專利名稱：一種生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種基于生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒及其制備方法和應用。
背景技術：
近年來，糖尿病的發病率及患病率正在呈逐年上升趨勢，糖尿病已成為世界范圍內的常見病和多發病,成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后,又一種危害人類健康的慢性疾病。在世界范圍內，仍然沒有可以根治糖尿病的有效藥。1999年世界衛生組織(WHO)和國際糖尿病聯盟(IDF)規定，根據病因、發病機制和臨床表現的不同，糖尿病主要分為由于胰島β細胞破壞造成胰島素絕對缺乏的I型糖尿病和由于胰島素抵抗造成胰島素相對缺乏的II型糖尿病。胰島素抵抗是指正常劑量的胰島素產生低于其生物學效應的一種病理學狀態，表現為胰島素促進外周組織(包括肌肉和脂肪組織)攝取和利用葡萄糖以及抑制肝糖輸出的效應減弱，是引起II型糖尿病發生的主要原因。 胰島素是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激動而分泌的一種蛋白質類激素。胰島素作為人體內重要的蛋白質類激素，是機體內唯一降低血糖的激素，對碳水化合物代謝的影響，是其最顯著的生物學作用。一方面胰島素通過在葡萄糖轉運過程中，增強磷酸化作用從而促進血循環中葡萄糖進入肝細胞、肌細胞、脂肪細胞及其他細胞合成糖原；另一方面胰島素通過抑制糖原分解和降低糖異生而抑制葡萄糖的產生，其共同后果是使血糖的濃度降低。自1922年胰島素在臨床上被用作治療糖尿病的藥物來，迄今為止仍然是控制糖尿病高血糖的首選藥物。通常，胰島素通過與細胞膜表面的胰島素受體結合，通過一系列蛋白質磷酸化-去磷酸化的過程，引起細胞內與代謝及生長有關的關鍵酶的激活從而發揮其對于糖代謝的調節作用，該過程可在數秒至數分鐘內完成，因此，外源注射胰島素的作用時間十分短暫。為了維持一定的療效需要大劑量反復用藥，長期的頻繁注射胰島素不僅增加了病人的痛苦而且易引發一系列副反應。事實上，除了這種短期作用，胰島素還具有持續時間更長的中、長期作用，包括調節氨基酸及離子的攝取，控制蛋白質的合成和降解、基因的轉錄，刺激細胞的生長和分化等作用。研究表明，胰島素這種中、長期作用可能與其在細胞內的作用密切相關，因此，可以將胰島素傳遞至細胞內來延長其生物調控作用，從而達到長期治療糖尿病的效果。目前，蛋白質的細胞內傳遞主要有三種方法，包括傳統的物理方法，例如微注射法、電穿孔法等；載體傳遞法，常用的載體主要有病毒、陽離子化合物、重組蛋白和無機納米顆粒等；另外，蛋白化學改性也是常用的方法。但是，這些方法修飾后的蛋白質通常存在生物相容性差、成本高、效率低等缺點。
發明內容
本發明提供了一種生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，可被細胞吞入，吞入率高且具有良好的生物相容性。一種生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，通過如下方法制備:向DMEM培養基中加入胰島素蛋白和可溶性鈣鹽，混合均勻后在含CO2環境下進行孵育，制得生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒；生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的粒徑為32 450nm，其中胰島素蛋白的質量分數為8 15%。DMEM培養基作為磷酸根離子來源，通過外加鈣離子后可在培養基中原位合成磷酸鈣顆粒，在此過程中，胰島素蛋白作為生物礦化的模板，為磷酸鈣的成核和晶體生長提供活性位點，胰島素蛋白與磷酸鈣形成復合結構，同時，由于CO2的存在，在生物礦化過程中，復合結構中會含有少量的碳酸根離子。碳酸根離子的含量影響顆粒的形貌，并且含有碳酸根的磷酸鈣具有更好的降解性，一般，碳酸根離子的質量分數為2 5%。優選的，生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的粒徑為18(T280nm。在該粒徑范圍內，胰島素蛋白納米顆粒的粒徑更容易被細胞吞入，并且對細胞傷害較小。所述DMEM培養基采用常規的市售產品即可。所述胰島素蛋白可以為人胰島素。加入胰島素蛋白時，一般先將其溶解，以溶液的形式加入到DMEM培養基中。 胰島素蛋白的濃度影響納米顆粒的形貌和結構，從而影響生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的生物學特性，一般，所述胰島素蛋白的終濃度為5飛5mg/L，優選的，所述胰島素蛋白的終濃度為2(T45mg/L，更優選為40mg/L。本發明中，所述胰島素蛋白的終濃度是指加入的胰島素蛋白在整個生物礦化反應體系中的濃度。可溶性鈣鹽可以提供游離的鈣離子，所述可溶性鈣鹽可以為氯化鈣、硝酸鈣等。鈣離子的濃度影響胰島素蛋白的生物礦化效率，加入可溶性鈣鹽后，鈣離子的終濃度為flOmmol/L，優選為2飛mmol/L。其中，鈣離子的終濃度是指加入可溶性鈣鹽后，鈣離子在整個生物礦化反應體系中的濃度。所述孵育的溫度為25 45°C，優選為3(T40°C，更優選為37°C。所述孵育的時間為0.5^4小時，優選為2 4小時，更優選為4小時。上述孵育條件有利于胰島素蛋白與磷酸鈣形成穩定的復合結構。為將生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒從DMHM培養基中分離，可將孵育后的DMEM培養基在離心力為8000g的轉速下離心lOmin。本發明還提供了所述生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒在制備降糖藥物中的應用。該生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒處理細胞后，細胞中與胰島素作用相關的蛋白表達水平升高，細胞的糖代謝能力提高，并且對細胞無毒，因此可將其應用于降糖藥物的制備。本發明還提供了一種生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的制備方法，包括:向DMEM培養基中加入胰島素蛋白和可溶性鈣鹽，混合均勻后在含CO2環境下進行孵育，制得生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒。與現有技術相比，本發明的有益效果為:本發明生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒可被細胞吞入，且吞入效率高，同時對細胞無毒害，具有良好的生物相容性。另外，該生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的制備方法簡單易操作，且成本廉價，可批量制備。
圖1為生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒(BIP)的形貌表征；其中，A為礦化前與礦化后胰島素的高糖DEME溶液的數碼照片，B 為 BIP 的 TEM 圖片，C 為 BIP 的 SEM 圖片，D為BIP的粒徑分布曲線；圖2a為生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的XRD圖譜；圖2b為生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的FTIR曲線；圖2cl為生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的TGA/DSC曲線；圖2c2為磷酸鈣的TGA/DSC曲線；圖2c3為胰島素的TGA/DSC曲線；圖3為BCA試劑盒測定的蛋白標準曲線；圖4a為不同 濃度鈣離子對胰島素抵抗Hep_G2細胞活性的影響關系圖；圖4b為不同濃度胰島素對胰島素抵抗Hep_G2細胞活性的影響關系圖；圖4c為不同濃度BIP對胰島素抵抗H印-G2細胞活性的影響關系圖；圖5為不同處理下胰島素抵抗H印-G2細胞的顯微鏡照片；其中，A為未礦化的胰島素處理胰島素抵抗Hep_G2細胞后的熒光顯微鏡照片，B為BIP處理胰島素抵抗!fep-G2細胞后的熒光顯微鏡照片，C為BIP處理胰島素抵抗!fep-G2細胞后的共聚焦顯微鏡照片；圖6為BIP處理胰島素抵抗!fep-G2細胞后的生物切片透射圖片；圖7a為不同處理下H印-G2細胞的糖代謝能力圖；圖7b為不同處理下胰島素抵抗Hep_G2細胞后IRS-1和IRS-2的mRNA表達圖；圖7c為不同處理下胰島素抵抗ifep-G2細胞后Glut-2和Glut_4的mRNA表達圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡釋本發明高糖DMEM培養基購買自美國Invitrogen公司，胎牛血清購買自美國Sigma-Aldrich公司，人胰島素由徐州萬邦金橋制藥有限公司惠贈。實施例1生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒(BIP)的制備與表征人胰島素蛋白用Tris-HCl (1.0mol/L, pH7.4)配制,濃度為 5mg/mL ；氯化鈣用三蒸水配制，終濃度為1.0mmol/L。依次向ImL高糖DMEM培養基中加入8 μ L5mg/mL的人胰島素蛋白溶液和5 μ Llmmol/L氯化鈣溶液，震蕩混合均勻后，將上述溶液在37°C，5%C02的細胞培養箱中培養4h,于8000g轉速離心IOmin,分離得到生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒。將得到的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒通過SEM (掃描電子顯微鏡)、TEM (透射電子顯微鏡)、DLS (動態光散射)和TGA/DSC (熱重/差示掃描量熱分析)、XRD (X射線衍射)和FTIR (傅里葉紅外)等技術手段對顆粒進行表征。從拍攝的礦化前和礦化后胰島素蛋白的高糖DMEM溶液的數碼照片可以看出，礦化并不影響溶液的外觀，反映出所形成的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒尺寸較小，且分散均一,見圖1中A。由圖1中B和C可知，生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒呈球形，對生物礦化的胰島素納米顆粒的粒徑進行統計分析，由圖1中D可知，BIP的粒徑分布在32 450nm，且在18(T280nm粒徑范圍占較大比重。由圖2a可知，所制備的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒中磷酸鈣為無定形相；由圖2b可知，胰島素經生物礦化后既有磷酸鈣的吸收峰，又包含胰島素的吸收峰，說明生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒為磷酸鈣與胰島素的復合物。由圖2cl、2c2和2c3可知，生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒在200° C至500° C間出現一個特征的放熱峰，而純胰島素和純磷酸鈣在該溫度范圍并沒有該峰，說明BIP中胰島素與磷酸鈣并不是簡單的結合，而是形成了一個有機-無機的復合結構。同時，由TGA曲線可知，BIP中胰島素所占的質量百分含量約為8%。胰島素的礦化率通過BCA試劑盒進行檢測，由BSA蛋白標準得到標準曲線后，分別測定未礦化蛋白溶液和礦化后蛋白溶液中胰島素蛋白濃度，礦化率定義為，
權利要求
1.一種生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，通過如下方法制備:向DMEM培養基中加入胰島素蛋白和可溶性鈣鹽，混合均勻后在含CO2環境下進行孵育，制得生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒；生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的粒徑為32 450nm，其中胰島素蛋白的質量分數為8 15%。
2.如權利要求1所述的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，其特征在于，所述胰島素蛋白為人胰島素。
3.如權利要求1所述的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，其特征在于，所述胰島素蛋白的終濃度為5 55mg/L。
4.如權利要求1所述的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，其特征在于，加入可溶性鈣鹽后，鈣離子的終濃度為f 10mmol/L。
5.如權利要求1所述的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，其特征在于，所述可溶性鈣鹽為氯化鈣或硝酸鈣。
6.如權利要求1所述的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，其特征在于，所述孵育的溫度為25 45°C。
7.如權利要求1所述的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒，其特征在于，所述孵育的時間為0.5^4小時。
8.如權利要求1所述的生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒在制備降糖藥物中的應用。
9.一種生物礦化 的胰島素蛋白納米顆粒的制備方法，包括:向DMHM培養基中加入胰島素蛋白和可溶性鈣鹽，混合均勻后在含CO2環境下進行孵育，制得生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒。
全文摘要
本發明公開了一種生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒及其制備方法和應用，該生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒通過如下方法制備向DMEM培養基中加入胰島素蛋白和可溶性鈣鹽，混合均勻后在含CO2環境下進行孵育，制得生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒；生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的粒徑為32~450nm，其中胰島素蛋白的質量分數為8%~15%。本發明還提供了所述生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的制備方法及其在制備降糖藥物中的應用。本發明生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒可被細胞吞入，且吞入效率高，同時對細胞無毒害，具有良好的生物相容性。另外，本發明中生物礦化的胰島素蛋白納米顆粒的制備方法簡單易操作，成本廉價，可批量制備。
文檔編號A61K38/28GK103073645SQ201210594708
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者肖云, 唐睿康 申請人:浙江大學