體(AL)。(B)早期自噬體的形成。電子密集細(xì)胞質(zhì)材料周圍的膜(箭頭)的分離。(C)自體吞噬結(jié)構(gòu)(AV和AL)和⑶早期自噬體的數(shù)目的定量。分析至少30個(gè)細(xì)胞/組。誤差線表示SE`M;P值(*)<0.05; (***)<0.0OOl0
[0042]圖7 =TFEB促進(jìn)自噬體的形成。(A)對(duì)照和穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)TFEB的細(xì)胞用巴伐洛霉素(baf;12h400nM)處理，收集并且用于LC3I1、Flag和肌動(dòng)蛋白免疫印跡。(B)對(duì)照和穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)TFEB的細(xì)胞不處理或用IOy g/ml溶酶體抑制劑抑胃酶肽/E64處理4h，裂解并且用于LC3、Flag和肌動(dòng)蛋白免疫印跡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，并且使用imagej軟件分析定量條帶強(qiáng)度。(誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值O〈0.05)
[0043]圖8 =TFEB增加了溶酶體水解。在正?；蝠囸I條件下，在過(guò)量表達(dá)TFEB、TFEB消耗和對(duì)照細(xì)胞中長(zhǎng)壽命蛋白降解的速率。如圖所示加入3-甲基腺嘌呤(3MA)。(誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值O〈0.05)
[0044]圖9:自體吞噬基因亞組的啟動(dòng)子區(qū)域中TFEB推定結(jié)合元件的分布。數(shù)字指示結(jié)合元件距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的距離。
[0045]圖10:饑餓增強(qiáng)TFEB活性。熒光素酶報(bào)導(dǎo)試驗(yàn)使用載有四個(gè)TFEB結(jié)合位點(diǎn)串聯(lián)拷貝的構(gòu)建物。正常和TFEB過(guò)量表達(dá)的HeLa細(xì)胞用有TFEB結(jié)合位點(diǎn)的人工啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染。當(dāng)饑餓條件下培養(yǎng)時(shí)，兩種細(xì)胞類型顯示了增加的反式激活潛能。(誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差P O〈0.05)[0046]圖11:饑餓通過(guò)MAPK誘導(dǎo)TFEB的核移位。(A)饑餓誘導(dǎo)胞質(zhì)TFEB遷移率改變和核移位。正常培養(yǎng)基；饑餓培養(yǎng)基(4h);饑餓+正常，指示了細(xì)胞在禁食培養(yǎng)基中培養(yǎng)(4h)，并且收集前Ih用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)補(bǔ)充。胞質(zhì)和核部分用于Flag免疫印跡。(B)如圖2G所示處理的HeLa細(xì)胞中通過(guò)免疫熒光的TFEB細(xì)胞定位分析。圖顯示了有TFEB核定位的細(xì)胞的百分比。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。P值(*)=〈0.05。
[0047]圖12 =TFEB 核移位依賴于 S142 磷酸化。(A)表達(dá) TFEB_3xFlag、S142A_3xFlag、S332-3xFlag或S423_3xFlag蛋白的HeLa細(xì)胞用于核蛋白分離。等量的核蛋白用麗春紅染色確證。(B)在正常和饑餓條件下，表達(dá)TFEB-3xFlag、S142A_3xFlag和S142D_3xFlag蛋白的HeLa細(xì)胞用于核蛋白分離。(C)從表達(dá)TFEB_3xFlag和TFEB_S142A_3xFlag的HeLa細(xì)胞分離的胞質(zhì)蛋白的Flag免疫印跡顯示了在正常培養(yǎng)基中相較野生型(WT)TFEB，S142A遷移條帶分子量(MW)更低，而在饑餓條件下這種變化不再明顯。(D)從表達(dá)TFEB-3xFlag、S142A-3xFlag和S142D_3xFlag的饑餓HeLa細(xì)胞分離的胞質(zhì)蛋白的Flag免疫印跡顯示了TFEB-S142D的變化較小。
[0048]圖13:S142A TFEB突變顯示了增強(qiáng)的活性。穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)GFP-LC3的HeLa細(xì)胞用等量的空、TFEB-3xFlag或S142A-TFEB-3xFlag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并且定量自噬體的數(shù)目。各點(diǎn)分析至少10個(gè)區(qū)域(包含4-10個(gè)細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值O〈0.05。
[0049]圖14:有TFEB旁系同源物(paralogue)、MITF和相關(guān)TFEB有關(guān)家族成員的TFEB-人(human) S142磷酸化位點(diǎn)的多個(gè)序列的比對(duì)。通過(guò)ExPASy蛋白組學(xué)服務(wù)器上的UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST檢索(2.2.17)鑒定TFEB_human同源物。 申請(qǐng)人:去除含“推定的”、“未鑒定的”和“cDNA”關(guān)鍵詞的結(jié)果以及不含基因名稱的結(jié)果。下一步，發(fā)明人用ClustalW(l.82)比對(duì)剩余的同源物。由Seaview生成多個(gè)序列的比對(duì)。圖顯示了與來(lái)自TFEB, MITF, TCFEB, TFE3和TCFE3家族的其他蛋白比對(duì)的僅20個(gè)氨基酸長(zhǎng)的TFEB_HUMAN序列片段?！皊p”表示SwissProt輸入條目，而“tr”表示Tremble輸入條目。P19484是UniProrKB登錄代碼。TFEB_HUMAN分別指示了基因名稱和物種名稱。
[0050]圖15:體內(nèi)TcFEB過(guò)量表達(dá)的策略。(A)用抗HA抗體免疫染色的凍存肝切片的代表性圖片(以確證病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率)。(B)來(lái)自Tcfeb-HA注射的和對(duì)照小鼠的肝蛋白提取物用HA和肌動(dòng)蛋白抗體免疫印跡。(C)生成TcFEB條件型過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠系。頂部顯示了 CRE重組酶之前和之后的轉(zhuǎn)基因載體圖。左側(cè)顯示同窩幼畜的代表性基因型，而右側(cè)顯示小鼠n4中相應(yīng)的肝特異性TFEB過(guò)量表達(dá)。
[0051]圖16 =TFEB過(guò)量表達(dá)增加MEF、NSC、HeLa和C0S-7細(xì)胞的培養(yǎng)基中溶酶體酶的釋放。在培養(yǎng)基和用空載體或TFEB表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中測(cè)定溶酶體酶酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和β_己糖胺酶的活性。根據(jù)生產(chǎn)商方案，使用PolyFect轉(zhuǎn)染試劑(凱杰公司(Qiagen))或 lipofectamine2000 試劑(英杰公司(Invitrogen))轉(zhuǎn)染 HeLa、Cos7 細(xì)胞和來(lái)自小鼠模型MLIV(S7)、MPSIIIA(S7)和MSD的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。前面描述了TFEB-3xFLAG HeLa穩(wěn)定細(xì)胞系(CF7) (2)。圖顯示了釋放的酶活性相較總活性的百分比。[0052]圖17:TFEB正向控制溶酶體的胞外分泌。MPSIIIA MEF細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10%FBS和青霉素/鏈霉素(正常培養(yǎng)基)的DMEM中。根據(jù)生產(chǎn)商方案，亞融合細(xì)胞使用LipofectamineTM2000(英杰公司)轉(zhuǎn)染。使用編碼有標(biāo)簽的硫酸胺酶(SGSH3XFlag)的質(zhì)粒和空質(zhì)?；蚓幋aTFEB的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MPS-1IIA MEF0轉(zhuǎn)染后一天，培養(yǎng)基用DMEM0.5%FBS置換。轉(zhuǎn)染后兩天，收集條件培養(yǎng)基和球團(tuán)用于硫酸胺酶活性測(cè)量，并且計(jì)算釋放到培養(yǎng)基中的酶的百分比。
[0053]圖18:溶酶體應(yīng)激誘導(dǎo)TFEB核移位。蛋白免疫印跡，所述蛋白提取自用氯喹(CQ)或水楊酰胺A (Salicylihalamide A) (SalA)處理的表達(dá)TFEB-3x Flag的HeLa細(xì)胞，并進(jìn)行核/胞質(zhì)分級(jí)分離以及用FLAG抗體印跡以檢測(cè)TFEB。組蛋白3 (H3)和微管蛋白分別用作核和胞質(zhì)的標(biāo)記。印跡是三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表。
[0054]圖19:mT0RCl調(diào)節(jié)TFEB。(A)溶酶體應(yīng)激抑制mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。如所示，從處理過(guò)夜的HeLa細(xì)胞中分離的蛋白提取物的免疫印跡。膜用p-T202/Y204_ERKl/2、ERK1/2、P-T389-S6K和S6K抗體探測(cè)以測(cè)量ERK和mTORCl活性。(B) Torinl誘導(dǎo)TFEB去磷酸化和核移位。從沒(méi)有氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且如所示后續(xù)刺激至少3h的TFEB - 3x FLAGHeLa細(xì)胞分離的胞質(zhì)和核部分的FLAG免疫印跡。用H3和微管蛋白抗體確證正確的亞細(xì)胞分級(jí)分離。(C，D) ERK和mTOR抑制劑對(duì)TFEB核移位的影響和劑量反應(yīng)曲線。TFEB - GFPHeLa細(xì)胞在384孔板上接種，培養(yǎng)12h，并用10種不同濃度的ERK抑制劑U0126或mTOR抑制劑雷帕霉素、Torinl和Torin2處理，所述濃度的范圍是2.54ηΜ_50 μ Μ。在37°C包含各個(gè)化合物的RPMI培養(yǎng)基中3h后，細(xì)胞洗滌、固定，并用DAPI染色，并且使用共聚焦自動(dòng)顯微鏡(Opera高含量系統(tǒng)，帕金埃爾默 公司(Perkin Elmer))照相。(C)各化合物的測(cè)試濃度的代表性圖片。標(biāo)尺條代表30ym。(D)圖顯示了各化合物的10個(gè)不同濃度下核移位的百分比(以濃度的對(duì)數(shù)計(jì))。使用Prism軟件計(jì)算各化合物的EC50 (詳細(xì)參見(jiàn)材料和方法)。
(E)氨基酸誘導(dǎo)TFEB分子量變化。從ΗΕΚ-293Τ細(xì)胞分離的蛋白提取物的免疫印跡，所述ΗΕΚ-293Τ細(xì)胞用TFEB-3XFLAG或空載體轉(zhuǎn)染，并且營(yíng)養(yǎng)饑餓和用氨基酸(a.a.)刺激50分鐘?？贵w使用p-T389-S6K、S6K和FLAG。(F) Rag敲減誘導(dǎo)TFEB核移位。穩(wěn)定表達(dá)Flag - 3xTFEB的HeLa細(xì)胞用編碼靶向螢光素酶(對(duì)照)或者RagC和RagD mRNA的短發(fā)夾(Sh_) RNA的慢病毒感染。轉(zhuǎn)染96h后，細(xì)胞不處理(N=正常培養(yǎng)基)、饑餓(S=饑餓培養(yǎng)基)或者用Torinl (T=Torinl)處理4h,并且用于核/胞質(zhì)分級(jí)分離。用FLAG抗體檢測(cè)TFEB定位,而微管蛋白和H3分別用作胞質(zhì)和核部分的對(duì)照；S6K磷酸化水平用于測(cè)試RagC和RagD敲減效率。(G)mT0RC2不影響TFEB磷酸化。從Sinl-/-或?qū)φ张咛?E14.5)分離的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)用編碼TFEB - 3xFLAG的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后48h，細(xì)胞用Torinl (T)處理4h，如所示用于核/胞質(zhì)分級(jí)分離并且用FLAG、微管蛋白和H3免疫印跡。
[0055]圖20:mT0RCl 在絲氨酸 142 (S142)磷酸化 TFEB。(A) Torinl 誘導(dǎo) S142 去磷酸化。HeLa細(xì)胞如所述處理，并且總體和核提取物用TFEB p_S142磷酸化抗體和抗FLAG抗體探測(cè)。(B)TFEB蛋白結(jié)構(gòu)示意圖顯示預(yù)測(cè)的mTORCl磷酸化位點(diǎn)和其在脊椎動(dòng)物中的保守性。根據(jù)人同種型I編號(hào)。(C)所述磷酸化位點(diǎn)的序列保守性評(píng)分，以及mTOR共有基序和TFEB磷酸化位點(diǎn)附近序列之間的定量一致性。⑶S142和S211調(diào)節(jié)TFEB定位。表達(dá)TFEB - 3xFlag的絲氨酸-向-丙氨酸突變體的HeLa細(xì)胞中TFEB亞細(xì)胞定位的Flag免疫染色。用DAPI對(duì)核進(jìn)行染色。數(shù)值是包含至少50個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的五個(gè)區(qū)域的平均。學(xué)生t檢驗(yàn)(未配對(duì))***P〈0.001。標(biāo)尺條代表30 μ m。
[0056]圖21:溶酶體通過(guò)TFEB調(diào)節(jié)基因表達(dá)。(A)氯奎處理抑制原代肝細(xì)胞中mTORCl的活性。從 2 月齡 Tcfebflox/flox (對(duì)照)和 Tcfebflox/flox; Alb-Cre (Tcfeb-/-)小鼠分離的原代肝細(xì)胞不處理或用Torinl、U0126或氯奎處理過(guò)夜。隨后，細(xì)胞裂解，并且蛋白提取物用所示抗體免疫印跡。(B，C)TFEB調(diào)節(jié)對(duì)氯奎和Torinl的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。來(lái)自對(duì)照(f lox/f 1x)和Tcfeb-/-(f lox/f lox; alb-Cre)小鼠的原代肝細(xì)胞中TFEB靶標(biāo)基因的定量PCR(qPCR)。細(xì)胞用氯奎(左)和Torinl(右)處理。表達(dá)水平顯示為所述處理對(duì)比相應(yīng)不處理樣品的表達(dá)增加％。指數(shù)表示三個(gè)獨(dú)立的肝細(xì)胞制備(三只小鼠/基因型)的平均值土s.d.。學(xué)生t檢驗(yàn)(雙尾)*P值< 0.05。
[0057]圖22用Torinl及其類似物Torin2處理降低了來(lái)自多種硫酸酯酶缺乏癥小鼠模型(MSD)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)中糖胺聚糖的積聚。從MSD小鼠分離的分化的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)用DMSOUOnM的Torinl或IOnM的torin2處理。24小時(shí)后，GAG含量用阿辛藍(lán)(AB)染色來(lái)測(cè)定。相較DMSO處理的細(xì)胞，兩種torin都能降低MSD處理細(xì)胞中的GAG染色。最下面圖顯示了 WT NSC中GAG染色的代表性圖片。
[0058]圖23:Torin2處理降低了 MSD細(xì)胞中形成空泡。分化的NSC固定在戊二醛上，并且處理以用于標(biāo)準(zhǔn)電子顯微鏡。
[0059]圖24:Torin2降低了 MSD小鼠肝中GAG的積聚。MSD小鼠用安慰劑(MSD_750)或torin2 (MSD_727)處理 10 天(口服；50%PEG400 中 0.3mg torin2/ 天 / 小鼠)。處理后，收集肝組織并且通過(guò)阿辛藍(lán)染色(黑點(diǎn))測(cè)定GAG的積聚。Torin2處理的小鼠顯示了肝組織中GAG積聚的降低(n=3)。顯示了用阿辛藍(lán)染色的WT肝的代表性圖片(WT_739)。
[0060]材料 和方法
[0061]細(xì)胞培養(yǎng)、培養(yǎng)基、藥物和細(xì)胞處理
[0062]HeLa和COS以及HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC。細(xì)胞在下面培養(yǎng)基中培養(yǎng):(正常)補(bǔ)充有10%FBS的DMEM高葡萄糖；(饑餓)補(bǔ)充有IOmM HEPES、有Ca和Mg的HBSS培養(yǎng)基；(血清)補(bǔ)充有20%FBS的EBSS ；(氨基酸培養(yǎng)基)無(wú)葡萄糖和無(wú)血清DMEM ;藥物處理:雷帕霉素(2.5mg/ml，西格瑪公司(SIGMA)) 2_4h，除非另有說(shuō)明；巴伐洛霉素(400nM，西格瑪公司)2_4h ;膜島素(100ng/ml 西格瑪公司)2h ;EGF、FGF (BD 生物科學(xué)(BD biosciences))；LIF(100ng/ml;ESGR0,密理博公司(Millipore) ) 2h ;PMA (I μ g/ml) 2h。U0126 (MEKi)在25mM(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司(Cell Signaling))使用，API2 (AKT抑制劑)在ImM使用。溶酶體抑制劑是抑胃酶肽和E64(10mg/ml4h西格瑪公司)。在圖-21-2的實(shí)驗(yàn)中使用下列藥物:雷帕霉素(2.5μΜ 5 μ Μ,除非另有說(shuō)明)來(lái)自西格瑪公司；Torinl (250ηΜ 250ηΜ,除非另有說(shuō)明)，來(lái)自TOCRIS公司；υ0126(50μΜ 50 μ Μ)，來(lái)自細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(Cell Signaling technology);氯奎(100 μ M 100 μ Μ),來(lái)自西格瑪公司；水楊酰胺(Salicylihalamide)A (2 μ M 2μΜ)是 Jeff De Brabander (德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心(UTSouthwestern))友情饋贈(zèng)。
[0063]如下述生成原代肝細(xì)胞:2月齡小鼠用阿佛丁(240mg/kg)深度麻醉，先用補(bǔ)充有IOmM HEPES和0.5mM EGTA的25ml HBSS (西格瑪公司H6648)灌注，然后用包含100U/ml膠原酶(Wako公司)和0.05mg/ml胰蛋白酶抑制劑(西格瑪公司)的相似溶液灌注。肝在皮氏培養(yǎng)皿中分離，細(xì)胞球團(tuán)在HBSS中洗漆，并且以濃度5x10s細(xì)胞/35mm培養(yǎng)涂板，以及在補(bǔ)充有10%FBS、2mM谷胺酰胺、0.1mM胰島素、0.1mM地塞米松和青霉素/鏈霉素的William培養(yǎng)基E中培養(yǎng)。第二天，如本文所述處理細(xì)胞。如原先所述(53)生成Sinl-/-和對(duì)照MEF,并且在補(bǔ)充有10%FBS、谷胺酰胺和青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。[0064]生成Tcfebflox小鼠系
[0065] 申請(qǐng)人:使用公共可用的胚胎干細(xì)胞(ES)克隆(http://www.eucomm.0rg/),其中通過(guò)同源重組在外顯子4和5靶向Tcfeb。重組ES細(xì)胞克隆注射到用于生成載有工程改造的等位基因小鼠系的胚泡中。肝特異性KO通過(guò)Flox/Flox小鼠與在白蛋白啟動(dòng)子下表達(dá)CRE的轉(zhuǎn)基因系小鼠(ALB-CRE)雜交生成，所述轉(zhuǎn)基因系小鼠獲自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Jacksonlaboratory)。所有涉及小鼠的方法得到貝勒醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。
[0066]轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒和siRNA
[0067]使用反向轉(zhuǎn)染方法,用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(Iipofectamine) LTX(英杰公司)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和SiRNA0 48或72h后收集siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。siRNA TFEB在50nM(達(dá)馬可公司(Dharmacon))使用，siRNA ERKI/2在100nM(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司(Cell Signaling))使用。
[0068]根據(jù)生產(chǎn)商方法,使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(Iipofectamine) 2000或LTX(英杰公司)將DNA 質(zhì)粒 pRK5-mycPATl、pCEP4_TFEB_his、pClG2_TFEB 和 p3x FLAG-CMVTFEB 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。根據(jù)生產(chǎn)商(司查塔基公司(Stratagene))指示,進(jìn)行定位誘變,通過(guò)測(cè)序證實(shí)正確的誘變。
[0069]Western 印跡
[0070]細(xì)胞或組織在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑(羅氏公司(ROCHE))和磷酸酶抑制劑(西格瑪公司)的RIPA緩沖液中溶解。10-30微克加載到4-12%Bis-Tris凝膠(NUPAGE，英杰公司)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并且使用ECL方法(皮爾斯公司(Pierce))通過(guò)免疫印跡分析。使用以下抗體:LC3(諾復(fù)斯生物制品公司)、FLAG、b-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白(西格瑪公司)、HA(科文斯公司(Covance) )、H3、ERK1/2、p-ERKl/2、p_AKT、P-70S6K(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司(Cell Signaling) )、ERK2 (圣克魯茲公司(Santa Cruz))。使用Imagej軟件分析定量蛋白水平。
[0071]核/胞質(zhì)分級(jí)分離
[0072]在6孔板中以50%融合接種細(xì)胞，并且血清饑餓過(guò)夜(ON)。第二天在DMSO或激酶抑制劑存在下加入正常培養(yǎng)基。如原先所報(bào)導(dǎo)進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí)分離。簡(jiǎn)單說(shuō)，細(xì)胞在0.5曲通 X-100 裂解緩沖液(50mM Tris-HCl.0.5% 曲通、137.5mM NaCl、10% 甘油、5mM EDTA，補(bǔ)充有新鮮蛋白酶和磷酸酶抑制劑)中裂解。上清液代表胞質(zhì)部分，而核球團(tuán)洗滌兩次，并在0.5曲通X-100緩沖液0.5%SDS中裂解并超聲處理。
[0073]長(zhǎng)壽命蛋白的降解
[0074]用L-U14C-絲氨酸培養(yǎng)亞融合細(xì)胞20h，并且用冷培養(yǎng)基追蹤Ih以降解短壽命蛋白。隨后細(xì)胞用正常培養(yǎng)基或饑餓培養(yǎng)基(最終存在3-MA)培養(yǎng)4h。從培養(yǎng)基中可溶放射活性與可酸性沉淀的細(xì)胞球團(tuán)中不溶放射活性的比率來(lái)計(jì)算長(zhǎng)壽命蛋白的降解速率。
[0075]RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、ChIP和定量PCR
[0076]使用TRIzol (英杰公司)從組織中或者使用RNAesy柱(凱杰公司)從細(xì)胞中提取總RNA。使用TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。溶酶體和自體吞噬基因特異性引物以在先報(bào)道2。自體吞噬基因引物和小鼠引物購(gòu)自SA生物科學(xué)公司(SABiosciences)。使用SA生物科學(xué)公司在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站(http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php)計(jì)算倍數(shù)變化,所述網(wǎng)站使用DDCt方法。簡(jiǎn)單說(shuō),最穩(wěn)定的持家基因(GAPDH、ACTB、B2M、RPL13A、HPRT和親環(huán)蛋白(Cyclophillin))的平均用作“標(biāo)準(zhǔn)化”基因以計(jì)算DCt值。然后，在“對(duì)照”組和“實(shí)驗(yàn)”組之間計(jì)算DDCt值。最后，使用2(_DDGt)計(jì)算倍數(shù)變化。分組生物學(xué)重復(fù)以使得計(jì)算倍數(shù)變化值。未配對(duì)T檢驗(yàn)用于計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖中星號(hào)指示P值〈0.05。
[0077]蛋白激酶預(yù)測(cè)
[0078] 申請(qǐng)人:使用五種方法，包含 CrPhos0.8、GPS_2.l、PhosphoMotifFinder、Networkin和PHOSIDA (15-19)，使用默認(rèn)參數(shù)。根據(jù)其置信評(píng)分，進(jìn)一步過(guò)濾CrPhos0.8和GPS-2.1預(yù)測(cè)。對(duì)前者而言，用假陽(yáng)性率(FPR)等于或小于30%來(lái)考慮預(yù)測(cè)。對(duì)后者而言，用評(píng)分等于或大于5來(lái)考慮預(yù)測(cè)。計(jì)算GPS-2.1評(píng)分以作為實(shí)際評(píng)分和臨界值之間的差異。從其他三種方法中獲得所有預(yù)測(cè)。Networkin的示例中，結(jié)合Networkin和Networkin2的預(yù)測(cè)。各方法描述了在不同激酶分類中與S142位點(diǎn)相關(guān)的激酶，所述分類簡(jiǎn)單涉及四種層次水平:激酶組、激酶家族、激酶亞家族和激酶本身。為了在各層次水平獲得一般共識(shí)，如果所述預(yù)測(cè)尚未以這四種層次水平分類，那么對(duì)各預(yù)測(cè)進(jìn)行這種分類。在http://kinase, org/kinbase數(shù)據(jù)庫(kù)的脊椎動(dòng)物進(jìn)化支和人物種下檢索缺失分類。根據(jù)各分類中的主要得票發(fā)現(xiàn)各分類的一致性。
[0079]體外激酶實(shí)驗(yàn)
[0080]TFEB-S-142:Seq Id N0.2 的氨基酸(aa.) 117-166:
[0081 ] PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNSPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
[0082]和TFEB-A_142:Seq Id N0.4，對(duì)應(yīng) Seq Id N0.2 的氨基酸 117-166，其中 Serl42用Ala (粗體)取代:
[0083]PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNAPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
[0084]其通過(guò)GENESCRIPT公司`合成。所述測(cè)試肽TFEB-A-142和TFEB-S-142在50mMHEPES pH7中制成ImM。其似乎沒(méi)有不溶解的問(wèn)題。使用密理博公司標(biāo)準(zhǔn)放射性測(cè)量試驗(yàn)，所述激酶試驗(yàn)在室溫下、在200 μ M ATP和100 μ M各個(gè)肽存在下進(jìn)行40分鐘。在其標(biāo)準(zhǔn)KinaseProf i Ier?試驗(yàn)濃度下使用所有蛋白激酶。培養(yǎng)之后，通過(guò)加入酸停止所有試驗(yàn)，并將等分樣品點(diǎn)樣在P30和Filtermat A上以分離產(chǎn)物。所有測(cè)試重復(fù)進(jìn)行三次，并且包含各蛋白激酶的常見(jiàn)底物作為對(duì)照。
[0085]體內(nèi)基因遞送
[0086]小鼠在貝勒醫(yī)學(xué)院的轉(zhuǎn)基因小鼠設(shè)施中飼養(yǎng)(美國(guó)德克薩斯州休斯頓)。GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠是N.Mizushima的友情饋贈(zèng)。除非另有說(shuō)明，使用C57B6雌性小鼠(4周齡)。所述AAV載體由TIGEM AAV載體中心實(shí)驗(yàn)室生成。簡(jiǎn)單說(shuō)，通過(guò)取代GFP序列，把小鼠TFEB (TcFEB)編碼序列克隆到pAAV2.1-CMV-GFP質(zhì)粒中，并與HA標(biāo)簽融合到框架中。然后將所得的PAAV2.1-CMV-TcFEB-HA與pAd-Helper和pack2/9包被質(zhì)粒三重轉(zhuǎn)染到亞融合293細(xì)胞中。重組AAV2/9載體通過(guò)兩輪CsCl純化。表達(dá)為基因組拷貝(GC/mL)的載體滴度通過(guò)使用TaqMan (馬薩諸塞州沃森姆的帕金埃爾瑪公司，生命和分析科學(xué))PCR定量和點(diǎn)印跡分析來(lái)評(píng)價(jià)。各小鼠用1.25χ10η病毒顆粒眼窩竇后注射，并且3周后殺死。分析基因表達(dá)時(shí)，饑餓小鼠禁食16h，或者分析GFP-LC3點(diǎn)數(shù)目時(shí)，禁食24h。
[0087]組織學(xué)和免疫熒光
[0088]收集肝樣品，并且在4%多聚甲醛的PBS固定過(guò)夜。在10和30%蔗糖的PBS中冷凍保存后，樣品在OCT (加利福尼亞州托蘭斯SF公司(Sakura Finetech))中冷凍，并且切片成30μm厚度。在Axioplan2(紐約州桑伍德的Zeiss公司)上照相。對(duì)免疫熒光而言，切片在室溫下2.5%BSA的PBS+0.1%曲通X-1OO中封閉2h。封閉后，樣品用一抗培養(yǎng)20h，氮后在PBS+0.05%TX-100中洗滌三次，用偶聯(lián)到Alexafluor 488或Alexafluor 555 (英杰公司)的二抗培養(yǎng)3h。對(duì)HA的免疫組織化學(xué)分析，使用親和素-生物素復(fù)合物(ABC)方法(Vectastain Elite ABC試劑盒)?？笹FP來(lái)自阿柏堪穆公司(Abcam);(稀釋1:500)。
[0089]電子顯微術(shù)
[0090]對(duì)照和TFEB過(guò)量表達(dá)細(xì)胞用PBS洗滌，并且在溶解在0.2M Hepes緩沖液(ρΗ7.4)中的1%戊二醛中室溫下固定30min。細(xì)胞然后在0s04中再固定2h。在梯度乙醇脫水后，細(xì)胞在Epon812(伏路卡公司(Fluka))中包埋，并且在60°C聚合72h。在Leica EM UC6中切薄切片，所述薄切片用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛復(fù)染。使用裝備有ULTRA VIEW CCD照相機(jī)(荷蘭艾恩德霍芬的飛利浦公司(Philips))的Philips Tecna1-12電子顯微鏡，從薄切片獲得EM圖片。使用AnalySIS軟件(德國(guó)明斯特的軟圖像系統(tǒng)(Soft Imaging Systems) GmbH)進(jìn)行空泡形成定量。選擇用于定量的細(xì)胞是基于其對(duì)體視學(xué)(stereologic)分析的適應(yīng)性，即僅僅分析通過(guò)其中心區(qū)域的細(xì)胞切片(基于存在高爾基膜的檢測(cè))。
[0091]動(dòng)物模型
[0092]所有涉及小鼠的方法得到貝勒醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。GFP-LC3轉(zhuǎn)基因系如原先所述。如下生產(chǎn)Tcfeb的組織特異性過(guò)量表達(dá):在CAGCAT盒[雞肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG)后接氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)cDNA (側(cè)接21oxP位點(diǎn))]后插入Tcfeb_3xFlagcDNA，并且用于生成轉(zhuǎn)基因小鼠(貝勒醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)基因中心)。小鼠然后與白蛋白-CRE(獲自杰克遜實(shí)驗(yàn)室)系雜交。對(duì)48饑餓方案而言，小鼠禁食22h，隨后進(jìn)食2h，并且殺死前再禁食 24h。
[0093]酶活性
[0094]使用合適的熒光測(cè)定或比色測(cè)定底物測(cè)量溶酶體酶酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和己糖胺酶的活性。SGSH活性按照Fraldi等Hum Mol Gen2007 (33)所述測(cè)量。
[0095]免疫印跡和抗體
[0096]小鼠抗TFEB單克隆抗體購(gòu)自MB公司(My Biosource)目錄號(hào)MBS120432。為了生成抗pS142特異性抗體，用下列偶聯(lián)到KLH的肽免疫兔子:AGNSAPN{pSer}PMAMLHIC。第四次免疫后，殺死兔子，并且收集血清。使用循環(huán)通過(guò)包含非磷酸化抗原的柱來(lái)除去血清中非磷酸化特異性的抗體。然后使用包含磷酸化肽的柱來(lái)純化磷酸化特異性抗體。
[0097]用包含蛋白酶和磷酸酶抑制劑(西格瑪公司)的M-PER緩沖液(賽默飛公司(Thermo))裂解細(xì)胞；如上述分離核/胞質(zhì)部分。蛋白通過(guò)SDS - PAGE (英杰公司；還原NuPAGE4 - 12%Bis_tris凝膠，MES SDS緩沖液)分離。如需要，所述凝膠使用20mllmperial蛋白染色(塞摩費(fèi)舍爾公司(Thermo Fisher))在室溫染色lh，并且用水脫色。通過(guò)用1-Blot (英杰公司)把蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行免疫印跡分析。所述膜用5%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液(含0.05%吐溫20的TBS)封閉，并且用一抗抗體抗FLAG和抗微管蛋白(西格瑪公司；1:2000)、抗H3(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司；1:10000)在室溫培養(yǎng)2h，而下列抗體在5%BSA 中培養(yǎng)過(guò)夜(ON):抗 TFEB (MB 公司;1:1000)、抗 P TFEB (1:1000) ERK1/2、p-ERKl/2、p-P70S6K、P70S6K (細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司；1:1000)。所述膜用TBS-T緩沖液洗滌三次，并且用堿性磷酸酶偶聯(lián)的IgG (普洛麥格公司；0.2mg/ml)室溫處理lh。所述膜用TBS緩沖液洗滌三次，并且表達(dá)的蛋白通過(guò)加入IOml Western Blue穩(wěn)定底物(普洛麥格公司)觀察。
[0098]高含量核移位試驗(yàn)
[0099]TFEB-GFP細(xì)胞在384孔板中接種，培養(yǎng)12小鼠，并且用10個(gè)不同濃度(50000nM、16666.66ηΜ、5555.55ηΜ、1851.85ηΜ、617.28ηΜ、205.76ηΜ、68.58ηΜ、22.86ηΜ、22.86ηΜ、
7.62ηΜ和2.54ηΜ)的ERK抑制劑U0126 (西格瑪奧德里奇公司)或mTOR抑制劑雷帕霉素(西格瑪奧德里奇公司)、Torinl和Torin2處理。3小時(shí)后，37°C下RPMI培養(yǎng)基中，細(xì)胞被洗滌、固定并且用DAPI染色。為了獲得圖像，通過(guò)使用聚焦自動(dòng)顯微鏡(Opera高含量系統(tǒng)，帕金埃爾默公司)，對(duì)384孔板的各孔照10張照片。開(kāi)發(fā)專門的腳本以進(jìn)行不同圖像中TFEB定位的分析(Acapella軟件，帕金埃爾默公司)。所述腳本計(jì)算來(lái)自核TFEB-GFP熒光平均強(qiáng)度除以TFEB-GFP熒光胞質(zhì)平均強(qiáng)度的比值。所得結(jié)構(gòu)使用相同板中的陰性(RPMI培養(yǎng)基)和陽(yáng)性(HBSS饑餓)對(duì)照樣品來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)通過(guò)使用Prism軟件(GraphPad軟件)的各化合物不同濃度的核移位百分比來(lái)表示。使用非線性回歸擬合(Prism軟件)計(jì)算各化合物的EC50。相同方法用于篩選145個(gè)激酶抑制劑庫(kù)。
[0100]溶酶體貯積癥實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞和小鼠模型的方法
[0101]細(xì)胞培養(yǎng)
[0102]從WT和MSD幼鼠(PO)的皮層中分離神經(jīng)元祖細(xì)胞，所述分離使用神經(jīng)組織分離試劑盒通過(guò)組織勻質(zhì)化和使用表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記普羅敏蛋白(Prominin)-1細(xì)胞的磁性分選分離(MBS公司(MiltenyiBiotecSrl))。神經(jīng)元祖細(xì)胞在存在EGF和FGF2生長(zhǎng)因子(PT公司(Pr印otech))的ESGRO完全培養(yǎng)基(海克隆公司(Hyclone))中培養(yǎng)。如所示，神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)由除去生長(zhǎng)因子而分化，并且在包含2%血清的ESGRO培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少48h。
[0103]小鼠處理
[0104]多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)小鼠用安慰劑(n=3)或torin2(n=3)處理10天(口服強(qiáng)飼；50%PEG400中0.3mg torin2/天/小鼠)。處理期間，監(jiān)測(cè)和稱重處理的小鼠(處理后沒(méi)有觀察到重量的變化)，并且所有處理的小鼠都存活。處理后，手機(jī)肝組織并且通過(guò)阿辛藍(lán)染色測(cè)定GAG的積聚。
[0105]NSC的阿辛藍(lán)染色
[0106]通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法從WT和MSD幼鼠(PO)的皮層中分離神經(jīng)元祖細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)室溫下在甲氧乙酰苯胺(Methacarn) (60%甲醇；10%乙酸；30%氯仿)固定15min。洗滌后，細(xì)胞在1%阿辛藍(lán)PH2.5中染色3小時(shí)，用0.3%乙酸和水淋洗，并且100%安裝已用于觀察。
[0107]組織樣品的阿辛藍(lán)染色
[0108]石蠟包埋的肝組織切片用1%阿辛藍(lán)(西格瑪-奧德里奇公司)染色，并且用核固紅(Nuclear-Fast red)(西格瑪-奧德里奇公司)復(fù)染。
[0109]電子顯微術(shù)
[0110]細(xì)胞用PBS洗滌，在0.05%戊二醛中固定，并且室溫下在0.2M Ifepes緩沖液(PH7.4)中溶解30min。細(xì)胞然后在0s04中再固定2h。在梯度乙醇脫水后，細(xì)胞在Epon812 (伏路卡公司(Fluka))中包埋，并且在60°C聚合72h。在Leica EM UC6中切薄切片，所述薄切片用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛復(fù)染。
[0111]結(jié)果[0112]TFEB誘導(dǎo)自體吞噬
[0113](巨)自體吞噬是進(jìn)化保守的機(jī)制，其把胞質(zhì)內(nèi)材料靶定到溶酶體，因而在營(yíng)養(yǎng)饑餓期間提供能量供應(yīng)(3)。饑餓期間自體吞噬活性由mTOR調(diào)節(jié)，mTOR活性依賴于細(xì)胞能量需要。
[0114]由于自體吞噬是自噬體和溶酶體緊密關(guān)聯(lián)的結(jié)果(1)， 申請(qǐng)人:測(cè)試了 TFEB是否調(diào)節(jié)自體吞噬，TFEB是控制溶酶體生物發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子。因?yàn)門FEB對(duì)溶酶體生物發(fā)生和功能(2)以及溶酶體的胞外分泌正向控制(圖16和17)，應(yīng)該預(yù)測(cè)到由于TFEB通過(guò)溶酶體而增加降解，TFEB過(guò)量表達(dá)應(yīng)該降低自噬體數(shù)目。令人驚訝的是，HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定的TFEB過(guò)量表達(dá)顯著增加了自噬體數(shù)目，如使用LC3標(biāo)記所測(cè)定，所述LC3標(biāo)記特異性結(jié)合自噬體(4-7)(圖la, b)。通過(guò)HeLa和Cos細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)TFEB獲得相似數(shù)據(jù)(圖5)。在過(guò)量表達(dá)TFEB的慢病毒感染的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上，通過(guò)電子顯微鏡也檢測(cè)到自噬體數(shù)目的增加(圖6)。這種增加在用自噬體的溶酶體抑制劑/LC3II降解巴伐洛霉素和抑胃酶肽/E64(8)處理的細(xì)胞中持續(xù)進(jìn)行，指示了 TFEB活化自噬體的形成(圖1a和7)。在TFEB過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)饑餓沒(méi)有再增加自噬體數(shù)目(圖la，c)，指示了 TFEB過(guò)量表達(dá)對(duì)自體吞噬的飽和效應(yīng)，并增加了 TFEB可以是饑餓誘導(dǎo)的自體吞噬的重要調(diào)節(jié)物的可能性。
[0115]與這些發(fā)現(xiàn)一致，HeLa細(xì)胞中TFEB的RNA干擾(RNAi)造成了正常和饑餓條件、有或沒(méi)有巴伐洛霉素存在下時(shí)LC3II水平的降低(圖ld-f)。顯然，LC3II的降低與不同RNAi寡核苷酸造成的TFEB水平的 下調(diào)有關(guān)，顯示了試驗(yàn)的特異性(圖1g)。這些功能獲得和功能喪失的數(shù)據(jù)指示了自卩遼體和溶酶體的生物發(fā)生(biogeneses)是由TFEB共同調(diào)節(jié)。 申請(qǐng)人:然后使用RFP-GFP串聯(lián)標(biāo)簽的LC3蛋白測(cè)量了自噬體向溶酶體運(yùn)輸?shù)乃俾?9)，所述標(biāo)簽的LC3蛋白區(qū)分早期溶酶體細(xì)胞器(GFP-陽(yáng)性/mRFP-陽(yáng)性)與酸化的自噬溶酶體(GFP-陰性/mRFP-陽(yáng)性)，因?yàn)镚FP信號(hào)(但不是mRFP)在酸性細(xì)胞器內(nèi)淬滅(9)。發(fā)現(xiàn)了 TFEB過(guò)量表達(dá)細(xì)胞中自噬溶酶體的數(shù)目高于對(duì)照細(xì)胞，這指示了 TFEB提高自噬體一溶酶體融合，因而促進(jìn)了溶酶體流動(dòng)(圖lh)。TFEB調(diào)節(jié)自體吞噬作用的功能證據(jù)來(lái)自TFEB過(guò)量表達(dá)能增強(qiáng)長(zhǎng)壽命蛋白的降解，并且TFEB敲減則降低。自體吞噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)消除這種增強(qiáng)(10)(圖8)。
[0116]為了測(cè)試TFEB是否調(diào)節(jié)自體吞噬基因的表達(dá)， 申請(qǐng)人:分析了報(bào)導(dǎo)參與自體吞噬通路數(shù)個(gè)步驟的一組51個(gè)基因的mRNA水平(1，12，13)。觀察到過(guò)量表達(dá)TFEB的細(xì)胞中自體吞噬基因表達(dá)水平的提高與饑餓期間所得的提高非常相似(HeLa細(xì)胞在EBSS培養(yǎng)基中4h)(皮爾遜(Pearson)相關(guān):r值=0.42; p值=0.001)，而其在TFEB沉默之后下調(diào)(圖2a 與表 1.2 和 2)。其中，UVRAG、ffIP1、MAPLC3B、SQSTMl、VPS11、VPS18 和 ATG9B 的表達(dá)受TFEB過(guò)量表達(dá)的影響最顯著(表1，2)。已知這些基因在自體吞噬的不同步驟中起作用，并且似乎是TFEB直接靶標(biāo)，因?yàn)槠湓趩?dòng)子中載有至少一個(gè)CLEAR位點(diǎn)⑵(圖9)。另外，在這四個(gè)基因中，通過(guò)定量染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)(QChip)確證了 TFEB與靶標(biāo)序列的結(jié)合(圖2b)。有趣的是，VPSl1、VPS18和UVRAG在自噬體運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中起作用(14)，這與TFEB過(guò)量表達(dá)細(xì)胞中溶酶體一自噬體融合的顯著增強(qiáng)一致。
[0117]這些數(shù)據(jù)指示TFEB參與饑餓誘導(dǎo)的自體吞噬的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。這個(gè)結(jié)論受下面觀察的強(qiáng)烈支持。首先，營(yíng)養(yǎng)饑餓誘導(dǎo)TFEB與溶酶體和自體吞噬基因啟動(dòng)子結(jié)合的增加，如QChIP所測(cè)量(圖2b)。第二，螢光素酶報(bào)導(dǎo)試驗(yàn)(2)顯示了饑餓增強(qiáng)TFEB對(duì)靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的影響(圖10)。第三，TFEB直接靶標(biāo)的表達(dá)在饑餓細(xì)胞中上調(diào)，并且這種上調(diào)受TFEB沉默的抑制(圖2a，c)。
[0118]饑餓調(diào)節(jié)TFEB的核移位和活性。
[0119]為了鑒定TFEB的饑餓誘導(dǎo)活化的機(jī)制， 申請(qǐng)人:分析了其在饑餓細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄后修飾。在正常條件下，TFEB定位到胞質(zhì)(2)。觀察到營(yíng)養(yǎng)饑餓(EBSS培養(yǎng)基)快速降低TFEB核移位(圖2d，e)，以及饑餓細(xì)胞的胞質(zhì)TFEB看來(lái)有比正常進(jìn)食細(xì)胞TFEB更低的分子量，如western印跡分析所示(圖1la)。這個(gè)分子量位移快速并短暫地發(fā)生，并且在向饑餓細(xì)胞中再加入正常培養(yǎng)基后I小時(shí)內(nèi)消除，同時(shí)核TFEB降低(圖1la)。通過(guò)提供有血清、氨基酸或者生長(zhǎng)因子(即胰島素或EGF)的EBSS培養(yǎng)基， 申請(qǐng)人:觀察到相較僅用饑餓培養(yǎng)基，TFEB核移位的顯著抑制(圖2f)。當(dāng)使用補(bǔ)充有細(xì)胞因子(即INF或LIF)的EBSS時(shí)，幾乎沒(méi)有影響(圖2f)，指示了 TFEB活化是由對(duì)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子敏感的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)的過(guò)程。 申請(qǐng)人:用補(bǔ)充有抑制mT0R(雷帕霉素)、PI3K-AKT(曲西立濱)和MEK(U0126)激酶的藥物的正常培養(yǎng)基刺激饑餓的細(xì)胞。MEKi抑制生成了與饑餓類似的TFEB核定位，而AKT和mTOR抑制沒(méi)有影響(圖2g和圖1lb)。這些數(shù)據(jù)指示了 TFEB活性受MAP激酶調(diào)節(jié)，揭示了這 個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的自體吞噬中有出乎意料的作用。此外，HeLa細(xì)胞中組成型活性MEK(caMEK)的表達(dá)在饑餓期間造成TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的下調(diào)，因而模擬了 TFEB敲減的效果(圖2h)，而TFEB消耗細(xì)胞中caMEK過(guò)量表達(dá)對(duì)TFEB靶標(biāo)基因的表達(dá)沒(méi)有影響(圖2h)。
[0120]絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)TFEB活性
[0121]為了更詳細(xì)分析MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和TFEB之間的關(guān)系， 申請(qǐng)人:進(jìn)行了質(zhì)譜分析，并且鑒定了至少三個(gè)絲氨酸(即S142、S332和S402)在營(yíng)養(yǎng)富集培養(yǎng)基中被磷酸化，但是在饑餓培養(yǎng)基中則沒(méi)有。把三個(gè)絲氨酸各自突變成丙氨酸以消除磷酸化。在HeLa細(xì)胞中表達(dá)各突變的TFEB蛋白，并且分析TFEB核移位。所述TFEB(S142A)突變顯示了比TFEB(WT)、TFEB(S332A)和TFEB(S402A)顯著增加的核定位(圖3a和圖12a)。相反，磷酸模擬突變(TFEB S142D)在營(yíng)養(yǎng)饑餓中不能移位到核(圖12b)。所述S142A TFEB突變?cè)谡Ｅ囵B(yǎng)基中在更小分子量處遷移，但是在饑餓培養(yǎng)基中則不是，而所述S142D突變?cè)陴囸I培養(yǎng)基中顯示了比WT TFEB的變化更小(圖12c，d)，這進(jìn)一步證明了 S142在正常培養(yǎng)基中磷酸化，但是在在饑餓培養(yǎng)基中則沒(méi)有。相較TFEB (WT) ,TFEB (S332A)和TFEB (S402A)，TFEB (S142A)的表達(dá)造成TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)水平的增加(圖3b)。一致地，相較wt TFEB, TFEB(S142A)產(chǎn)生自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的更強(qiáng)的誘導(dǎo)，如自噬體(圖3c和圖13)、溶酶體(圖3d)和自噬溶酶體(圖3e)數(shù)目增加所顯示。因此，TFEB核移位和活化受絲氨酸142磷酸化的調(diào)節(jié)。
[0122]為了鑒定負(fù)責(zé)絲氨酸142磷酸化的特異性激酶， 申請(qǐng)人:進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所述分析使用基于在一組實(shí)驗(yàn)確證的磷酸化位點(diǎn)基礎(chǔ)上構(gòu)建的計(jì)算模型的方法(15-19)(詳細(xì)見(jiàn)方法)。與前面結(jié)果一致，鑒定了絲氨酸特異性胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)作為絲氨酸142磷酸化的一流(top-ranking)候選(表3)。有趣地是,絲氨酸142在其他HLH-亮氨酸拉鏈基因家族成員中高度保守，例如小眼畸形(Microphthalmia)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)(圖14)中發(fā)現(xiàn)是由ERK2磷酸化(20)。ERK2介導(dǎo)TFEB磷酸化的其他證據(jù)來(lái)自在正常培養(yǎng)中ERK2-TFEB免疫共沉淀(圖3f)，但是在饑餓培養(yǎng)中則沒(méi)有。此外，SiRNA介導(dǎo)的ERK1/2蛋白敲減誘導(dǎo)與營(yíng)養(yǎng)饑餓相似程度的TFEB核移位(圖3h)。
[0123]TFEB介導(dǎo)的自體吞噬誘導(dǎo)的體內(nèi)分析。
[0124] 申請(qǐng)人:分析了在GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)溶酶體/自體吞噬通路的TFEB介導(dǎo)控制的生理相關(guān)性(11)。由于已報(bào)導(dǎo)肝中觀察到營(yíng)養(yǎng)消耗后的自體吞噬反應(yīng)，他們關(guān)注肝的研究。肝中，GFP陽(yáng)性囊泡的數(shù)目在禁食24h后開(kāi)始增加，并且在48h達(dá)到峰值(48h饑餓方案見(jiàn)材料和方法)(圖4a)，而禁食16h后，自體吞噬和溶酶體TFEB靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)明顯(圖4b)。因此，轉(zhuǎn)錄活化先于自噬體的體內(nèi)形成。重要地是，禁食16h時(shí)，TFEB亞細(xì)胞定位全部在核中(圖4c，d)，并且ERK磷酸化水平比喂養(yǎng)動(dòng)物降低(圖4e)，表明饑餓調(diào)節(jié)體內(nèi)TFEB活性，這與培養(yǎng)細(xì)胞中觀察到的相似。
[0125] 申請(qǐng)人:使用病毒和轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的TFEB過(guò)量表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)TFEB是否足夠誘導(dǎo)體內(nèi)自體吞噬。用包含HA表位標(biāo)簽的鼠TcfebcDNA的腺關(guān)聯(lián)病毒(AAV)載體(AAV2/9 - Tcfeb-HA)全身(systemically)注射GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠(11)(圖15a，b)。來(lái)自Tcfeb注射動(dòng)物的肝樣品顯示了 GFP陽(yáng)性囊泡的顯著增加，并且這種增加由饑餓進(jìn)一步增強(qiáng)(圖4e，f)。另外，來(lái)自條件Tcfeb-3xFLAG轉(zhuǎn)基因小鼠的肝樣品(其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)由肝特異性CRE重組酶驅(qū)動(dòng)(即白蛋白-CRE)(圖15c))顯示了溶酶體和自體吞噬基因表達(dá)和自噬體數(shù)目相較對(duì)照同胞仔的顯著增加(圖4g，h)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明TFEB在饑餓誘導(dǎo)自體吞噬的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的重要作用。
[0126]TORCl調(diào)節(jié)TFEB亞細(xì)胞定位
[0127]然后在HeLa和HEK-293T細(xì)胞中分析TFEB亞細(xì)胞定位，所述細(xì)胞用TFEB - 3xFLAG質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并且用溶酶體功能抑制劑處理過(guò)夜。這些處理包含使用氯奎(溶酶體pH梯度抑制劑)和水楊酰胺A(SalA) (ν-ΑΤΡ酶選擇性抑制劑)(39)。核/胞質(zhì)分級(jí)分離后進(jìn)行的免疫印跡顯示了溶酶體應(yīng)激也誘導(dǎo)外源表達(dá)的TFEB的核移位，并且TFEB核積聚也與TFEB - 3x FLAG向更低分子量變化有關(guān)，指示了溶酶體應(yīng)激可以影響TFEB磷酸化狀態(tài)(圖18)。
[0128]基于mTORCl位于溶酶體膜和其活性依賴營(yíng)養(yǎng)和溶酶體功能(40，41)， 申請(qǐng)人:假定溶酶體應(yīng)激對(duì)TFEB核移位的影響可以由mTORCl介導(dǎo)。與這個(gè)觀點(diǎn)一致，氯奎或SalA抑制mTORCl活性，如P-P70S6K (已知mTORCl底物)水平所測(cè)量(圖19A，41)。mTOR的參與看來(lái)與原先已知mTOR抑制劑雷帕霉素不影響TFEB活性的觀察相反。然而，近期數(shù)據(jù)指示雷帕霉素是mTOR的部分抑制劑，因?yàn)樵谶@種藥物存在下，一些底物仍然被有效地磷酸化(42)。因此， 申請(qǐng)人:使用激酶抑制劑Torin I和Torin 2 (屬于靶向mTOR催化位點(diǎn)的新分子類型)因而完全抑制mTOR活性(42，46，47)。
[0129] 申請(qǐng)人:用補(bǔ)充有Torin 1(250nM)、雷帕霉素(2.5 μ Μ)或ERK抑制齊[JUO126 (50 μ Μ)的富含氨基酸培養(yǎng)基刺激饑餓細(xì)胞，在所述細(xì)胞中TFEB被磷酸化并且定位到核。僅用營(yíng)養(yǎng)刺激饑餓細(xì)胞誘導(dǎo)TFEB分子量的顯著變化，并且重新定位到胞質(zhì)中(圖19Β)。在濃度為50 μ M的ERK抑制劑U0126存在下，營(yíng)養(yǎng)刺激僅誘導(dǎo)部分TFEB分子量變化，表明ERK磷酸化對(duì)TFEB胞質(zhì)定位起部分作用。用2.5 μ M雷帕霉素處理也造成部分分子量變化，但是不影響TFEB的亞細(xì)胞定位(圖19Β)。然而，Torin I (250ηΜ)處理完全防止?fàn)I養(yǎng)誘導(dǎo)的分子量變化，繼而造成大量TFEB核積聚。[0130]因?yàn)門orin I抑制mTORCl和mT0RC2復(fù)合物， 申請(qǐng)人:然后評(píng)價(jià)了各復(fù)合物對(duì)TFEB的調(diào)節(jié)作用。下面三個(gè)觀察指示了 TFEB主要由mTORCl調(diào)節(jié):(I)用氨基酸刺激饑餓細(xì)胞(所述氨基酸活化mTORCl但是不活化mT0RC2)，誘導(dǎo)廣泛的TFEB分子量變化，所述分子量變化強(qiáng)烈暗示了磷酸化事件(圖19E) ; (2)敲減向mTORCl介導(dǎo)氨基酸信號(hào)的RagC和RagD，甚至在全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞中造成TFEB核積聚(圖19F) ; (3)在mT0RC2信號(hào)破壞的細(xì)胞中(Sinl-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)) (52-54)中，TFEB在Torin I處理后經(jīng)歷與對(duì)照細(xì)胞相似的分子量變化和核移位(圖19G)。
[0131]mTORCl通過(guò)S142磷酸化控制TFEB亞細(xì)胞定位
[0132]為了測(cè)試mTORCl是否在S142磷酸化TFEB， 申請(qǐng)人:生成了僅識(shí)別S142磷酸化的TFEB磷酸特異性抗體。使用這種抗體， 申請(qǐng)人:觀察到在穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)TFEB - 3xFLAG并且在營(yíng)養(yǎng)耗盡培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中，TFEB不再有S142磷酸化，這與上面報(bào)導(dǎo)的 申請(qǐng)人:的結(jié)果一致(圖20A)。
[0133]然后，分析了在補(bǔ)充有含或不含Torin I或雷帕霉素的正常培養(yǎng)基的饑餓細(xì)胞中的S142磷酸化水平。當(dāng)Torin I清楚地減弱營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)的S142磷酸化時(shí)，雷帕霉素卻沒(méi)有這效果，表明S142表示雷帕霉素抗性mTORCl位點(diǎn)(圖20A)。這些結(jié)果清楚地表明TFEB是mTOR底物，并且S142是mTOR對(duì)TFEB磷酸化的關(guān)鍵殘基。
[0134]近期的發(fā)現(xiàn)指示了 mTORCl在多個(gè)位點(diǎn)磷酸化其靶標(biāo)蛋白(43，44，45)。為了鑒定其他可以被mTOR磷酸化的絲氨酸殘基， 申請(qǐng)人:檢索了 TFEB編碼序列中mTORCl的共有磷酸受體基序(43)(圖20B和C)。將 推定為mTORCl靶標(biāo)的所有TFEB氨基酸殘基突變成丙氨酸。然后測(cè)試了各個(gè)突變對(duì)TFEB亞細(xì)胞定位的影響，并且發(fā)現(xiàn)與S142A相似，位點(diǎn)211的絲氨酸-丙氨酸突變(S211A)造成TFEB的組成型核定位(圖20D)。其他絲氨酸殘基突變與野生型TFEB的表現(xiàn)相似(圖20D)。
[0135]總之，這些數(shù)據(jù)指示了除S142以外，S211也在TFEB亞細(xì)胞定位中起作用，并且表明S211表示mTORCl的其他靶位點(diǎn)。
[0136]溶酶體調(diào)節(jié)TFEB中的基因表達(dá)
[0137]因?yàn)門FEB與mTORCl的相互作用控制TFEB核移位， 申請(qǐng)人:測(cè)試了 TFEB調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力是否受這種相互作用的影響。在來(lái)自肝中刪除TFEB的條件敲除小鼠系(Tcfebflox/flox;alb-CRE)和對(duì)照小鼠系(Tcfebflox/f1x)的原代肝細(xì)胞中測(cè)試TFEB靶標(biāo)的數(shù)個(gè)溶酶體/自體吞噬基因的表達(dá)(37)。細(xì)胞用氯奎或Torinl處理，或不處理。這些處理抑制mTOR，如p-S6K水平所測(cè)量的，而p_ERK的水平?jīng)]有受影響(圖21A)。相較對(duì)照肝細(xì)胞，從TFEB條件敲除小鼠中分離并且在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞在數(shù)個(gè)TFEB靶標(biāo)基因的表達(dá)水平上沒(méi)有顯示顯著差異。然而，雖然TFEB靶標(biāo)基因的表達(dá)在來(lái)自用氯奎處理后的對(duì)照小鼠肝細(xì)胞中上調(diào)，但是這種上調(diào)在TFEB條件敲除小鼠的肝細(xì)胞中顯著減弱(圖21B)。相似地，對(duì)Torinl處理的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在TFEB條件敲除小鼠的肝細(xì)胞中顯著降低(圖21C)?？傊@些結(jié)果指示了 TFEB在通過(guò)mTOR的溶酶體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中起重要作用。
[0138]鑒定誘導(dǎo)胞質(zhì)TFEB向核移動(dòng)的其他激酶抑制劑
[0139]為了發(fā)現(xiàn)其他能誘導(dǎo)TFEB從胞質(zhì)向核移位的小分子， 申請(qǐng)人:開(kāi)發(fā)了基于使用穩(wěn)定過(guò)量表達(dá)融合到綠色熒光蛋白的TFEB (TFEB-GFP)的HeLa細(xì)胞的高含量試驗(yàn)。在這個(gè)試驗(yàn)中，通過(guò)自動(dòng)共焦顯微鏡(OPERA系統(tǒng))獲得處理細(xì)胞的圖像，并且用Acapella圖像軟件分析這些圖像以計(jì)算胞質(zhì)和細(xì)胞核之間TFEB-GFP的平均熒光強(qiáng)度(詳細(xì)見(jiàn)材料和方法)。為了驗(yàn)證所述試驗(yàn)，作者測(cè)試了 ERK抑制劑U0126和mTOR抑制劑雷帕霉素、torinl和torin2(圖19C)。各抑制劑測(cè)試了 10個(gè)濃度。活化TFEB核移位的最有潛能的化合物是Torinl (EC50; 147.9nM)以及其類似物Torin 2 (EC50; 1666nM)。部分mTOR抑制劑雷帕霉素和ERK抑制劑U016的EC50分別是104.3 μ M和80.4 μ M(圖19D)。使用Torinl作為參照化合物以篩選145個(gè)化合物的激酶抑制劑庫(kù)(SC公司(SelleckChem) )。TFEB-GFP細(xì)胞在384孔板中接種，培養(yǎng)12h，并用各化合物范圍是50 μ Μ-2.54ηΜ的10個(gè)不同濃度處理。在含各個(gè)化合物的RPMI培養(yǎng)基中37°C 3h后，細(xì)胞洗滌、固定，并用DAPI染色，并且使用共聚焦自動(dòng)顯微鏡照相。作為4次運(yùn)行的結(jié)果，使用Prism軟件從劑量效應(yīng)曲線中計(jì)算各化合物的EC50?；钚曰衔镌诒?中分組。所得結(jié)果清晰顯示了活性化合物最富集的種類是PI3K-mT0R通路抑制劑(表1，黑體)，表明這個(gè)通路代表了調(diào)節(jié)TFEB從胞質(zhì)向核移動(dòng)中的主要作用物。除了這個(gè)種類， 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)選中了蛋白酪氨酸激酶受體抑制劑(EGFR、VEGFR、PDGFR.Met.1GFR,ALK)和參與細(xì)胞分裂的激酶抑制劑(CDK、極光和polo-樣激酶)。其他代表性分類是P38激酶JAK2、JNK、GSK3、PKC和MAPK抑制劑(表4)。下表4中，“A”指EC50等于或小于7000nM的化合物；“B”指EC50大于7000但是小于或等于15000的化合物；“C”指EC50大于15000的化合物。
[0140]表4:誘導(dǎo)胞質(zhì)TFEB向核移動(dòng)的激酶抑制劑
[0141]l.PI3K_mT0R 通路 MC Mendoza 等，The Ras-ERK and PI3K_mT0Rpathways: cross-talk and compensation (“Ras-ERK 和 PI3K-mT0R 通路:交互作用和補(bǔ)償，，)(2011) Trends in Biochemical Sciences36 (6): 320
[0142]`
【權(quán)利要求】
1.一種用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的TFEB磷酸化抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的TFEB磷酸化抑制劑，其特征在于，所述抑制劑作用于TFEB磷酸化通路的激酶。
3.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶是mTOR和/或PI3K。
4.如權(quán)利要求3所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第I部分PI3K-mT0R通路中列舉的化合物。
5.如權(quán)利要求1或2所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑作用于直接磷酸化TFEB分子的激酶。
6.如權(quán)利要求5所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑抑制絲氨酸特異性胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)。
7.如權(quán)利要求6所述的抑制劑，其特征在于，所述ERK激酶是ERK2激酶。
8.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第2部分Ras-ERK通路中列舉的化合物組。
9.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶是促分裂原活化蛋白激酶。
10.如權(quán)利要求9所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第3部分促分裂原活化蛋白激酶中列舉的化合物組。
11.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶是極光激酶。
12.如權(quán)利要求11所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第4部分極光激酶中列舉的化合物組。
13.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶是受體酪氨酸激酶。
14.如權(quán)利要求13所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第5部分受體酪氨酸激酶中列舉的化合物組。
15.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶是Polo-樣激酶。
16.如權(quán)利要求15所述的抑制劑,其特征在于,所述抑制劑屬于表4第6部分Polo-樣激酶中列舉的化合物組。
17.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶屬于JAK-STAT通路。
18.如權(quán)利要求17所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第7部分JAK-STAT通路中列舉的化合物組。
19.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶。
20.如權(quán)利要求19所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第8部分細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶中列舉的化合物組。
21.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶屬于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
22.如權(quán)利要求21所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第9部分Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中列舉的化合物組。
23.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶是Src家族激酶。
24.如權(quán)利要求23所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第10部分Src家族激酶中列舉的化合物組。
25.如權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述激酶屬于蛋白激酶C家族。
26.如權(quán)利要求25所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑屬于表4第11部分蛋白激酶C家族中列舉的化合物組。
27.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抑制劑用于治療需要誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的疾病。
28.如權(quán)利要求27所述的抑制劑用于治療任意下列病癥:溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
29.如權(quán)利要求28所述的抑制劑，其特征在于，所述溶酶體貯積癥屬于下組:激活因子缺乏癥/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、α -甘露糖苷貯積癥、天冬氨?；咸烟前纺?、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇病(包含I型、II型和III型)、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/青少年型、成年型/慢性)、1細(xì)胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、假性赫爾利多營(yíng)養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合癥、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合征、A型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質(zhì)酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏病/晚嬰型CLN2/TPPl病、Kufs/成人發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積病、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、青少年山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙 性白癡/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
30.如權(quán)利要求28所述的抑制劑，其特征在于，所述肝病屬于下組:αI抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
31.如權(quán)利要求28所述的抑制劑，其特征在于，所述肌肉疾病屬于下組:自體吞噬液泡肌病和過(guò)度自噬X連鎖肌病。
32.如權(quán)利要求28所述的抑制劑，其特征在于，所述代謝疾病屬于下組:高膽固醇血癥和脂肪肝病。
33.如權(quán)利要求28所述的抑制劑，其特征在于，所述神經(jīng)退行性疾病屬于下組:阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病和脊髓性小腦萎縮癥。
34.如權(quán)利要求1- 26中任一項(xiàng)所述的抑制劑在增加細(xì)胞生成內(nèi)源或重組溶酶體酶中的應(yīng)用。
35.一種生成溶酶體內(nèi)源或重組酶的方法，所述方法包含:(1)使如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的抑制劑與細(xì)胞中自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)接觸；(2)誘導(dǎo)所述自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)；和(3)增加所述溶酶體酶的產(chǎn)量。
36.一種通過(guò)給予對(duì)象治療有效量的如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的抑制劑以治療疾病的方法。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述疾病通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)來(lái)緩解。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述疾病選自下組:溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是代謝疾病，其中所述代謝疾病是高膽固醇血癥或脂肪肝病。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是神經(jīng)退行性疾病，并且所述神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病或脊髓性小腦萎縮癥。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是溶酶體貯積癥，并且其中所述溶酶體疾病是:激活因子缺乏癥/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、α -甘露糖苷貯積癥、天冬氨?；咸烟前纺?、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇病(包含I型、II型和III型)、GMl神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/青少年型、成年型/慢性)、1細(xì)胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、假性赫爾利多營(yíng)養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合癥、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合征、A型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質(zhì)酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏病/晚嬰型CLN2/TPP1病、Kufs/成人發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積病、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、青少年山霍 夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是肝病，并且所述肝病是α?抗胰蛋白酶缺陷或脂肪肝病。
43.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病是肌肉疾病，并且所述肌肉疾病是自體吞噬液泡肌病或過(guò)度自噬X連鎖肌病。
44.一種治療疾病的方法，所述方法包括如下步驟:(I)給予如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的抑制劑；(2)在細(xì)胞中誘導(dǎo)自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)；和(3)增強(qiáng)細(xì)胞清除。
【文檔編號(hào)】A61P3/00GK103458970SQ201280012191
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月7日
【發(fā)明者】C·塞滕布里, A·巴拉比奧, D·L·梅迪納薩納巴里 申請(qǐng)人:泰萊托恩基金會(huì)