專利名稱：一種海蛾提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及海洋生物醫藥領域，具體涉及一種海蛾提取物及其制備方法和應用。
技術背景
海蛾(Pegasus laternarius Cuvier)是一種近海生活的小魚，另丨」名海麻雀、海燕， 屬于海蛾魚目(Pegasiformes)、海蛾魚科(Pegasidae)。廣東沿海民間常以全魚干品為藥用，其全體具化痰止咳、宣肺透疹、壯陽補骨、消癭散結、燥濕止瀉等功效。發明內容
本發明的目的是提供一種具有較好的抗氧化功能的海蛾提取物及其制備方法和應用。
本發明的海蛾提取物是通過以下方法制備的，該方法包括以下步驟
(I)用甲醇浸泡、熱水煮沸或體積分數為50°/Γ80%的乙醇水溶液浸泡三種方法處理干燥海蛾，分別濃縮后得到海蛾總浸膏；
(2)將步驟(I)得到的海蛾總浸膏混懸于水中，得到海蛾總浸膏溶液，用6(T90°C 沸程的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對海蛾總浸膏溶液依次進行萃取，對乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物進行濃縮去除溶劑，得到的乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位即為海蛾提取物。
上述步驟(I)中所述的用體積分數為509Γ80%的乙醇水溶液浸泡優選用體積分數為75%的乙醇水溶液浸泡3次，每次浸泡24小時；所述的用甲醇浸泡，優選浸泡3次，每次浸泡24小時；所述的熱水煮沸,優選煮沸時間為3小時。
步驟(I)和(2)中的濃縮為本領域提取過程中常見的操作方法，優選都為減壓回收，其溫度控制在50°C以下。
上述步驟(2)所述的用6(T90°C沸程的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對海蛾總浸膏溶液依次進行萃取，每種有機溶劑與水的體積比優選為1:1，每種有機溶劑萃取次數為3次。
用DPPH自由基清除活性實驗、ABTS總抗氧化能力實驗、FRAP總抗氧化能力實驗對本發明的海蛾提取物進行檢測，發現本發明的海蛾提取物能夠明顯抑制DPPH、ABTS和 FRAP，說明本發明的海蛾提取物具有抗氧化能力。
因此，本發明還提供了上述海蛾提取物在制備抗氧化保健食品或藥物中的應用。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明的海蛾提取物具有較好的抗氧化功能，因此能用于制備抗氧化保健食品或藥物，并且其原料一海蛾是資源豐富的漁業副產品，成本低廉，因此本發明具有良好的應用前景。
圖I是體積分數75%乙醇水溶液制備的海蛾提取物的乙酸乙酯萃取部位的DPPH抑制率；圖2是體積分數75%乙醇水溶液制備的海蛾提取物的正丁醇萃取部位的DPPH抑制率；圖3是體積分數75%乙醇水溶液制備的海蛾提取物的乙酸乙酯萃取部位的ABTS抑制率；圖4是體積分數75%乙醇水溶液制備的海蛾提取物的正丁醇萃取部位的ABTS抑制率；圖5是體積分數75%乙醇水溶液制備的海蛾提取物的乙酸乙酯萃取部位的FRAP抑制率；
圖6是體積分數75%乙醇水溶液制備的海蛾提取物的正丁醇萃取部位的FRAP抑制率。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限制。 實施例I :利用體積分數為75%的乙醇水溶液制備海蛾提取物3. 5kg干燥海蛾剪碎后用市售食品級的體積分數為75%的乙醇水溶液浸泡3次，每次24小時，用旋轉蒸發儀減壓(溫度控制在50攝氏度以下)回收溶劑后得到海蛾總浸膏。將海蛾總浸膏混懸于水中，得到海蛾總浸膏溶液，用石油醚(6(T9(TC沸程)按照體積比I :1對海蛾總浸膏溶液萃取3次，取出石油醚(6(T9(TC沸程)相，剩下的水相用乙酸乙酯按照體積比I :1的比例萃取3次，取出乙酸乙酯相，剩下的水相用正丁醇按體積比I :1的比例萃取3次，取出正丁醇相；用旋轉蒸發儀減壓(溫度控制在50攝氏度以下)回收乙酸乙酯相和正丁醇相中的溶劑后，得到乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位，即本實施例的海蛾提取物。體積分數75%的乙醇水溶液制備的海蛾提取物的抗氧化活性實驗(I)、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位的DPPH自由基清除活性實驗將上述乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位添加到無水乙醇中配置各自的梯度溶液，使各自的梯度溶液的濃度分別為16mg/ml,8mg/ml,4mg/ml,2mg/ml和lmg/ml,兩種萃取部位溶液各設5個重復，將O. 5mg/ml DPPH無水乙醇溶液100 μ L分別加入100 μ L的乙酸乙酯萃取部位溶液和正丁醇萃取部位溶液后稍加震蕩，37°C進行反應，分別于反應30min、60min后在492nm波長下測定加入DPPH的兩個萃取部位溶液的吸光度值(Ap)，同時測定(Ac)與(Amax)。以O. 2mg/mL和O. lmg/mL的抗壞血酸(V。)為陽性對照，計算DPPH抑制率。按下述公試計算DPPH 抑制率=[I — (Ap — Ac) /AmaJ X 100%實驗結果如圖I和圖2所示。由圖I可以看出，乙酸乙酯萃取部位的DPPH抑制率與乙酸乙酯萃取部位溶液濃度及反應時間有關，乙酸乙酯萃取部位的DPPH抑制率隨乙酸乙酯萃取部位溶液濃度的增加而增大，并最終趨近于O. 800 ;反應60min下的8mg/ml與16mg/ml乙酸乙酯萃取部位溶液的DPPH抑制率與反應30min相近,而反應60min下的Img/ml、2mg/ml、4mg/ml乙酸乙酯萃取部位溶液的DPPH抑制率均高于30min。
由圖2可以看出，正丁醇萃取部位的DPPH抑制率與正丁醇萃取部位溶液的濃度及反應時間有關，DPPH抑制率隨正丁醇萃取部位溶液濃度的增加而增大，并最終趨于O. 800 ； 60min反應時間下16mg/ml正丁醇萃取部位溶液的DPPH抑制率與30min反應時間相近,而 60min反應時間下lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml正丁醇萃取部位溶液的DPPH抑制率均高于30min反應時間。
(2)乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位的ABTS總抗氧化能力實驗
將上述乙酸乙酯和正丁醇萃取部位分別添加到無水乙醇中配置各自的梯度溶液， 使各自的梯度溶液的濃度分別為I. 6mg/ml,0. 8mg/ml,0. 4mg/ml,0. 2mg/ml和0. lmg/ml,于 96孔酶標板每個檢測孔中加入20 μ L終濃度為O. 5mM的過氧化物酶工作液，然后在樣品檢測孔中分別加入10 μ L上述不同濃度的兩種萃取部位的溶液，在陰性對照孔中加入IOyL 無水乙醇，在標準曲線檢測孔中分別加入終濃度為O. 075，O. 060，O. 045，O. 030，O. 015和 O. 0075mM的10 μ L Trolox標準溶液，輕輕混勻；每個檢測孔內加入170 μ L終濃度為O. 5mM 的ABTS工作液，輕輕混勻；在空白對照孔中加入200μ L無水乙醇。于室溫孵育6，10，20， 45和60min后測定405nm處的吸光度值，樣品和Trolox的吸光度值為As，空白對照為Ac。 計算ABTS抑制率公式如下
ABTS 抑制率=[(Ac — As) /Aj X 100%
實驗結果如圖3和圖4所示。由圖3可以看出，乙酸乙酯萃取部位的ABTS抑制率與乙酸乙酯萃取部位溶液的濃度及反應時間有關，乙酸乙酯萃取部位的ABTS抑制率隨乙酸乙酯萃取部位溶液濃度的增加而增大，并隨反應時間的增加而增大。
由圖4可以看出，正丁醇萃取部位的ABTS抑制率與正丁醇萃取部位溶液的濃度及反應時間有關，正丁醇萃取部位的ABTS抑制率隨正丁醇萃取部位溶液濃度的增加而增大， 并隨反應時間的增加而增大。
(3)乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位的FRAP總抗氧化能力實驗
將乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位分別添加到無水乙醇中配置各自的梯度溶液，使各自的梯度溶液的濃度分別為O. 8648mg/ml，O. 4324mg/ml，O. 2162mg/ml， O. 108lmg/ml和0. 0541mg/ml，于96孔酶標板每個檢測孔中加入180 μ L終濃度為O. 5mM 的FRAP工作液，在樣品檢測孔中加入5μ L各種濃度乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位樣品，在陰性對照孔中加入5μ L無水乙醇，在標準曲線檢測孔中加入終濃度為O. 0405， O. 0324，O. 0243，O. 0162，O. 0081 和 O. 0041mM 的 5μ L Trolox 標準溶液，輕輕混勻。在空白對照孔中加入185 μ L無水乙醇，于37°C孵育5，10，20，45和60min后于630nm處測定吸光度值，樣品和Trolox的吸光度值為As，空白對照為A。。計算FRAP抑制率公式如下
FRAP 抑制率=[(A。一 As) /Aj X 100%
實驗結果如圖5和圖6所示。由圖5可以看出，乙酸乙酯萃取部位的FRAP抑制率與乙酸乙酯萃取部位溶液的濃度及反應時間有關，乙酸乙酯萃取部位的FRAP抑制率隨乙酸乙酯萃取部位溶液濃度的增加而增大，并隨反應時間的增加而增大。
由圖6可以看出，正丁醇萃取部位的FRAP抑制率與正丁醇萃取部位溶液的濃度及反應時間有關，正丁醇萃取部位的FRAP抑制率隨正丁醇萃取部位溶液濃度的增加而增大， 并隨反應時間的增加而增大。
實施例2 :利用體積分數為50%的乙醇水溶液制備海蛾提取物
本實施例與實施例I基本相同，只是用體積分數為50%的乙醇水溶液對剪碎后的干燥海蛾進行浸泡3次，每次24小時，其他步驟與實施例I相同，由此得到本實施例的海蛾提取物。體積分數50%的乙醇水溶液制備的海蛾總浸膏的抗氧化活性實驗本實施的抗氧化活性實驗步驟與實施例I的相同。體積分數75%的乙醇水溶液制備的海蛾提取物能夠明顯抑制DPPH、ABTS和FRAD，因此本實施例的海蛾提取物具有抗氧化功能。實施例3 :利用體積分數為80%的乙醇水溶液制備海蛾提取物本實施例與實施例I基本相同，只是用體積分數為80%的乙醇水溶液對剪碎后的干燥海蛾進行浸泡3次，每次24小時，其他步驟與實施例I相同，由此得到本實施例的海蛾 提取物。體積分數80%的乙醇水溶液制備的海蛾提取物的抗氧化活性實驗本實施的抗氧化活性實驗步驟與實施例I的相同。體積分數80%的乙醇水溶液制備的海蛾提取物能夠明顯抑制DPPH、ABTS和FRAD，因此本實施例的海蛾提取物具有抗氧化功能。實施例4 :利用甲醇制備海蛾提取物本實施例與實施例I基本相同，只是用甲醇對剪碎后的干燥海蛾進行浸泡3次，每次24小時，其他步驟與實施例I相同，由此得到本實施例的海蛾提取物。甲醇制備的海蛾提取物的抗氧化活性實驗本實施的抗氧化活性實驗步驟與實施例I的相同。甲醇制備的海蛾提取物能夠明顯抑制DPPH、ABTS和FRAD，因此本實施例的海蛾提取物具有抗氧化功能。實施例5 :利用熱水煮沸制備海蛾提取物本實施例與實施例I基本相同，只是用熱水煮沸剪碎后的干燥海蛾3小時，其他步驟與實施例I相同，由此得到本實施例的海蛾提取物。熱水煮沸制備的海蛾提取物的抗氧化活性實驗本實施的抗氧化活性實驗步驟與實施例I的相同。熱水煮沸制備的海蛾提取物能夠明顯抑制DPPH、ABTS和FRAD，因此本實施例的海蛾提取物具有抗氧化功能。
權利要求
1.一種海蛾提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)用甲醇浸泡、熱水煮沸或體積分數為509Γ80%的乙醇水溶液浸泡三種方法處理干燥海蛾，分別濃縮后得到海蛾總浸膏； (2)將步驟(I)得到的海蛾總浸膏混懸于水中，得到海蛾總浸膏溶液，用6(T90°C沸程的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對海蛾總浸膏溶液依次進行萃取，對乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物進行濃縮去除溶劑，得到的乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位即為海蛾提取物。
2.根據權利要求I所述的海蛾提取物的制備方法，其特征在于，所述的用體積分數為50°/Γ80%的乙醇水溶液浸泡，為用體積分數為75%的乙醇水溶液浸泡3次，每次浸泡24小時；所述的用甲醇浸泡，浸泡次數為3次，每次浸泡24小時；所述的熱水煮沸，煮沸時間為3小時。
3.根據權利要求I所述的海蛾提取物的制備方法，其特征在于，步驟(I)和(2)中所述的濃縮為減壓回收，其溫度控制在50°C以下。
4.根據權利要求I所述的海蛾提取物的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的用6(T90°C沸程的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對海蛾總浸膏溶液依次進行萃取，每種有機溶劑與水的體積比為1: 1，每種有機溶劑萃取次數為3次。
5.一種由權利要求I所述的制備方法制備的海蛾提取物。
6.權利要求5所述的海蛾提取物在制備抗氧化保健食品或藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種海蛾提取物及其制備方法和應用。通過體積分數為50%~80%的乙醇浸泡、甲醇浸泡或熱水煮沸三種方法處理干燥海蛾，減壓回收浸泡后的體積分數為50%~80%的乙醇水溶液、甲醇或水后得到海蛾總浸膏；將得到的海蛾總浸膏混懸于水中，得到海蛾總浸膏溶液，用60~90沸程的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對海蛾總浸膏溶液依次進行萃取，減壓回收萃取后的乙酸乙酯和正丁醇，得到的乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位即為海蛾提取物。本發明的海蛾提取物具有較好的抗氧化能力，可以應用于制備抗氧化保健食品或藥物。
文檔編號A61K35/56GK102973606SQ20121059482
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者周雪峰, 陳哲凡, 楊斌, 林秀萍, 劉娟, 劉永宏 申請人:中國科學院南海海洋研究所