間質血管層細胞和間充質祖細胞在預防或治療骨性關節炎中的應用的制作方法

間質血管層細胞和間充質祖細胞在預防或治療骨性關節炎中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及間質血管層細胞和間充質祖細胞在預防或治療骨性關節炎中的應用。具體地，給需要的對象施用本發明的含有自體脂肪來源的間質血管層細胞和間充質祖細胞的藥物組合物，對于骨性關節炎有顯著的預防或治療作用。間充質祖細胞具有很高的細胞因子分泌能力，可對體內機體的損傷進行修復：間質血管層細胞和間充質祖細胞具有成軟骨分化及成骨化的能力。本發明還提供了一種含有間質血管層細胞和間充質祖細胞的藥物組合物，以及預防和治療骨性關節炎的方法。
【專利說明】間質血管層細胞和間充質祖細胞在預防或治療骨性關節炎中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于干細胞及生物醫藥領域。具體地，本發明涉及間質血管層細胞和間充質祖細胞在預防或治療骨性關節炎中的應用。
【背景技術】
[0002]骨性關節炎(osteoarthritis, 0A)是一種以關節軟骨的變性、破壞及骨質增生為特征的慢性關節病。OA在60歲以上的人群中患病率可達50%，75歲以上的人群中則達80%。該病的致殘率可高達53%(中華醫學會骨科學分會，2007年《骨關節炎診治指南》修訂版)。OA好發于負重大、活動多的關節，如膝關節，因此稱為膝骨關節炎(Κ0Α)，膝骨關節炎對人類健康危害嚴重，是造成老年人活動功能障礙的主要疾病之一。
[0003]目前膝骨關節炎(KOA)的總體治療原則是通過藥物及非藥物治療相結合，必要時施以手術治療，從而達到減輕或消除疼痛，矯正畸形，改善或恢復關節功能，改善生活質量的目的。
[0004]藥物治療主要包括非留體類抗炎藥(NSAIDs)等鎮痛藥、關節腔內注射透明質酸(HA)或糖皮質激素、改善病情類藥物及軟骨保護劑等。這些藥物在一定程度上可延緩病程、改善患者癥狀，但療效有限，不能逆轉病理過程，或修復軟骨損傷，且大部分藥物副作用明顯。
[0005]當常規療法無效時，出現關節畸形及關節功能障礙者，則必須進行外科手術治療。外科治療的途徑主要通過關節鏡(窺鏡)和開放手術，雖然能夠暫時性的緩解疼痛，但長遠效果并不理想。
[0006]除此之外，組織工程方面的努力，例如自體軟骨細胞移植或基質誘導的自體軟骨細胞移植，對于退化關節組織的生物修復或再生提供了長期解決的可能性。然而，自體軟骨細胞移植或基質誘導的自體軟骨細胞移植的一個主要局限是無法治療較大的軟骨缺損，其對供體位點造成的破壞，去分化以及軟骨細胞有限的生存時間等因素的影響，并不適用于KOA患者。
[0007]正是由于異體軟骨細胞移植的免疫排斥作用十分強烈，本領域目前尚缺乏預防或治療膝骨關節炎的方法，因此迫切需要探尋新穎的治療和修復策略。

【發明內容】

[0008]本發明的目的就是提供間質血管層細胞和間充質祖細胞在預防或治療膝骨關節炎中的應用。
[0009]在本發明的第一方面，提供了一種間質血管層細胞(SVF)和間充質祖細胞(haMPCs)的用途，它們被用于制備預防和/或治療骨性關節炎的藥物組合物。
[0010]在另一優選例中 ，所述的骨性關節炎選自下組:膝骨關節炎、脊柱骨關節炎、髖骨關節炎、或其組合。[0011]在另一優選例中，所述的骨性關節炎為膝骨關節炎。
[0012]在另一優選例中，所述的間質血管層細胞為間質血管層細胞群。
[0013]在另一優選例中，所述的間充質祖細胞為間充質祖細胞群。
[0014]在另一優選例中，所述的間質血管層細胞具有選自下組的任一或多種特征:
[0015](i) 30%以上的細胞具有表面抗原⑶29 ；
[0016](ii)50%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ；
[0017](iii)85%以上的細胞具有表面抗原⑶49d ；
[0018](iv) 55%以上的細胞具有表面抗原⑶90。
[0019]在另一優選例中，35%以上的細胞具有表面抗原⑶29。
[0020]在另一優選例中，55%以上的細胞具有表面抗原⑶73。
[0021]在另一優選例中，90%以上的細胞具有表面抗原⑶49d。
[0022]在另一優選例中，60%以上的細胞具有表面抗原⑶90。
[0023]在另一優選例中，所述的間質血管層細胞具有選自下組的任一或多種特征:
[0024](V) 85%以下的細胞具有表面抗原⑶34 ；
[0025](vi) 15%以下的細 胞具有表面抗原⑶45。
[0026]在另一優選例中，80%以下的細胞具有表面抗原⑶34。
[0027]在另一優選例中，12%以下的細胞具有表面抗原⑶45。
[0028]在另一優選例中，所述的間質血管層細胞分泌選自下組的細胞因子:干細胞生長因子(HGF)，血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人轉化生長因子β (TGF-β)、巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其組合。
[0029]在另一優選例中，所述的間質血管層細胞為間質血管層細胞群。
[0030]在另一優選例中，間質血管層細胞分泌的干細胞生長因子(HGF)的濃度≥0.5ng/ml,較佳地> 0.8ng/ml。
[0031]在另一優選例中，間質血管層細胞分泌的血管內皮生長因子(VEGF)的濃度≥35pg/ml,較佳地≥40pg/mL.[0032]在另一優選例中，間質血管層細胞分泌的人轉化生長因子β (TGF-β)的濃度≥ 150pg/ml,較佳地 > 180pg/ml。
[0033]在另一優選例中，間質血管層細胞分泌的白介素-2(IL_2)的濃度≥15pg/ml，較佳地≥20pg/ml，更佳地≥30pg/ml。
[0034]在另一優選例中，間質血管層細胞分泌的白介素-1O(IL-1O)的濃度≥15pg/ml，較佳地≥20pg/ml,更佳地≥30pg/ml,最佳地≥40pg/ml。
[0035]在另一優選例中，所述的間充質祖細胞具有選自下組的任一或多種特征:
[0036](i) 95%以上的細胞具有表面抗原⑶90 ；
[0037](ii)95%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ；
[0038](iii)95%以上的細胞具有表面抗原⑶29 ；
[0039](iv) 95%以上的細胞具有表面抗原⑶49d。
[0040]在另一優選例中，98%以上的細胞具有表面抗原⑶90。
[0041]在另一優選例中，98%以上的細胞具有表面抗原⑶73。[0042]在另一優選例中，98%以上的細胞具有表面抗原⑶29。
[0043]在另一優選例中，98%以上的細胞具有表面抗原⑶49d。
[0044]在另一優選例中，所述的間充質祖細胞具有選自下組的任一或多種特征:
[0045](V) 2%以下的細胞具有表面抗原HLA-DR ；
[0046](vi) 2%以下的細胞具有表面抗原Actin ；
[0047](vii) 2%以下的細胞具有表面抗原⑶34 ；
[0048](viii) 2%以下的細胞具有表面抗原CD45 ；
[0049](viiii) 2%以下的細胞具有表面抗原⑶14。
[0050]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原HLA-DR。
[0051]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原Actin。
[0052]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原⑶34。
[0053]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原⑶45。
[0054]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原⑶14。
[0055]在另一優選例中，所述的間充質祖細胞分泌選自下組的細胞因子:血管內皮生長因子(VEGF)、人轉化生長因子α (TGF-α)、人轉化生長因子β (TGF-β )、粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)、肝細胞 生長因子(HGF)、血小板衍生因子(PDGF)、白介素-2 (IL-2)、白介素 _4 (IL-4)、白介素-10 (IL-10)。
[0056]在另一優選例中，間充質祖細胞分泌的血管內皮生長因子(VEGF)的濃度≥IOpg/ml,較佳地≥15pg/ml。
[0057]在另一優選例中，間充質祖細胞分泌的人轉化生長因子β (TGF-β)的濃度≥300pg/ml,較佳地> 400pg/mlo
[0058]在另一優選例中，間充質祖細胞分泌的粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)的濃度≥ 30ng/ml,較佳地> 40ng/ml。
[0059]在另一優選例中，間充質祖細胞分泌的肝細胞生長因子(HGF)的濃度≥0.4ng/ml,較佳地> 0.5ng/ml。
[0060]在另一優選例中，間充質祖細胞分泌的血小板衍生因子(roGF)的濃度^ 0.008ng/ml,較佳地> 0.01ng/ml。
[0061]在另一優選例中，間充質祖細胞分泌的白介素-2(IL_2)的濃度≥25pg/ml，較佳地> 30pg/mlo
[0062]在另一優選例中，間充質祖細胞分泌的白介素-1O(IL-1O)的濃度≥30pg/ml，較佳地 > 40pg/ml。
[0063]在本發明的第二方面，提供了一種用于預防和/或治療骨性關節炎的藥物組合物，所述的藥物組合物包括:有效量的間質血管層細胞(SVF)和間充質祖細胞(haMPCs)，以及藥學上可接受的載體。
[0064]在另一優選例中，所述的藥物組合物為皮下注射試劑。
[0065]在另一優選例中，所述的藥學上可接受的載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
[0066]在另一優選例中，所述間質血管層細胞的濃度為0.1-100X 104個/ml，較佳地為1-10 X IO4 個 /ml，更佳地為 2 X IO5 個 /ml。[0067]在另一優選例中，所述間充質祖細胞濃度為0.1-100X 104個/ml，較佳地為1-10 X IO4 個 /ml，更佳地為 2 X IO5 個 /ml。
[0068]在本發明的第三方面，提供了一種預防和/或治療骨性關節炎的方法，包括步驟:給需要的對象施用間質血管層細胞(SVF)和間充質祖細胞(haMPCs)、或施用含有間質血管層細胞(SVF)和間充質祖細胞(haMPCs)的藥物組合物。
[0069]在另一優選例中，所述的對象為人或非人哺乳動物，優選人。
[0070]在另一優選例中，所述的方法包括步驟:
[0071](I)給需要的對象施用間質血管層細胞；和
[0072](2)給需要的對象施用間充質祖細胞。
[0073]在另一優選例中，施用部位為所述對象的關節腔內。
[0074]在另一優選例中，步驟⑴與步驟(2)之間間隔時間為I個月以上，和/或3個月以上。
[0075]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0076]下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
[0077]圖1顯示了 SVF與haMPCs混合療法治療KOA流程。
[0078]圖2顯示了 SVF的表面抗原檢測結果，圖2A-圖21分別顯示⑶34、⑶29、⑶73、CD49d、CD90、CD14、CD45、Actin、HLA-DR 抗原的檢測結果。
[0079]圖3為haMPCs的VEGF分泌量的變化；圖3A顯示LPS刺激24h后haMPCs的VEGF分泌量的變化；圖3B顯示低氧刺激對haMPCs的VEGF分泌量的影響。
[0080]圖4顯示haMPCs成軟骨誘導實驗結果。
【具體實施方式】
[0081]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，間質血管層細胞和間充質祖細胞在預防或治療骨性關節炎中具有極為優異的效果。具體地，給需要的對象施用本發明的自體脂肪來源的間質血管層細胞和間充質祖細胞，或施用含有自體脂肪來源的間質血管層細胞和間充質祖細胞的藥物組合物，對于骨性關節炎有顯著的預防或治療作用。間充質祖細胞具有很高的細胞因子分泌能力，在體內合適條件下可對機體的損傷進行修復:間質血管層細胞和間充質祖細胞具有成軟骨分化及成骨化的能力。本發明還提供了一種預防和治療骨性關節炎的方法以及含有間質血管層細胞和間充質祖細胞的藥物組合物。在此基礎上完成了本發明。
[0082]術語
[0083]如本文所用，術語“以上”和“以下”包括本數，例如“95%以上“指≥95%, “0.2%以下”指≤0.2%。
[0084]骨性關節炎[0085]如本文所用，術語“骨性關節炎”與“osteoarthritis”或“0A”抗原互換使用。
[0086]骨性關節炎是一種慢性關節疾病，它的主要改變是關節軟骨面的退行性變和繼發性的骨質增生，表現在關節疼痛和活動不靈活，X線表現關節間隙變窄，軟骨下骨質致密，骨小梁斷裂，有硬化和囊性變；關節邊緣有唇樣增生；后期骨端變形，關節面凹凸不平；關節內軟骨剝落，骨質碎裂進入關節，形成關節內游離體。
[0087]在本發明中，所述的骨性關節炎可以是任選自下組的骨性關節炎:膝骨關節炎、脊柱骨關節炎、髖骨關節炎、或其組合。本發明所述的骨性關節炎優選為膝骨關節炎。
[0088]脂肪
[0089]自體脂肪是整形和抗衰老治療的優良來源，脂肪組織材料可以來源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本領域技術人員可采用通用的技術方法獲得自體脂肪組織，包括(但不限于)抽吸、手術分離等方法。
[0090]在本發明中，脂肪組織或脂肪原料沒有特別限制，可以是來源于動物或人的任何部位的脂肪組織，優選人的脂肪組織。較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織。
[0091]間質血管層細胞
[0092]如本文所用，術語“間質血管層細胞”、“SVF”、或“間質血管碎片”可以互換使用。
[0093]間質血管層細胞是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。SVF能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，它取材容易、體內儲備量大、適宜大規模培養、對機體損傷小、來源廣泛、適宜自體移植。SVF是干細胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多`種細胞混合物形成的細胞團就叫做間質血管碎片。間質血管碎片中含有豐富的間充質細胞，可分化為多種譜系的細胞，是再生醫學、組織工程等最理想的種子細胞，
[0094]本領域的技術人員能夠使用通用的方法進行SVF的分離和純化。
[0095]如本文所用，術語“分離方法”、“SVF的分離方法”可以互換使用，都指從原始的脂肪組織中獲得分離的SVF的方法和過程。對于獲得的SVF的脂肪細胞材料，首先進行洗滌，除去血細胞；脂肪破碎，消化；去除未消化的組織，獲得含SVF的濾液；離心得到SVF。得到的SVF可以用于進一步傳代、培養或凍存。
[0096]在一個優選的實施例中，分離SVF可以包括步驟(但不限于):將吸脂后的脂肪用PBS反復沖洗兩次，然后在37°C條件下用膠原酶消化30min，1200g離心IOmin后即獲得高密度的SVF碎片，其中主要包括間質細胞、血管內皮細胞和壁細胞。另外，SVF中也包括一些血管來源的細胞，如白細胞和紅細胞等，各種細胞之間具有協同效應。
[0097]間質血管層細胞的抗原檢測
[0098]用本發明使用的SVF具有很高的純度，基本上不含有其他類型的細胞或干細胞。這可通過細胞表面抗原的檢測加以驗證。
[0099]SVF具有多種特異性抗原和受體，主要有CD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 等。
[0100]⑶34抗原是一種高度糖基化I型跨膜蛋白，它選擇性的表達于人類造血干細胞(HSC)，祖細胞(PC)和血管內皮細胞(EC)表面，帶有CD34的脂肪組織祖細胞在總干細胞的比例優選為≤0.2%，更佳地，(0.2%。[0101]⑶45存在于所有造血細胞的表面，包括造血干細胞和破骨細胞。帶有⑶45的脂肪組織祖細胞在總干細胞的比例優選為< 0.1%。
[0102]⑶29、⑶73、⑶49d、⑶90等主要存在于脂肪間充質祖細胞表面。
[0103]帶有CD29的SVF在總干細胞的比例優選為30%,更佳地≥32%，最佳地≥35%。
[0104]帶有CD73的SVF在總干細胞的比例優選為≥50%,更佳地≥60%,最佳地≥70%。
[0105]帶有CD49d的SVF在總干細胞的比例優選為≥85%，更佳地≥90%,最佳地≥95%。
[0106]帶有CD90的SVF在總干細胞的比例優選為≥55%，更佳地≥60%,最佳地≥65%。
[0107]本領域內技術人員可以使用通用的方法檢測SVF的純度和分化程度，如流式細胞儀法。檢測時，加入不同的與有針對性的特異抗體，抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，也可以是具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國專利N0.4，946，778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。加入抗體與細胞表面的抗原結合一定時間，用流式細胞儀對細胞進行自動分析和分選。
[0108]脂肪來源的間充質祖細胞
[0109]如本文所用，術語“脂肪來源的間充質祖細胞”、“haMPCs”或“adiposetissue-derived mesenchymal progenitor cells”含義相同，可以互換使用。
[0110]本 發明使用的脂肪來源的間充質祖細胞優選人來源的脂肪來源的間充質祖細胞；更優選人自體脂肪來源的間充質祖細胞。
[0111]本領域的普通技術人員可以使用常規方法進行haMPCs的分離和培養，在一個優選例的實施例中，包括步驟:
[0112]a.分裝脂肪:將抽取的脂肪裝至離心管中，抽取的脂肪分兩部分，一部分用膠原酶消化洗滌后，用于制備成SVF細胞懸液，直接進行現場回輸；另一部分獲得SVF后繼續培養，以獲得脂肪祖細胞；
[0113]b.脂肪分解:向離心管中加入酶劑，置恒溫振蕩器中，進行脂肪消化，待消化完畢，離心后棄去上層消化后的脂肪，收集沉淀并洗滌；
[0114]c.過濾:加細胞洗液，混勻，用細胞濾網過濾后細胞計數，離心，洗滌沉淀。過濾后的細胞即為血管基質層細胞SVF (stromal vasvular fraction Cells)。SVF是從脂肪組織中分離的多種細胞混合物，是由多種同種異質細胞組成的細胞群，其中包括MPCs樣細胞，內皮(祖)細胞，血管平滑肌細胞以及其他部分的血液來源細胞，包括粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等；
[0115]d.SVF懸液制備:將過濾后的SVF細胞配制成5ml細胞懸液，用注射劑將懸液吸入后，將懸液注入100ml生理鹽水袋中；
[0116]e.細胞培養:根據計數細胞的量調整接種密度接種至培養瓶置CO2培養箱培養；
[0117]f.傳代:接種3天左右出現少量貼壁間充質祖細胞，培養5-7天貼壁細胞呈集落時，消化傳代，收集并計數細胞，原代貼壁情況1:1-2的比例傳代，傳代培養2至3周，收集細胞(自體脂肪來源的祖細胞);
[0118]g.制備脂肪來源的祖細胞懸液:將收集的脂肪來源的祖細胞離心洗滌后，注入生理鹽水，制成細胞懸液。
[0119]脂肪來源的間充質祖細胞的抗原檢測[0120]本發明使用的脂肪來源的間充質祖細胞具有極高的純度和活性。
[0121]本領域的普通技術人員可以使用常規方法對間充質祖細胞表面抗原進行檢測，如過流式細胞儀法等。
[0122]脂肪來源的間充質祖細胞具有多種特異性抗原和受體，主要有:⑶29、⑶73、⑶90、CD49d 等。
[0123]帶有⑶73抗原的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例> 95 %，更佳地≥98%，更佳地≥99%，最佳地為100%。
[0124]帶有⑶90抗原的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例> 95%，更佳地≥98%，更佳地≥99%，最佳地為100%。
[0125]帶有⑶29抗原的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例> 95 %，更佳地≥98%，更佳地≥99%，最佳地為100%。
[0126]帶有⑶49d抗原的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例> 95%，更佳地≥98%，更佳地≥99%，最佳地為100%。
[0127]脂肪來源的間充質祖細胞的陰性指標包括:HLA-DR、Actin、⑶34、⑶45、⑶14等。
[0128]帶有HLA-DR抗原的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例< 2%，更佳地< 1%，更佳地< 0.5%，最佳地沒有HLA-DR抗原。
[0129]帶有Actin抗原的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例< 2%，更佳地< 1%，更佳地< 0.5%，最佳地沒有Actin抗原。
[0130]帶有⑶34的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例≥2%，更佳地≥1%，更佳地(0.5%，最佳地沒有⑶34。
[0131]帶有⑶45的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例≥2%，更佳地≥1%，更佳地(0.5%，最佳地沒有⑶45。
[0132]帶有⑶14的間充質祖細胞在總間充質祖細胞中的比例≥2%，更佳地≥1%，更佳地(0.5%，最佳地沒有⑶14。
[0133]本發明使用的haMPCs優選是可以大量分泌VEGF、TGF- a、TGF- β、GM-CSF, HGF、PDGF, IL-2、IL-4、IL-10等生子因子的人來源的haMPCs，并具有極強克隆形成能力和極低的免疫原性。
[0134]本領域的普通技術人員可以使用常規方法對haMPCs進行使用、處理、施用等操作。如:每批haMPCs發放或使用之前，必須通過無菌、內毒素和支原體檢查，以及DNA同一認定。每批發放的細胞都要符合細胞活力>95%、細胞純度(陽性指標>95%，陰性指標〈2%)。haMPCs急毒、過敏檢測結果均呈陰性，均有一份相應的檢測報告。
[0135]藥物組合物及其應用
[0136]本發明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的間質血管層細胞和間充質祖細胞，以及藥學上可接受的載體。
[0137]通常，可將間質血管層細胞和間充質祖細胞配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，如生理鹽水中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為7-8。
[0138]如本文所用，術語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。
[0139]如本文所用，“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0140]本發明的藥物組合物含有的載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0141]本發明所述間質血管層細胞和間充質祖細胞的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于:所述藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。
[0142]本發明的藥物組合物優選為皮下注射試劑。在另一優選例中，所述皮下注射試劑的間質血管層細胞的濃度為0.1-100X 104個/ml，較佳地為1-10X IO4個/ml，更佳地為2X IO5個/ml ;和/或間充質祖細胞濃度為0.1-100X 104個/ml，較佳地為1-10X104個/ml，更佳地為2X IO5個/ml。
[0143]本發明還提供了一種使用本發明所述藥物組合物的方法，在一個具體地實施例中，包括步驟:
[0144](I)給需要的對象施用間質血管層細胞，優選的施用部位為所述對象的關節腔內；和
[0145](2)給需要的`對象施用間充質祖細胞，優選的施用部位為所述對象的關節腔內；優選的使用時間為步驟(1)之后的I個月，和/或2個月。
[0146]本發明所述的施用流程見圖1。
[0147]本發明的主要優點如下:
[0148](I)本發明的SVF和haMPCs在體內使用是安全的；
[0149](2)本發明使用的haMPCs經LPS、低氧等刺激后，各種細胞因子的表達量會出現均明顯上升，haMPCs具有較高的細胞因子分泌能力，在體內合適條件下能進行機體損傷修復；
[0150](3)本發明的haMPCs具有典型的間充質干細胞特性，在體內的合適條件下具有潛在的分化能力，從而滿足機體相對需求；
[0151](4)本發明的SVF與haMPCs混合療法中，haMPCs在特定誘導條件下可轉化為軟骨細胞，應用于預防或治療骨性關節炎。
[0152]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0153]實施例1
[0154]SVF和haMPCs治療膝骨關節炎(KOA)
[0155]例I:[0156]患者女性，45歲，雙側膝關節疼痛3年余，晨僵，活動能力受限，上下樓梯困難，平地行走覺疼痛，X線檢查提示有明顯骨贅，關節間隙變窄，有硬化性改變。WOMAC評分92分。診斷:中度膝骨關節炎。
[0157]從KOA患者下腹部抽取約30ml脂肪，其中從IOml新鮮獲取的脂肪組織中分離出血管基質部分，經膠原酶消化、過濾、離心除去成熟脂肪細胞后得到SVF，對所述SVF進行表面抗原鑒定，鑒定結果見圖2。
[0158]將每側劑量均為5*106個細胞/2ml的SVF注射于患者雙側關節腔內。剩余脂肪組織分離提純后培養P2-P5代獲得haMPCs。haMPCs冷凍保存，待解凍復蘇后可再次培養，待首次注射后的第1、3個月再各接受一次雙側關節腔，每側的量均為1*107/個/2ml。
[0159]結果:患者癥狀明顯改善，疼痛緩解，平地行走疼痛不明顯，無晨僵出現，活動能力明顯提高；x線檢查提示關節面較前光滑；W0MAC評分為55分。
[0160]對照例:
[0161]患者男性，62歲，膝關節疼痛3年余，晨僵，活動能力受限，僅能從事輕松家務，上下樓梯困難；X線:中等量骨贅形成，關節間隙變窄，硬化性改變；W0MAC評分98分。診斷:中度膝骨關節炎。
[0162]從KOA患者下腹部抽取約30ml脂肪，分離出血管基質部分，經膠原酶消化、過濾、離心除去成熟脂肪細胞后得到SVF，雙側關節腔內注射，每側劑量為5*106個/2ml。待首次注射后的第1、3個月重復上述操作，再次按照每側5*IO6個/2ml的劑量雙側關節腔內注射。
[0163]結果:患者癥狀改善不明顯，疼痛稍緩解，仍有晨僵現象，活動能力稍提高；X線檢查與前大致相同；W0MAC評分`為86分。
[0164]結果表明:聯合使用SVF和haMPCs，具有顯著的治療膝骨關節炎(KOA)的效果。
[0165]實施例2SVF及haMPCs的鑒定
[0166]1.流式檢測
[0167]通過酶消化法將細胞收集到離心管中，細胞懸液調整密度為lX105/mL，800r/min(120g)，離心5min，棄掉上清，用4°C的冷D-Hanks沖洗重懸細胞，再次將細胞懸液以800r/min,離心5min,之后棄去上清。然后用D-Hanks將細胞重懸至ImL,加入抗體5~10 μ L,避光，冰上放置30min。用D-Hanks沖洗，離心，棄上清，重復該沖洗過程2~3次，確保將未結合抗體除凈最后，加入約200至300 μ L的D-Hanks制成懸液，用流式細胞儀檢測(圖2)。
[0168]SVF的流式檢測結果見表1。
[0169]表1
[0170]
【權利要求】
1.一種間質血管層細胞(SVF)和間充質祖細胞(haMPCs)的用途，其特征在于，它們被用于制備預防和/或治療骨性關節炎的藥物組合物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的間質血管層細胞具有選自下組的任一或多種特征: (i) 30%以上的細胞具有表面抗原⑶29 ； (?)50%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ； (iii)85%以上的細胞具有表面抗原⑶49d； (iv)55%以上的細胞具有表面抗原⑶90。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的間質血管層細胞具有選自下組的任一或多種特征: (V) 85%以下的細胞具有表面抗原CD34 ； (vi) 15%以下的細胞具有表面抗原⑶45。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的間質血管層細胞分泌選自下組的細胞因子:干細胞生長因子(HGF)，血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人轉化生長因子β (TGF-β)、巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其組合。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的間充質祖細胞具有選自下組的任一或多種特征: (i)95%以上的細胞具有表面抗原⑶90 ； (?)95%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ； (iii)95%以上的細胞具有表面抗原⑶29； (iv)95%以上的細胞具有表面抗原⑶49d。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的間充質祖細胞具有選自下組的任一或多種特征: (V) 2%以下的細胞具有表面抗原HLA-DR ； (vi)2%以下的細胞具有表面抗原Actin ； (vii)2%以下的細胞具有表面抗原CD34 ； (viii)2%以下的細胞具有表面抗原CD45 ； (viiii) 2%以下的細胞具有表面抗原⑶14。
7.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的間充質祖細胞分泌選自下組的細胞因子:血管內皮生長因子(VEGF)、人轉化生長因子α (TGF-α)、人轉化生長因子β (TGF-β)、粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)、血小板衍生因子(PDGF)、白介素-2 (IL-2)、白介素 _4 (IL-4)、白介素-10 (IL-10)。
8.一種用于預防和/或治療骨性關節炎的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括:有效量的間質血管層細胞(SVF)和間充質祖細胞(haMPCs)，以及藥學上可接受的載體。
9.一種預防和/或治療骨性關節炎的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對象施用間質血管層細胞(SVF)和間充質祖細胞(haMPCs)、或施用含有間質血管層細胞(SVF)和間充質祖細胞(haMPCs)的藥物組合物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，包括步驟:(1)給需要的對象施用間質血管層細胞；和(2)給需要的對象施用間充·質祖細胞。
【文檔編號】A61K35/12GK103816183SQ201210466717
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年11月16日 優先權日:2012年11月16日
【發明者】曹衛, 張麗, 卡尤姆, 周玉潔, 曾曉聆, 趙光宇, 關戰軍, 王新華 申請人:臻景生物技術（上海）有限公司