專利名稱：miRNA-361及其反義核苷酸的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種內源性的非編碼小RNAs的新藥用途，具體涉及一種miRNA-361及其反義核苷酸的用途，尤其涉及一種miRNA-361及其反義核苷酸在制備用于診斷、防治心臟疾病的藥物中的用途，屬于心臟疾病的診斷、預防和治療領域。
背景技術：
心血管疾病是人類健康和生命的主要威脅，是人類健康的頭號殺手，全世界范圍內每年有一千七百萬人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。在我國， 隨著人民生活水平日益提高和飲食結構的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢，已超過癌癥成為第一大致死原因。根據國家衛生部2004年底公布的最新統計結果表明，我國18 歲及以上居民高血壓患病率為18. 8%，估計全國患病人數I. 6億多，由此造成的心肌肥厚、 心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相關心臟疾病的病人達幾千萬。目前關于心臟疾病發病機理尚不完全清楚，心臟疾病的預防、診斷和治療尚不能達到讓人滿意的效果，急需開發新的技術、方法用于心臟病的診斷、防治。
miRNA是新近研究發現的一類內源性非編碼小RNA分子，許多研究表明miRNA對于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表達與許多心臟疾病的發生相關。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點，開發相關藥物具有潛在的臨床應用價值。 單一的miRNA可以同時作用于多個祀基因的mRNA的表達,這樣藥物作用于一個miRNA可以調節多個參與心臟發病基因的表達，影響多個信號通路，從整體上達到治療疾病的目的。由于miRNA在心臟病理狀態下表達水平不同，因此可以通過檢測miRNA的表達水平來預測診斷疾病。
細胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細胞死亡，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束生命的過程。它是一個主動的、高度有序的、由基因控制及一系列酶參與的過程，對正常胚胎發育，維持細胞群體及惡性病變過程中均起重要作用，在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵的角色。在許多心肌損傷或心臟病理狀態下， 如心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心力衰竭等，心肌細胞會發生凋亡。由于成熟的心肌細胞不能分裂增殖，心肌細胞過度凋亡必然會使心肌細胞數目減少，這一點可能是一些心臟疾病發病的機理。
目前研究發現許多miRNA通過調控凋亡相關靶蛋白的表達參與細胞凋亡的發生， 這些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。尋找心臟中特異表達的、參與心肌細胞凋亡的 miRNA,闡明其作用機理，對于開發以miRNA為策略的心臟疾病的診斷、治療具有及其重要的意義和應用前景。發明內容
本發明的目的是確定或發現調控心肌細胞凋亡的心臟特異性性表達的miRNA，進一步確定其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病中的關鍵作用，將其應用到這些心臟疾病的診斷、防治中。
除非特別指明，本文中的“miR-361”均指“miRNA-361”，其序列為下述SEQ ID NO: I 所示的核苷酸序列
5 ‘-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3，。
除非特別指明，本文中的“I/R”均指“心肌缺血/再灌注”。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的。
一方面，本發明提供了一種單鏈非編碼miRNA-361反義核苷酸在制備用于預防或治療心臟疾病的藥物中的用途，所述miRNA-361反義核苷酸的序列為下述SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列5’ -GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’。
優選地，所述miRNA-361反義核苷酸的核苷酸序列在每個堿基均進行了 2’ -甲氧基修飾。
優選地，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌肥厚和心肌纖維化中的中的一種或多種。
還一方面，本發明還提供了一種用于預防或治療心臟疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含有效劑量的上述本發明所述的miRNA-361反義核苷酸和藥學上可接受的載體、病毒或輔料。
優選地，所述載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒中的一種或多種。
優選地，所述藥物組合物的給藥方式選自口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內注射或直接心肌注射。
另一方面，本發明還提供了一種單鏈非編碼miRNA-361核苷酸在制備用于診斷或預后心臟疾病的藥物組合物中的用途，其中，以所述miRNA-361核苷酸序列作為靶點或檢測對象，所述miRNA-361核苷酸的序列為下述SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列 5 ‘-UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3’。優選地，所述的心臟疾病包括心肌梗死、心肌缺血損傷、 心肌肥厚和心肌纖維化中的中的一種或多種。
本發明還提供了一種診斷或預后心臟疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含有效劑量的本發明上述所述的miRNA-361核苷酸和藥學上可接受的載體、病毒或輔料。
優選地，所述載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒中的一種或多種。
本發明人通過實驗發現miRNA-361在心肌缺血損傷及缺氧誘導的心肌細胞凋亡過程中miRNA-361表達顯著上調。通過轉染和注射miRNA-361反義核苷酸抑制miRNA-361 的表達可以抑制心肌細胞凋亡及心肌缺血損傷，心肌梗死面積減少。
以上實驗說明miRNA-361反義核苷酸通過抑制心肌細胞凋亡對心臟具有保護作用，miRNA-361反義核苷酸對許多心臟疾病具有潛在的預防和治療價值。而升高miRNA-361 的表達則可以誘導心肌細胞凋亡，心肌缺血損傷會更加嚴重。
具體的，本發明人發現miRNA-361 反義核苷酸(5’ -GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3’ ) 通過抑制心肌細胞凋亡對心臟具有保護作用。在心肌細胞缺氧或心肌缺血損傷過程中， miRNA-361表達顯著上調，miRNA-361的上調可能誘導了心肌細胞凋亡的發生。miRNA-361 在缺血再灌注動物模型的心肌組織中表達上調；抑制小鼠的內源性的miRNA-361，可以抵抗心肌缺血再灌注損傷，使心肌梗死面積減少，心功能顯著改善。將miRNA-361反義核苷4酸與適當的載體結合形成藥物，導入心臟或體內，對許多心臟疾病將具有預防及治療作用。 可以考慮將miRNA-361反義核苷酸與殼聚糖、膽固醇、脂質體、納米顆粒等組合形成藥物分子，通過口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內注射或直接心肌注射的方式，用于防治心臟疾病、改善心臟功能、阻止心肌纖維化及心肌重構的發生。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中
圖I示出了實施例I中心肌缺血損傷及低氧誘導的心肌細胞凋亡過程中 miRNA-361表達水平的變化，其中A示出了原代心肌細胞缺氧處理miRNA-361表達水平， 其中，縱坐標表示以未處理的原代心肌細胞為基準，在缺血處理過程中原代心肌細胞中 miRNA-361的表達水平；B示出了小鼠心肌缺血miRNA-361表達水平；
圖2示出了實施例2中抑制內源性的miRNA-361對心肌細胞凋亡的抵抗作用，其中，A示出了原代心肌細胞轉染miRNA-361反義核苷酸抑制內源性的miRNA-361的表達情況示出了 miRNA-361反義核苷酸對缺氧誘導的心肌細胞凋亡的影響；
圖3示出了實施例3中miRNA-361反義核苷酸對心肌缺血損傷的抵抗作用，其中， A和B分別示出了小鼠心肌注射miRNA-361反義核苷酸后實施心肌缺血再灌注手術，檢測 miRNA-361反義核苷酸對心肌梗死面積及心肌凋亡的影響；
圖4示出了實施例4中小鼠靜脈注射miRNA-361 antagomir抑制內源性 miRNA-361后缺血再灌注后24小時與對照組相比的心功能狀況，其中的A、B和C分別示出了對左室舒張末內徑(LVIDd)、左室收縮末內徑(LVIDs)和短軸截短率(FS)的指標檢測情況；
在以上附圖中，為簡便起見，361反義核苷酸表示miRNA-361反義核苷酸。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。
除非特別指明，以下實施例中采用的小鼠和大鼠乳鼠購自北京醫科大學，其中，小鼠品系為C57小鼠，大鼠品系為Wistar大鼠。
除非特別指明，以下實施例中所用的試驗方法均為本領域中所用的常規方法。
除非特別指明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規渠道商購獲得。
實施例I心肌細胞缺氧及心肌缺血誘導的心肌細胞凋亡過程中miRNA-361表達情況檢測
在該實施例中，采用本實驗室已建立的方法培養大鼠乳鼠原代心肌細胞，用以進行心肌細胞凋亡實驗模型的構建，制備大鼠乳鼠原代心肌細胞的具體步驟參見文獻: W. -Q. Tan,Kun Wang, et al.，Foxo3a InhibitsCardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase. J Biol Chem. 2008 October 31;283 (44):29730-29739。
利用大鼠乳鼠原代心肌細胞建立心肌缺氧模型，具體為，在低氧培養箱中(氧濃度低于1%)對大鼠乳鼠原代心肌細胞進行培養，培養規模為IOcm培養皿，每個培養皿的細胞量約為IX IO6個，培養時間持續0、1、2、3、4小時。隨培養時間的不同來提取RNA，并利用實時熒光定量PCR技術檢測miRNA-361的表達水平，其具體操作參見文獻W. -Q. Tan, Kunffang, et al. , Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy throughTransactivating Catalase. J Biol Chem. 2008 October 31;283 (44):29730-29739。
具體為，PCR擴增 miRNA-361 編碼序列(GAAGCTTATCAGAATCTCCAGGGGTACT TATTATTTGAAAAGTCCCCCAGGTGTGATTCTGATTCGTTTC, SEQ ID NO:3)及其上下游兩端各將近200個bp的序列，擴增片段約562bp,具體為(ΤΓ「(ΚΠΤ 'Α('Α(;Α(Κ ΤΤ(;(' T TAGGCCTATTGCCTCAGTACTTCAGGGCAAGAATGAGGCTAACAGGTGAGTCATGTTACCATCTACCAGAC TGCCAGAACTGGGCCTAAATAATAGTCACCTCCCTGTGTTCAGATGTGCGTCATTTCTCTCAGTCTGGAG CCCTTTACTTTTCTCACACAACATAGAGATGCAGCAGTAGCAGAGGCTTCACTATGATTCTTTCTTGGGA CTCG GAAGCTTATCAGAATCTCCAGGGGTACTTATTATTTGAAAAGTCCCC CAGGTGTGATTCTGATTCGTTTC CCTCTCCTGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCCTTGGAAATCAGTTTC ATCTGAAGCTTCTGCATAAACAGGCACATTCATTAGCATCTTATCCTGCATAGTTGAGCTTGCATTATTTACTCTCT GCGTTATCTTCATTAATTCTTTCTAATGCTGAAACACCTGAAATCAGTGTCTGCCGGTCACCAAAGGATCTCTATTA GACTTTGGAAGCAAACAAAGCAGCAAAGACTTCATA AAC TI GA (77 GAA GiK 'TAGCiT (SEQ IDNO: 4，其中加黑并帶下劃線標記為miRNA-361的編碼序列；其余的為它的上下游序列，斜體帶下劃線標記的為上下游引物序列，
PCR 體系 50ul，PCR 條件如下95。C 3min 一個循環；95。C 30sec，56。C30sec, 72。C Imin共28個循環；最后72。C延伸5min，PCR引物設計如下
上游引物5，-CCTTGGTTTACAGAGCTTTGC-3’(SEQID NO:5);
下游引物5，-ACCTAGCCTTCAAGTCAAGTT-3’(SEQID N0:6)。
檢測到的miRNA-361表達水平如圖IA所示，在低氧處理4h_8h的區間內， miRNA-361的表達顯著上調。
本實施例采用結扎大鼠冠狀動脈建立心肌缺血模型結扎大鼠冠狀動脈的操作步驟參見文獻Kun Wang, Bo Long, et al. , miR-484 regulatesmitochondrial network through targeting Fisi. Nature Communications. 2012April 17;781 (3) :256-265。在 0-120分鐘的區間內分別自心臟缺血區(危險區)組織及非缺血區心肌(遠端區)組織提取總RNA，并利用實時熒光定量PCR技術檢測miRNA-361的表達水平(檢測方法及條件同上)， 其中，以自非缺血區心肌(遠端區)組織提取的RNA為對照組。結果如圖IB所示，表明缺血 30min-120min的心肌缺血組織中的miRNA-361表達水平較之非缺血組織及非缺血模型組表現出顯著的上升。
實施例2miRNA_361反義核苷酸抑制心肌細胞凋亡的實驗
本實驗中使用實施例I中原代培養的心肌細胞為模型。對心肌細胞(細胞量約為 I X IO6)進行miRNA-361反義核苷酸轉染處理(通過脂質體lipfectin2000按照試劑盒操作說明書進行轉染，購自Invitrogen公司),轉染24小時后,在低氧培養箱(氧濃度低于1%) 中對該細胞培養處理3小時，以誘導細胞凋亡。同時，以未經miRNA-361反義核苷酸轉染的原代心肌細胞為陰性對照，利用臺盼蘭染色方法檢測心肌細胞凋亡情況。
實驗結果如圖2所示，表明抑制內源性miRNA-361可以顯著抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡。
實施例3miRNA_361反義核苷酸抑制心肌缺血損傷實驗
小鼠經冠狀動脈注射miRNA-361反義核苷酸可顯著抑制心肌缺血再灌注損傷。以C57小鼠為實驗對象，按照如下方法注射miRNA-361反義核苷酸和它的陰性對照 (5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，(SEQ IDN0:7)，并且每一個堿基均進行了 2’-甲氧基修飾，由上海吉馬公司合成，)(NC):小鼠稱重并麻醉，仰臥位固定，剪毛并用碘酒消毒手術區。 頸部正中切開氣管并插管，連動物呼吸機進行正壓通氣，在胸骨左緣處及心臟搏動處縱行切開皮膚約3cm，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟。稀釋miRNA-361反義核苷酸于PBS中，終體積為200 μ 1，終濃度為30mg。利用26號導管從心尖進入動脈根部，注射miRNA-361反義核苷酸時同時夾閉主動脈及肺動脈，持續夾閉20秒(每只小鼠注射量為30mg/kg/天)。監測5min，待心臟恢復竇律后，清除胸腔內積血并用去針頭注射器抽吸氣體關閉胸腔。等小鼠清醒后，脫離呼吸機，放回籠中。心電圖監測整個手術過程。
注射miRNA-361反義核苷酸3天后進行心臟缺血再灌注手術，具體操作如下小鼠麻醉后，背位固定于實驗用木板上，并進行心電圖監測。頸部正中切開氣管并插管，連動物人工呼吸機，于第四肋間開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟、血管。在肺動脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標志，于左心耳根部下方2_處進針，進針深度O. 5_ ;以 6/0帶針縫合線穿過心肌表層，在肺動脈圓椎旁出針；待心電圖恢復穩定IOmin后，予以結扎左冠狀動脈前降支(LAD)。以I、aVL導聯ST段弓背向上抬高大于O. Imv并持續O. 5hr以上作為結扎成功的標志。缺血45min之后，松開結扎線開始再灌注。以ST段下降為標志。 清除胸腔內積血并用去針頭注射器抽吸氣體關閉胸腔。再灌注24小時后用Evansblue/TTC 雙染測定心肌梗死面積。同時，以每只小鼠的注射量為30mg/kg/天的miRNA-361反義核苷酸陰性對照(5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’ (SEQ ID NO: 7)，并且每一個堿基均進行了 2’ -甲氧基修飾，由上海吉馬公司合成)的I/R組作為陰性對照組(NC)。
結果如圖3A所示，注射miRNA-361反義核苷酸的小鼠I/R組心肌梗死面積比野生小鼠I/R組明顯降低，有統計學差異(P〈0. 01)。
心梗面積按如下方法計算左心室面積(left ventricle, LV)、危險區總面積 (area at risk, AAR)和梗死區面積(infarct area, INF)之間的關系為(請發明人改變描述方式，避免使用顏色作表述)危險區面積(AAR/LV，%)=(危險區總面積/左心室面積)X 100%,心梗面積(INF/AAR, %)=(梗死區面積/危險區總面積)X 100%。同時又檢測了注射miRNA-361反義核苷酸對I/R所誘導的凋亡的影響，用TUNEL試劑盒(購自Sigma公司)，按照試劑盒操作說明書進行檢測，結果如圖3B所示，miRNA-361反義核苷酸能減小I/ R所誘導的凋亡。
實驗例4抑制內源性的miRNA-361能降低缺血再灌注所致心功能失調。
此實驗所用的miRNA-361的抑制劑均為經過修飾的miRNA-361反義核苷酸，修飾方式為對miRNA-361反義核苷酸的每個堿基都進行了 2,-甲氧基修飾用以增加miRNA-361 反義核苷酸在體內的穩定性。反義核苷酸的修飾及合成都是由上海吉瑪公司完成的。
將實驗小鼠分成4組，每組6只小鼠。向各組別小鼠注射miRNA-361的抑制劑(注射量為30mg/kg/天)，用以抑制內源性的miRNA-361，3天后進行心臟缺血再灌注手術，以每只小鼠的注射量為30mg/kg/天的miRNA-361反義核苷酸陰性對照(的I/R組作為陰性對照組(NC) (5 ‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’ (SEQ ID NO: 7)，并且每一個堿基均進行了 2’-甲氧基修飾，由上海吉馬公司合成)，再灌注一周后進行超聲心動的功能檢測，檢測指標包括左室舒張末內徑(LVIDd)、左室收縮末內徑(LVIDs)、和短軸截短率(FS)，結果如圖4所示，miRNA-361的抑制劑能夠減小缺血再灌注引起的心臟功能的損傷。
權利要求
1.一種單鏈非編碼miRNA-361反義核苷酸在制備用于預防或治療心臟疾病的藥物中的用途，所述miRNA-361反義核苷酸的序列為下述SEQID NO: 2所示的核苷酸序列5，-⑶ACCCCUGGAGAUUCUGAUAA-3，。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述miRNA-361反義核苷酸的核苷酸序列在每個堿基均進行了 2’ -甲氧基修飾。
3.按照權利要求I或2所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌肥厚和心肌纖維化中的中的一種或多種。
4.一種預防或治療心臟疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含有效劑量的權利要求I至3中任一項中所述的miRNA-361反義核苷酸和藥學上可接受的載體、病毒或輔料，優選地，所述載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒中的一種或多種，還優選地，所述藥物組合物的給藥方式選自口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內注射或直接心肌注射。
5.根據權利要3或4所述的藥物組合物在制備用于預防或治療心臟疾病的藥物中的用途。
6.一種單鏈非編碼miRNA-361核苷酸在制備用于診斷或預后心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途，所述miRNA-361核苷酸的序列為下述SEQID NO: I所示的核苷酸序列5， -UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC-3，。
7.按照權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌肥厚和心肌纖維化中的中的一種或多種。
8.一種用于診斷或預后心臟疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含有效劑量的權利要求6或7中所述的miRNA-361核苷酸和藥學上可接受的載體、病毒或輔料。
9.根據權利要求8所述的藥物組合物，其中，所述載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒中的一種或多種。
10.根據權利要求8或9所述的藥物組合物在用于制備診斷或預后心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種miRNA-361及其反義核苷酸的用途，具體為所述miRNA-361反義核苷酸序列在制備用于預防或治療心臟疾病的藥物中的用途，所述miRNA-361核苷酸在制備用于診斷或預后心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途。本發明人通過大量的實驗證明miRNA-361反義核苷酸在心肌缺血損傷及心肌細胞凋亡中的變化及其心肌保護作用。本發明所述的miRNA-361反義核苷酸具有抑制心肌缺血損傷及抑制心肌細胞凋亡的功能。miRNA-361反義核苷酸可以作為一種新型的藥物作用靶點，對于由心肌缺血引起的心肌纖維化、冠心病及心衰等心臟疾病的預防及治療在臨床上具有重要意義。
文檔編號A61P9/10GK102921021SQ20121048700
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月26日 優先權日2012年11月26日
發明者李培峰, 王昆 申請人:中國科學院動物研究所