專利名稱：一種具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法。
背景技術：
竹子的醫療作用早已為我國人們所認識，據《本草綱目》記，苦竹、甘竹、淡竹及竹浙、竹筍等均有不同的藥用價值。竹子中的藥用成分主要是黃酮類成分，竹葉黃酮具有明顯的抗脂質過氧化、清除羥自由基和調節血脂功能及抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、抗潰瘍、抗病毒、保護心血管疾病及保肝等生理活性，是一種十分理想的天然生物黃酮新資源。
發明內容
本發明目的旨在充分利用我國竹葉資源，提供一種具有降血糖活性的高黃酮含量的竹葉提取物制備方法，并應用于食品與保健品中，克服現有技術的不足，具有工藝簡單、操作方便、產品竹葉黃酮含量高、設備投資少、無環境污染的優點。本發明采用的技術方案是一種具有降血糖活性高含量竹葉黃酮提取物的制備方法，所述方法按如下步驟進行(I)將新鮮竹葉清洗、烘干后粉碎并過20目篩，獲得竹葉粉末，將竹葉粉末與水以質量比I Ho混合后，在室溫下攪拌浸泡廣3h，然后升溫至8(T10(TC下加熱回流浸提O. 5 3h，冷卻至3(T50°C后 過濾，獲得濾液，即竹葉水提物；(2)在步驟(I)獲得的竹葉水提物中攪拌加入絮凝劑，在室溫下靜置疒6h，然后離心(優選在每分鐘10000轉的條件下，于20°C離心10分鐘)，棄去沉淀，獲得上清液a ;所述絮凝劑為海藻酸鈉、殼聚糖或羧甲基纖維素；(3)將步驟(2)獲得的上清液a減壓濃縮后加入乙醇水溶液使乙醇體積終濃度為7(Γ90%，靜置Γ12小時后，離心，獲得上清液b，將上清液b減壓濃縮至濃縮物無乙醇味，獲得浸膏；通常工藝上常選用95%的乙醇在醇沉，濃縮物中無乙醇味通常指乙醇體積濃度低于5%。(4)將步驟(3)獲得的浸膏加水配成混合液，再將混合液用萃取劑在5(T80°C條件下攪拌30 90分鐘進行萃取，萃取完全后冷卻至3(T4(TC，靜置分層，獲得上層萃取液和下層萃余液，將上層萃取液減壓濃縮(優選于旋轉蒸發儀中，在真空度為O. 09Mpa，5(T6(TC條件下減壓濃縮)，除去溶劑和水，即得竹葉黃酮粗提液；所述萃取劑由有機溶劑A和有機溶劑B以體積比為1000:1飛混合組成，有機溶劑A為乙酸乙酯或乙酸乙酯與異丙醇以體積比5^9:1的混合溶液；有機溶劑B為乙酸；(5)將步驟(4)獲得竹葉黃酮粗提液進行柱層析，以聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)為吸附劑，以體積濃度709Γ80%的乙醇水溶液為洗脫劑，收集含目標組分的洗脫液，將洗脫液減壓濃縮除去水(優選在真空度為O. 09Mpa，5(T6(TC條件下減壓濃縮)，獲得竹葉黃酮提取物，再以2BV體積濃度95%的乙醇水溶液洗脫層析柱來再生聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)。進一步，步驟(2)所述絮凝劑以質量濃度O. f 5%絮凝劑水溶液的形式加入。進一步，步驟(2)所述絮凝劑水溶液與竹葉水提物體積比為廣5:1000。進一步，步驟(2)所述絮凝劑以質量濃度1%絮凝劑水溶液的形式加入，絮凝劑水溶液與竹葉水提物體積比為2:1000。進一步，將步驟(2)獲得的上清液a體積減壓濃縮至步驟(I)獲得的竹葉水提物體積的l/2(Tl/30倍，加入體積濃度95%乙醇水溶液使乙醇體積終濃度為70 90%(優選80%)。進一步，所述混合溶液是將步驟(3)獲得的浸膏加水配成步驟(I)獲得的竹葉水提物體積的1/1(Γ /8倍。進一步，步驟(4)中所述萃取劑由有機溶劑A和有機溶劑B以體積比為1000:2混合組成，有機溶劑A為乙酸乙酯或乙酸乙酯與異丙醇以體積比8:1的混合液；有機溶劑B為乙酸。進一步，步驟(4)中所述萃取劑的體積用量與混合液的體積比為2 5:1。進一步，步驟(5)中所述柱層析按如下步驟進行將步驟(4)獲得竹葉黃酮粗提液以O. 01 O. 05BV/min (優選O. 02BV/min)速度加入裝有聚乙烯聚吡咯烷酮的層析柱，先用2飛BV的蒸餾水洗脫至流出液無色，再以3 5 BV體積濃度70% 80% (優選75%)的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮除去水，獲得竹葉黃酮提取物。進一步，所述步 驟(5)中聚乙烯聚吡咯烷酮用量為竹葉粉末質量的1/2。本發明所述竹葉粉末按如下方法獲得以I 2年生剛竹屬淡竹的干青葉為原料，要求在秋冬季(11月 翌年2月)采收，采收后及時脫水干燥至水分含量在12%以下，破碎打包后在通風干燥的環境中儲存。允許在干青葉中混有少量的桿籜。 本發明獲得的竹葉黃酮可直接用于食品或保健品中。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在(I)本發明的竹葉黃酮提物制備方法中使用的萃取劑為食品添加劑，安全性能好；聚乙烯聚吡咯烷酮是啤酒澄清劑，用于食品成分分離純化安全性好。(2)本發明方法獲得的竹葉黃酮含量81-86 %，回收率為28. 3-33% ；(3)本發明方法具有工藝簡單、操作方便、黃酮含量高、設備投資少、產品可用于普通食品中等優勢。
圖1實施例2制備的竹葉水提物液相色譜圖；圖2實施例2制備的竹葉高黃酮含量提取物液相色譜圖，圖中峰1-峰9為黃酮類成分。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此所述竹葉粉末的制備方法為以I 2年生剛竹屬淡竹的干青葉為原料，要求在秋冬季(11月 翌年2月)采收，及時脫水干燥至水分含量在10%以下，破碎至20目打包后在干燥的環境中儲存。竹葉水提物與竹葉黃酮提取物液相色譜條件液相條件(Eclipse XDB-C18色譜柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m);流動相混合溶劑A(乙腈)和溶劑 B (O. 2% 乙酸水，v/v)梯度洗脫條件10% A (34 min)，10-15% A (34-82 min)，15-10% A (85-90 min)。流速1. OmL · mirT1 ;檢測波長 330nm ;柱溫 30°C ;進樣量 20 μ L)。實施例1稱取IOOg粉碎至20目的竹葉粉末于圓底燒瓶中，加入IOOOg 7jC，室溫(25°C)攪拌浸泡3小時，然后在100°C下加熱回流浸提3小時，將反應液冷卻至30°C，過濾，取濾液即得竹葉水提物，約985 mL ;在竹葉水提物中加入ImL質量濃度O. 2%海藻酸鈉水溶液，室溫下攪拌6小時，然后在20°C下，以每分鐘10000轉高速離心10分鐘除沉淀，獲得上清液；取上清液在旋轉蒸發儀(O. 09MPa, 60°C )中減壓濃縮至35 mL,加入體積濃度95%乙醇水溶液IOOmL使乙醇體積終濃度為70%，靜置6小時后，取上清液，于旋轉蒸發儀(O. 09MPa, 60°C )上濃縮至約35mL，獲得浸膏，此時浸膏中乙醇殘留量約為3. 2% (體積濃度)；將浸膏加入蒸餾水配成IOOmL混合液，加入三口圓底瓶中，同時在圓底瓶中加入300mL乙酸乙酯和ImL乙酸制成混合液，將混合液在50°C下攪拌萃取90分鐘進行萃取，然后將混合液冷卻至30°C，置于分液漏斗中，靜置30分鐘進行分層，獲得上層萃取液和下層萃余液；上層萃取液在旋轉蒸發儀(O. 09MPa，60°C)上濃縮至40mL左右，得到竹葉黃酮粗提液。將竹葉黃酮粗提液按O. 01 4BV/min流速加入裝有60ml聚乙烯聚卩比咯燒酮(pvpp)色譜柱(2.4CmX60Cm)上進行吸附，上樣完后，用2BV蒸餾水進行洗脫，除去糖份和蛋白類成分，再用4BV體積濃度80%乙醇水溶液洗脫黃酮類成分，收集這部分洗脫液，將洗脫液在旋轉蒸發儀(O. 09MPa，55°C)上減壓濃縮至含水量小于5%，得到竹葉黃酮提取物4. 9g。紫外分管光度法測得黃酮含量81. 5%，黃酮提取率29. 8%。實施例2稱取Ikg粉碎至20目的竹葉粉末于圓底燒瓶中，加入7kg水，室溫(25°C)攪拌浸泡2小時，然后在100°C下加熱回流浸提3小時，將反應液冷卻至40°C，過濾，取濾液即得竹葉水提物6. 95L ;在所述竹葉水提物中加入30ml質量濃度5%殼聚糖水溶液，室溫攪拌5小時，然后在20°C下，以每分鐘10000轉高速離心10分鐘除沉淀，獲得上清液；取上清液在旋轉蒸發儀(O. 08MPa，60°C)中減壓濃縮至305 mL，加入體積濃度95%乙醇水溶液1084 mL使乙醇體積終濃度約為80 %，靜置6小時后，取上清液，將上清液在旋轉蒸發儀(O. 08 MPa,60°C)中減壓濃縮至300 mL，獲得浸膏，此時浸膏中乙醇體積含量約為4. 1% ;將浸膏加入蒸餾水配成650ml左右混合液，移入三口圓底瓶中，同時在圓底瓶中加入1.5 L乙酸乙酯，
O.18L異丙醇和2mL乙酸制成混合液，將混合液在70°C下攪拌萃取60分鐘后冷卻至40°C，置于分液漏斗中，靜置30分鐘進行分層，獲得上層萃取液和下層萃余液；上層萃取液在旋轉蒸發儀(O. 09MPa，55°C)上減壓濃縮至350ml，得竹葉黃酮粗提液。將竹葉黃酮粗提液按O. 02BV/min流速加入含有550ml聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)色譜柱U.ScmXSOcm)上進行吸附，上樣完后，用3.6BV蒸餾水進行洗脫，除去糖份和蛋白類成分，再用4. 5BV的75%乙醇洗脫黃酮類成分，回收這部分溶液，采用旋轉蒸發儀(O. 09MPa, 55°C )上減壓濃縮至含水量小于5%，得到竹葉黃酮提取物53 g。紫外分管光度法測得黃酮含量82. 5%，黃酮提取率31. 1%。
實施例3竹葉黃酮提取物對α -葡萄糖苷酶的抑制活性米用傳統的“Tremblay，，法(Chapdelaine P, Tremblay RR, Dube JY. P-Nitrophenol-alpha-D-glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activityin human semen. Clin Chem. 1978, 24(2): 208-211·),利用 α-葡萄糖苷酶催化水解對硝基苯基-a -D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，通過測定釋放出來的對硝基苯酚的量確定a -葡萄糖苷酶活性。以一定時間內反應體系中對硝基苯酚的含量變化來計算提取物的酶抑制活性。結果如下表I所示竹葉黃酮提取物在體外對a-葡萄糖苷酶具有一定抑制活性。表I竹葉黃酮提取物對a -葡萄糖苷酶的抑制活性
權利要求
1.一種具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于所述方法按如下步驟進行 (1)將新鮮竹葉清洗、烘干后粉碎并過20目篩，獲得竹葉粉末，將竹葉粉末與水以質量比1:7 10混合后，在室溫下攪拌浸泡廣3小時，然后升溫至8(T10(TC下加熱回流浸提O. 5 3h，冷卻至3(T50°C后過濾，獲得濾液，即竹葉水提物； (2)在步驟(I)獲得的竹葉水提物中攪拌加入絮凝劑，在室溫下靜置2 6小時，然后離心，棄去沉淀，獲得上清液a ;所述絮凝劑為海藻酸鈉、殼聚糖或羧甲基纖維素； (3)將步驟(2)獲得的上清液a減壓濃縮后加入乙醇水溶液使乙醇體積終濃度為7(Γ90%，靜置Γ12小時后，取上清液b減壓濃縮至濃縮物無乙醇味，獲得浸膏； (4)將步驟(3)獲得的浸膏加水配成混合液，再將混合液用萃取劑在5(T80°C條件下攪拌30 90分鐘進行萃取，萃取完全后冷卻至30 40°C，靜置分層，獲得上層萃取液和下層萃余液，將上層萃取液減壓濃縮至混合液體積的O. 3^0. 5倍，即得竹葉黃酮粗提液；所述萃取劑由有機溶劑A和有機溶劑B以體積比為1000:1飛混合組成，有機溶劑A為乙酸乙酯或乙酸乙酯與異丙醇以體積比5 9:1的混合溶液；有機溶劑B為乙酸； (5)將步驟(4)獲得竹葉黃酮粗提液進行柱層析，以體積濃度709Γ80%的乙醇水溶液為洗脫劑，收集含目標組分的洗脫液，將洗脫液減壓濃縮除去水，獲得竹葉黃酮提取物。
2.如權利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述絮凝劑以質量濃度O. Γ5%絮凝劑水溶液的形式加入。
3.如權利要求2所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述絮凝劑水溶液與竹葉水提物體積比為f5:1000。
4.如權利要求2所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述絮凝劑以質量濃度1%絮凝劑水溶液的形式加入，絮凝劑水溶液與竹葉水提物體積比為 2:1000。
5.如權利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于將步驟(2)獲得的上清液a體積減壓濃縮至步驟(I)獲得的竹葉水提物體積的l/2(Tl/30倍，力口入體積濃度95%乙醇水溶液使乙醇體積終濃度為7(Γ90%。
6.如權利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述混合液是將步驟(3)獲得的浸膏加水配成步驟(I)獲得的竹葉水提物體積的1/10 1/8 倍。
7.如權利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述萃取劑由有機溶劑A和有機溶劑B以體積比為1000:2混合組成，有機溶劑A為乙酸乙酯或乙酸乙酯與異丙醇以體積比8:1的混合液；有機溶劑B為乙酸。
8.如權利要求7所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述萃取劑的體積用量與混合液的體積比為2 5:1。
9.如權利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(5)中所述柱層析按如下步驟進行將步驟(4)獲得竹葉黃酮粗提液以O.0Γ O. 05BV/min速度加入裝有聚乙烯聚吡咯烷酮的層析柱，先用2 5BV的蒸餾水洗脫至流出液無色，再以3飛BV體積濃度70°/Γ80%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮除去水，獲得竹葉黃酮提取物。
10.如權利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中聚乙烯聚吡咯烷酮用量為竹葉粉末質量的1/2。
全文摘要
本發明公開了一種具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，所述方法是將新鮮竹葉預處理，用水提取獲得竹葉水提物，再將竹葉水提物經過絮凝劑沉淀、濃縮、萃取、層析步驟進行分離純化，最終獲得高含量的竹葉黃酮提取物；藥理實驗表明該竹葉黃酮提取物有一定的降血糖功效，效果與拜糖平相當。本發明的竹葉黃酮提物制備方法中使用的萃取劑為食品添加劑，安全性能好；聚乙烯聚吡咯烷酮是啤酒澄清劑，用于食品成分分離純化安全性好；本發明方法獲得的竹葉黃酮含量81-86 %，回收率為28.3-33%；本發明方法具有工藝簡單、操作方便、黃酮含量高、設備投資少、產品可用于普通食品中等優勢。
文檔編號A61P3/10GK103054038SQ20121059489
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者郭輝, 錢俊青, 高帥 申請人:浙江工業大學