Dna-殼聚糖復合納米顆粒、其制備及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種DNA-殼聚糖復合納米顆粒，為殼聚糖增溶衍生物包裹的含有AS3短發夾序列的重組質粒，所述AS3短發夾序列為通過環狀序列連接的、與IL-10基因的siRNA對應的DNA序列。本發明還公開了該納米顆粒的制備方法，以及其作為免疫佐劑的應用。本發明的納米顆粒免疫佐劑顆粒均勻性好；可引發細胞免疫刺激；細胞毒性小；可快速有效地抑制細胞因子的表達，進而實現輔助增強疫苗效力的佐劑作用；而且由于使用殼聚糖納米包裹技術，在細胞中具有緩釋效應，并能組織細胞內的核酸內切酶降解DNA。
【專利說明】DNA-殼聚糖復合納米顆粒、其制備及應用
【【技術領域】】
[0001]本發明涉及新型免疫佐劑，具體涉及一種DNA-殼聚糖復合納米顆粒、其制備方法，及作為免疫佐劑應用。
【【背景技術】】
[0002]目前不斷開發出的新型疫苗具有良好的抗原特異性和低毒性，但疫苗免疫原性較差。盡管已成功制備得到很有希望的抗原，卻并不能誘導出足夠強的預防作用。例如，可溶性純化蛋白質疫苗或蛋白質亞單位疫苗的免疫激活作用通常較弱，不足以刺激機體產生足夠抗體；單獨應用時所需抗原量較多，機體產生的抗體量較少；且還易引起免疫耐受。但這些疫苗在與較匹配佐劑連用時，以上缺點就會有所改善。因此開發安全有效的免疫佐劑來輔助增強疫苗效力，對于更多新型疫苗在臨床上的成功應用具有重要意義。
[0003]佐劑的作用方式多種多樣，人們對其與免疫系統間相互作用的知識也正在逐漸豐富，并已經成為現代免疫學的重要組成部分。分別從事佐劑研究，對于深入理解佐劑作用機理和機體免疫調節方式很有意義。
[0004]免疫佐劑可輔佐免疫原刺激機體產生較早、較強、持久的免疫應答。理想的免疫佐劑應該能滿足以下條件:(1)在有效劑量內無毒或毒性極小；(2)能刺激機體產生強大的體液免疫和/或細胞免疫應答；(3)具有持久的免疫力；(4)不誘導自身免疫；(5)無致突變、致癌、致畸形作用等。雖然現在已有許多佐劑應用于動物，但還沒有哪一種佐劑能完全滿足以上要求。
[0005]近年來，隨著第2、3代疫苗的迅速發展，特別是多肽疫苗呈現出的極大發展空間，促使免疫佐劑也有了長足的進步。
[0006]目前通過FDA批準的能用于人的佐劑鋁膠佐劑存在兩方面主要缺點:其一，只能激發機體產生體液免疫,不能誘導細胞免疫。而細胞免疫對機體細胞內寄生病原體(病毒、原蟲等)及腫瘤免疫力的產生尤為必要。其二，鋁膠佐劑對人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、單純皰疹病毒(HSV)、流感病毒，以及血吸蟲病、百日咳和傷寒等抗原沒有免疫佐劑性效果。因此已遠遠不能滿足新型疫苗發展的要求。
[0007]納米技術是一門具有廣闊前景的新興技術，納米技術與免疫技術相結合的產物-納米佐劑已成為了當前疫苗研究的熱點。從免疫學觀點來看，納米佐劑均勻性好，包裹或吸附的抗原顆粒正是巨噬細胞(M5)和樹突狀細胞(DC)的首選吞噬目標，這為實現機體有效的免疫反應完成了重要的一步。而且納米佐劑與多肽抗原或DNA疫苗連接后，可以避免常規佐劑載體效應的發生，起到保護抗原的作用。
【
【發明內容】
】
[0008]本發明旨在克服現有技術的以上缺陷，提供新型DNA-殼聚糖復合納米顆粒的免疫佐劑。
[0009] 具體地，本發明一方面提供一種DNA-殼聚糖復合納米顆粒，為殼聚糖增溶衍生物包裹的含有AS3短發夾序列的重組質粒，所述AS3短發夾序列為通過環狀序列連接的SEQN0.1所示序列與其互補序列。
[0010]所述殼聚糖增溶衍生物可以為殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物。
[0011 ] 所述環狀序列可以為TCAAGAG序列。
[0012]所述重組質粒的大小可以為4610bp。
[0013]所述納米顆粒的粒徑可以為35_50nm。
[0014]所述殼聚糖增溶衍生物與所述重組質粒的的包被比例為摩爾比20:1。
[0015]本發明另一方面提供用于制備該納米顆粒的方法，包括以下步驟:
[0016]SI合成AS短發夾序列，并退火；
[0017]S2將經退火的AS短發夾序列與雙酶切線性質粒、DNA連接酶在連接緩沖液中混合，轉化感受態大腸桿菌，接種于含氨芐抗性的LB培養基，做抗性篩查，選取抗性菌落，得到重組質粒溶液；以及
[0018]S3將殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質粒溶液混合，得到DNA-殼聚糖復合納米顆粒溶液。
[0019]步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液的pH可以為5.5。
[0020]步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質粒溶液在混合前，可以分別于65°C恒溫5分鐘。
[0021]本發明再一方面提供該納米顆粒作為免疫佐劑的應用。
[0022]本發明的納米顆粒免疫佐劑均勻性好；可誘導細胞免疫；細胞毒性小；可快速有效地降低細胞因子的表達；通過納米顆粒包括技術，在細胞中具有緩釋效應，且能保護DNA免于被細胞內核酸內切酶降解。
【【專利附圖】
【附圖說明】】
[0023]圖1示出根據本發明實施例的重組質粒的凝膠電泳檢測結果。
[0024]圖2為根據本發明實施例的納米顆粒的掃描電鏡圖像。
[0025]圖3示出根據本發明實施例的納米顆粒的凝膠阻滯電泳檢測結果。
[0026]圖4示出本發明的納米顆粒在降低細胞因子表達上的作用。
【【具體實施方式】】
[0027]IL-10最初發現是鼠的Th2細胞分泌的一種獨特的細胞因子，后來發現B細胞、單核/巨噬細胞、角化細胞和多種腫瘤細胞以及人的Thl細胞均可分泌IL-10。
[0028]IL-10具有很強的抗炎及免疫抑制活性，它能抑制IL-2、IFN-C及促炎因子的產生和釋放；可減少免疫受體MHC 0的表面表達；能抑制人的Th2細胞，導致細胞增生和細胞因子的產生減少。
[0029]IL-10具有多種抑制功能，例如抑制單核細胞依賴性Th細胞增生；抑制Thl類淋巴因子的合成及其活性；抑制單核細胞表面MHCb類分子表達，降低單核細胞的抗原提呈能力，阻斷抗原特異性單核/巨噬細胞因子的產生；抑制NK細胞的活性，IL-10并不直接作用于NK細胞，而是通過抑制IFN-C的產生間接發揮作用。IFN-C對NK細胞增殖活化具有正向調節作用。1/4抑制T細胞的凋亡，從外周血單核細胞中分離出的T細胞，如在培養液中加Λ IL-1O可減少T細胞的凋亡。抑制反應性氮氧化物的產生，反應性氮氧化物對細胞內代謝產物及細胞內外寄生物的清除有重要意義。
[0030]IL-10具有很強的免疫刺激作用，包括:促進非單核細胞依賴性T細胞的增殖、成熟。在IL-3、IL-4存在的條件下，刺激肥大細胞及其祖細胞的增殖，增強肥大細胞的活力。刺激抗原特異性B細胞增殖，并分化為漿細胞。
[0031]因此如果通過RNAi技術沉默IL-10的表達，使其抑制性調控功能暫時消失，則機體免疫性能將大幅提升，這可以通過檢測炎癥相關細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-gamma的表達水平進行驗證，如果IL-10被有效干擾，這些炎癥相關細胞因子的表達量會短暫性大量上調，在免疫期增強炎癥反應。
[0032]基于此，本發明人設計了一種包含有AS3短發夾序列的重組質粒，該AS3短發夾序列為通過環狀序列連接的SEQ N0.1所示序列與其互補序列。
[0033]AS3短發夾序列的設計
[0034]通過GeneBank獲得人IL-10基因序列，針對其編碼區設計了一個RNAi靶位。在互補的siRNA之間引入一個環狀結構序列，該環狀序列可以為，例如TCAAGAG。在shRNA5’端和3’端分別引入BamH I和Hind III酶切位點，反義片段以后接終止信號TTTTT，以終止轉錄。如此，形成了 BamH I+正義鏈+環鏈+反義鏈+終止信號+Hind III的結構。
[0035]化學合成所設計的ShRNA的反義DNA序列，即本發明的AS3序列。作為對照，本發明人還使用相同的環狀序列TCAAGAG，連接SEQ N0.2所示序列，合成了對照序列(對照)。
[0036]為了形成穩定的DNA雙鏈，將合成得到的DNA序列進行退火。用滅菌三蒸水分別溶解合成AS3片段(正義鏈與反義鏈)溶解，終濃度為lOumol/L。并按以下條件完成退火:正義鏈2uL、反義鏈2uL、10x退火緩沖液2ul，加三蒸水到總體積為20uL，于80°C水浴2分鐘，緩慢冷卻至室溫(16°C )，完成退火。
[0037]重鉬質粒
[0038]制各:
[0039]為獲得重組質粒，本發明人使用了 pSilencer3.1-Hlhygro載體來構建PS-AS3-1L10表達載體。
[0040]首先，利用pSilencer3.1-Hlhygro,獲得線形質粒:按照 pSilencer3.1-Hlhygro載體說明書，制備質粒溶液lug/uL ;轉化感受態大腸桿菌DH5 α ;接種于氨節青霉素(ampcillin)的LB固體培養基；抗性篩選提取質粒pSilencer3.1-Hl ;通過BamH I和HindIII雙酶切；膠回收酶切產物，獲得線性目的質粒20uL (16ug/uL)。
[0041]之后，連接線性目的質粒與經退火的DNA片段。雙酶切線性質粒pSilencer3.l-H14uL、經退火 AS3 序列 luL、T4DNA 連接酶 2uL、10 倍連接緩沖液(ligationbuffer) 2uL，加滅菌三蒸水至總體積為20uL，于16°C水浴12小時，之后置于65°C水浴10分鐘。轉化感受態大腸桿菌，接種于含氨芐抗性的LB培養基，做抗性篩選，選取抗性菌落。獲得重組質粒(PS-AS3)。
[0042]使用對照DNA序列，以相同的方法，指標得到對照質粒(pS-對照)。
[0043]表征:
[0044] 抗性篩選后取抗性菌落，在重組質粒的插入位點上下游設計引物菌落做菌落PCR鑒定擴增片段長度是否為插入片段長度，引物為:3.lsq-F:TCTTTGGATTTGGGAATCTTAT, 3.1sq-R:ACACAGGAAACAGCTATGA。將PCR產物片段大小合適的菌落送Invitrogen公司測序，進一步鑒定重組質量的正確性。
[0045]菌落PCR產物電泳檢測后條帶大小為插入片段大小，Invitrogen公司測序結果顯示shRNA表達片段正確的插入到pSilencer3.1-Hl載體中。
[0046]圖1示出該重組質粒的凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠)檢測結果。重組質粒制備后電泳條帶顯示片段大小大約為5000bp，條帶亮度較高，符合預期。
[0047]納米顆粒
[0048]進一步，本發明人將該重組質粒與納米技術相結合，利用殼聚糖增溶衍生物包裹重組質粒，以形成納米顆粒。
[0049]殼聚糖是自然界中迄今發現的唯--種陽離子多糖，在水溶液中電離為陽離子。
如此形成的帶極性陽離子納米顆粒，便于吸附到帶有負電荷的細胞膜上，促進細胞的胞吞作用。這樣就可以使殼聚糖納米顆粒包裝的分子藥物便于被細胞吸收。且殼聚糖的生物相容性非常好，用其制備的納米顆粒對細胞毒性非常低，其本身就可以作為一種免疫增強劑使用，故用其包裝可抑制IL-1O表達的DNA分子藥物將是一種非常好的免疫增強劑，即疫苗佐劑。
[0050]然而，殼聚糖因水溶性較差，在生物體中的使用也有一定的局限性。本發明使用經改性的殼聚糖增溶衍生物，例如殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物(CS-N-PE1-PEG)，大大提高了殼聚糖的水溶性。其帶有的陽離子電荷增加，使其轉染效率大大提高。
[0051]此外，由于這樣的殼聚糖衍生物的分子構象更加復雜，用其制備得到的納米顆粒在包裝DNA后會使包裝后的納米顆粒分子組裝更加緊密，在細胞中能夠更加有效地抵御細胞DNA酶對外來DNA的剪切，起到對IL-1O干擾分子的緩釋作用。
[0052]制各:
[0053]本發明中，使用離子交聯法來制備殼聚糖增溶衍生物包裹的重組質粒。將殼聚糖增溶衍生物CS-N-PE1-PEG (殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物，參考《聚乙二醇-殼聚糖-聚乙烯亞胺共聚物的制備及其基因傳遞系統性能的研究》-中山大學博士學位論文張未，潘仕榮等，20080420，制備得到)的溶液(pH5.5)，重組質粒溶液，分別于65°C水浴恒溫5分鐘。然后將二者均勻混合10分鐘，得到殼聚糖增溶衍生物包裹重組質粒的納米顆粒，即本發明的DNA-殼聚糖復合納米顆粒(CNP-pS-AS3)。
[0054]使用對照DNA序列，以相同的方法，獲得對照納米顆粒(CNP-pS-對照)。
[0055]表征:
[0056]1.納米顆粒的形態、粒徑及Zeta電位測定
[0057]取少量質粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用ZetasizerfOOOHS/IHPL納米粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位。
[0058]電鏡照片示于圖2中，圖中的電鏡觀察結果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形，且均勻性較好。
[0059]納米粒度分析儀測定結果如下表1所示:
[0060]表1納米顆粒的粒徑和Zeta電位
[0061]
【權利要求】
1.一種DNA-殼聚糖復合納米顆粒，為殼聚糖增溶衍生物包裹的含有AS3短發夾序列的重組質粒，所述AS3短發夾序列為通過環狀序列連接的SEQ N0.1所示序列與其互補序列。
2.根據權利要求1所述的 納米顆粒，其特征在于，所述殼聚糖增溶衍生物為殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物。
3.根據權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述環狀序列為TCAAGAG序列。
4.根據權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述重組質粒的大小為4610bp。
5.根據權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為35-50nm。
6.根據權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述殼聚糖增溶衍生物與所述重組質粒的包被比例為摩爾比20:1。
7.用于制備權利要求1-6中任一項所述的納米顆粒的方法，包括以下步驟: SI合成AS3短發夾序列，并退火； S2將經退火的AS3短發夾序列與雙酶切線性質粒、DNA連接酶在連接緩沖液中混合，轉化感受態大腸桿菌，接種于含氨芐抗性的LB培養基，做抗性篩查，選取抗性菌落，得到重組質粒溶液；以及 S3將殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質粒溶液混合，得到DNA-殼聚糖復合納米顆粒溶液。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液的pH為5.5o
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質粒溶液在混合前，分別于65°C恒溫5分鐘。
10.權利要求1-6中任一項所述的納米顆粒作為免疫佐劑的應用。
【文檔編號】A61P37/02GK103893757SQ201210576548
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優先權日:2012年12月26日
【發明者】萬曉春, 田永帥, 蔡林濤, 馬軼凡 申請人:深圳先進技術研究院