專利名稱：一種溶菌酶眼用凝膠劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域，涉及一種溶菌酶眼用凝膠劑及其制備方法，該凝膠治療由細菌、衣原體、病毒和耐藥菌導致的各種紅眼病、角膜炎、角膜潰瘍、結膜炎等常見眼部感染疾病。
背景技術：
臨床常見感染性眼病，如眼結膜炎和角膜炎多以細菌性感染為主，目前，細菌性眼病治療主要以抗生素眼藥水最為常用，但容易產生耐藥性。隨著抗生素的大量應用，耐藥菌株也不斷增加。并且抗生素眼藥水因其副作用不宜長期使用。因此，研制新的用于治療細菌性眼病的眼用制劑成為了研究的熱點。溶菌酶是一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，它具有多種藥理作用，如抗菌、抗病毒和抗腫瘤等。溶菌酶抗菌作用機制為其能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖，其水解位點是N-乙酰氨基葡糖與N-乙酰胞壁酸之間的β -I, 4-糖苷鍵。溶菌酶對革蘭氏陽性菌、好氣性抱子形成菌、枯草桿菌和耐輻射微球菌均有良好的分解作用，對大腸桿菌、普通變球菌和副溶血性弧菌等革蘭氏陰性菌也有一定程度的溶解作用。作為新的有效眼科抗菌藥物劑型，藥物溶菌酶本身具有抗菌、抗病毒的作用，且來源于生物體、無耐藥性、組織刺激性、毒性極低。作為淚液的組成成分之一，有利于眼睛淚膜的穩定，有利于侵入眼睛的細菌的清除，能解決抗生素類滴眼液的副作用和耐藥性問題，將會給眼科治療感染性眼病帶來巨大的臨床意義。結膜囊內給予滴眼劑是最常見的藥物治療眼部疾病的方法。但是這種傳統的眼用制劑的最大缺點在于其滯留時間短、生物利用率極低(僅為給藥劑量的19Γ10%)。這是由于眼睛具有流淚和眨眼反射等非常有效的保護機制，使滴入到眼內的藥液迅速從角膜前區域消除。此外，大量的藥物經鼻淚管進入鼻腔或消化道最終被全身吸收，增加了誘發副作用和毒性的風險。另一方面，角膜的生物屏障作用也限制了藥物到達眼內靶組織。以上不利因素使開發長效眼用制劑成為一項極具挑戰性的工作。目前主要解決方法為延長藥物與眼球表面的的接觸時間。滴眼劑中加入水溶性高分子輔料可以延長在眼部的滯留時間，提高生物利用度，降低毒副作用。
發明內容
本發明提供一種抗菌生物藥物溶菌酶的眼用凝膠劑，該制劑由溶菌酶和適合制成眼用凝膠的水溶性高分子材料組成。水溶性高分子選自合成或天然高分子。合成高分子可選自甲基纖維素(MC)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、卡波姆(Carbomer)中的一種或幾種，天然高分子可選自明膠、果膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、西黃蓍膠等中的一種或幾種。本發明按IOOml凝膠劑計算處方中含有溶菌酶為O. flOg，水溶性高分子O. Ol 20g，pH調節劑0. riOg，抑菌劑0. Ol 10g，粘度調節劑O. I 10g，注射用水適量。所述的抑菌劑選自三氯叔丁醇及苯扎氯銨，所述的粘度調節劑選自甘油。所述的溶菌酶是以從鳥禽類中卵清中提取得到，或從動植物組織及其分泌物種提取，分子量為10000 15000。本發明所提供溶菌酶眼用凝膠劑的處方按IOOml凝膠劑計算溶菌酶量為含有溶菌酶量為O. I 10g，水溶性高分子材料O. 01 10g，硼酸O. 01 lg，三氯叔丁醇O. 01 O. Ig,苯扎氯銨0.0Γ0. lg，甘油0. f 10g，注射用水適量。所述的適合制成溶菌酶眼用凝膠劑的水溶性高分子材料羥丙甲纖維素(HPMC)，能夠使生物藥物溶菌酶穩定存在并且該材料對眼睛的刺激性較少，已用于人工淚液中。同時羥丙甲纖維素可延長藥物在眼部的滯留時間，增強藥物的療效，提高生物利用度，減少用藥次數，增強療效和用藥安全性。因此優選的水溶性高分子材料是羥丙甲纖維素(HPMC)。
制備方法如下
I)水溶性高分子材料在容器內加入所需量1/3或2/3的水，并加熱到80°C，制備熱水漿液；然后加入剩余量的冷水至熱水漿液中，攪拌至冷卻，待用。2)注射用水加熱80°C，加入組方量的三氯叔丁醇攪拌使溶解；降溫至60°C加入組方量的硼酸攪拌使溶解；加入組方量的甘油，攪拌，降溫至30°C，加入組方量的溶菌酶攪拌使溶解；最后加入組方量的苯扎氯銨攪拌使溶解，
3)將I)與2 )中的溶液混合，攪拌均勻。4)用10%的氫氧化鈉調pH值至5. O 6. 5，加入注射用水至足量，繼續攪拌使均勻。5)過022 μ m濾膜，分裝。水溶性高分子尤其羥丙甲纖維素可以形成一種具有生物粘附作用的親水凝膠。眼的外表面是一層糖蛋白，或者說是粘蛋白，羥丙甲纖維素與眼的粘附性好，能形成一層穩定的人工角膜覆蓋層。與以往的非生物粘附性材料相比，與眼的粘附性好，在眼部的滯留時間長。溶菌酶滴眼液從眼中消除速度較快。羥丙甲纖維素可維持眼部的高濃度的溶菌酶，增加藥物在眼部的滯留時間。本發明的溶菌酶眼用凝膠，采用水性高分子材料羥丙甲纖維素為基質，成品性狀為透明、均一、粘稠液體，透光率高，pH在5. O 6. 5。技術特點本發明的眼用凝膠劑(I)比滴眼液延長眼內滯留時間。(2)與油膏相比與淚液有較好的親和力。(3)較長時間保持眼內有較高的藥物濃度，進而提高生物利用度。
(4)凝膠劑穩定性好。(5)無刺激性。(6)與傳統的抗生素滴眼液相比，無毒副作用。體外抑菌活性試驗通過紙片抑菌實驗中抑菌圈的大小比較發現，溶菌酶眼用凝膠劑與傳統的抗生素滴眼液(氯霉素滴眼液為陽性對照)相比，二者在對金葡菌的抑菌效果上相似，而對大腸桿菌的抑菌效果上，溶菌酶較氯霉素弱。結果表明溶菌酶對革蘭氏陽性菌的抑菌能力較強，與理論相符。溶菌酶眼用凝膠劑對兔眼的刺激性試驗根據國家食品藥品監督管理局2005年《眼刺激反應分值標準》評分記錄，溶菌酶眼用凝膠劑對兔眼的單次和多次給藥眼刺激性試驗，結果表明沒有刺激性。
.圖I培養皿中紙片I溶菌酶(20μ L, 5mg/ml) 2空白制劑(20 μ L) 3氯霉素(10 μ L, 2. 5mg/ml) 4氯霉素(20 μ L, 2. 5mg/ml) A為金黃色葡萄球菌B為大腸桿菌；
從圖I中可以看出在對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的抑菌實驗中，溶菌酶與氯霉素抑菌能力相當，在對大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)的抑菌實驗，溶菌酶比氯霉素弱。.圖2對照組(生理鹽水)家兔的眼部組織病理切片；
圖A角膜B瞼結膜C球結膜D虹膜E視網膜圖。.圖2給藥組(溶菌酶眼用緩釋制劑)家兔的眼部組織病理切片；
圖A角膜B瞼結膜C球結膜D虹膜E視網膜圖；
由圖2與圖3比較得出，與對照組(生理鹽水)相比，給藥組(溶菌酶眼用凝膠)沒有刺激性。
具體實施例方式實施例I :
處方
溶菌酶O. 5g
羥丙甲纖維素4. Og
硼酸0.8g
三氯叔丁醇O. 125g
苯扎氯銨O. Olg
甘油1.35g
注射用水適量
配制IOOml (用氫氧化鈉溶液調pH值5· (Γ6. 5)
工藝
I)注射用水加熱，制備羥丙甲纖維素溶液，備用。2)加入處方量的三氯叔丁醇攪拌使溶解；降溫加入處方量的硼酸攪拌使溶解；力口入處方量的甘油，攪拌，再降溫，加入處方量的溶菌酶攪拌使溶解；最后加入處方量的苯扎氯銨攪拌使溶解，用氫氧化鈉溶液調PH值，加入注射用水至足量，繼續攪拌使均勻。3)將I)和2 )中的溶液混勻，過O. 22 μ m濾膜，分裝。實施例2 處方
溶菌酶Ig
聚維酮IOg
硼酸0.8
三氯叔丁醇O. 125g
苯扎氯銨O. Olg
甘油1.35g注射用水適量
配制IOOml (用氫氧化鈉溶液調pH值5· (Γ6. 5)
工藝
I)注射用水加熱，制備聚維酮溶液，備用。2)加入處方量的三氯叔丁醇攪拌使溶解；降溫加入處方量的硼酸攪拌使溶解；力口入處方量的甘油，攪拌，再降溫，加入處方量的溶菌酶攪拌使溶解；最后加入處方量的苯扎氯銨攪拌使溶解，用氫氧化鈉溶液調PH值，加入注射用水至足量，繼續攪拌使均勻。3)將I)和2 )中的溶液混勻，過O. 22 μ m濾膜，分裝。
實施例3 處方
溶菌酶5g
甲基纖維素20g
硼酸0.8g
三氯叔丁醇O. 125g
苯扎氯銨O. Olg
甘油1.35g
注射用水適量
配制IOOml (用氫氧化鈉溶液調pH值5· (Γ6. 5)
工藝
I)注射用水加熱，制備甲基纖維素溶液，備用。2)加入處方量的三氯叔丁醇攪拌使溶解；降溫加入處方量的硼酸攪拌使溶解；力口入處方量的甘油，攪拌，再降溫，加入處方量的溶菌酶攪拌使溶解；最后加入處方量的苯扎氯銨攪拌使溶解，用氫氧化鈉溶液調PH值，加入注射用水至足量，繼續攪拌使均勻。3 )將I)和2 )中的溶液混勻，過O. 22 μ m濾膜，分裝。實施例4 處方
溶菌酶7g
聚乙烯醇20g
硼酸0.8g
三氯叔丁醇O. 125g
苯扎氯銨O. Olg
甘油1.35g
注射用水適量
配制IOOml (用氫氧化鈉溶液調pH值5· (Γ6. 5)
工藝
I)注射用水加熱，制備聚乙烯醇溶液，備用。
2)加入處方量的三氯叔丁醇攪拌使溶解；降溫加入處方量的硼酸攪拌使溶解；力口入處方量的甘油，攪拌，再降溫，加入處方量的溶菌酶攪拌使溶解；最后加入處方量的苯扎氯銨攪拌使溶解，用氫氧化鈉溶液調PH值，加入注射用水至足量，繼續攪拌使均勻。3 )將I)和2 )中的溶液混勻，過O. 22 μ m濾膜，分裝 實施例5
處方
溶菌酶IOg
羥丙纖維素20g
硼酸0.8g 三氯叔丁醇O. 125g
苯扎氯銨O. Olg
甘油1.35g
注射用水適量
配制IOOml (用氫氧化鈉溶液調pH值5· (Γ6. 5)
工藝
I)注射用水加熱，制備羥丙纖維素溶液，備用。2)加入處方量的三氯叔丁醇攪拌使溶解；降溫加入處方量的硼酸攪拌使溶解；力口入處方量的甘油，攪拌，再降溫，加入處方量的溶菌酶攪拌使溶解；最后加入處方量的苯扎氯銨攪拌使溶解，用氫氧化鈉溶液調PH值，加入注射用水至足量，繼續攪拌使均勻。3 )將I)和2 )中的溶液混勻，過O. 22 μ m濾膜，分裝 溶菌酶眼用凝膠劑的體外抑菌試驗和兔眼刺激性試驗
取實施例I中的眼用凝膠劑進行體外抑菌試驗和兔眼刺激性試驗 體外抑菌試驗
分別自制溶菌酶眼用凝膠，陰性對照(自制空白凝膠)，陽性對照(市售氯霉素滴眼液)。制備好大小均一的濾紙片。活化金黃色葡萄球菌標準菌株，大腸桿菌標準菌株。制備LB固態培養基胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂12 16g/L，一定要在溫度降下之前到3(T40°C時，將菌種與LB培養基混勻，并且倒好板，待培養基凝固好后，貼好濾紙片并添加液體，放在37°C恒溫培養箱中培養18 24h。結果如說明書附圖I所示。抑菌圈直徑大小如下表所示。表I抑菌圈直徑大小(mm)
菌種 I溶菌酶I空白制劑I氯霉素(10 UL) I氯霉素(20 μ L)
金葡菌一18 8~2Γ~22
大腸桿菌|l3 |8|l9|20
兔眼刺激性試驗
溶菌酶眼用凝膠對兔眼的單次刺激性實驗
取健康家兔4只，左眼結膜囊滴入O. Iml生理鹽水為對照，右眼結膜囊內滴入O. Iml滴眼液，滴眼后輕輕閉合眼瞼約10s，分別于點藥后lh、24h、48h及72h對眼部進行檢查，根據國家食品藥品監督管理局2005年《眼刺激反應評價標準》評分記錄，結果顯示與對照組相t匕，給藥組角膜透明，虹膜清晰，結膜為充血，無水腫及分泌物，手電配備放大鏡檢查病變，評分為O。溶菌酶眼用凝膠對兔眼的多次刺激性實驗
取健康家兔4只，左眼結膜囊滴入O. Iml生理鹽水為對照，右眼結膜囊內滴入O. Iml滴眼液，滴眼后輕輕閉合眼瞼約10s，每天4次，連續7天，每天給藥前及最后一次給藥后lh、24h、48h及72h對對眼部進行檢查，根據國家食品藥品監督管理局2005年《眼刺激反應評價標準》評分記錄，結果顯示與對照組相比，給藥組角膜透明，虹膜清晰，結膜為充血，無水腫及分泌物，手電配備放大鏡檢查病變，評分為O。多次刺激性實驗結束后，耳緣靜脈注射空氣處死家兔。從雙側眼角處破開眼眶，突出眼球，剪斷動眼肌及視神經叢，摘除眼球，沖去表面附著的血塊，甲醛溶液(8%，w/v)固定24h,乙醇梯度脫水,石臘包埋,切片(厚度10 μ m),脫臘,蘇木素(Hematologylin)與伊紅(Eosin)對染(H. E.)，脫水，封片，鏡下觀察個實驗組家兔的組織病理切片結果說明書附圖 2與3所示。溶菌酶眼用凝膠劑對兔眼的刺激性試驗根據國家食品藥品監督管理局2005年《眼刺激反應分值標準》評分記錄，溶菌酶眼用凝膠劑對兔眼的單次和多次給藥眼刺激性試驗，結果表明沒有刺激性。
權利要求
1.一種溶菌酶眼用凝膠劑，其特征在于，按IOOml凝膠劑計算處方中含有溶菌酶為O. I 10g，水溶性高分子O. 01 20g，pH調節劑O. I 10g，抑菌劑O. 01 10g，粘度調節劑O.flOg，注射用水適量。
2.根據權利要求I所述的凝膠劑，其特征在于，按IOOml凝膠劑計算溶菌酶量為含有溶菌酶量為ο. Γιοδ,水溶性高分子材料0. oriog,硼酸0. orig,三氯叔丁醇ο. οΓο. Ig,苯扎氯銨ο. οΓο. Ig,甘油0. riOg注射用水適量。
3.根據權利要求I所述的凝膠劑，其特征在于，所述的水溶性高分子選自合成或天然高分子，合成高分子可選自甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、卡波姆中的一種或幾種，天然高分子可選自明膠、果膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、西黃蓍膠中的一種或幾種。
4.根據權利要求I所述的凝膠劑，其特征在于，水溶性高分子為羥丙甲纖維素。
5.根據權利要求I所述的凝膠劑，其特征在于，所述的抑菌劑選自三氯叔丁醇及苯扎氯銨。
6.根據權利要求I所述的凝膠劑，其特征在于，所述的粘度調節劑選自甘油。
7.根據權利要求I所述的凝膠劑，其特征在于，所述的溶菌酶是以從鳥禽類中卵清中提取得到，或從動植物組織及其分泌物種提取，分子量為1000(Γ15000。
8.如權利要求I所述的溶菌酶眼用凝膠劑的制備方法，其特征在于，先將水溶性高分子材料加熱、溶脹、制備成基質，同時用注射用水將溶菌酶及其他水溶性成分溶解，最后在攪拌條件下將二者混勻。
全文摘要
本發明涉及溶菌酶眼用凝膠劑及其制備方法。溶菌酶眼用凝膠劑適用于治療由細菌、衣原體、病毒和耐藥菌導致的各種紅眼病、眼炎、角膜炎、角膜潰瘍、結膜炎等常見眼部感染疾病。本發明公開的溶菌酶眼用凝膠劑含有0.1%~10.0%溶菌酶，0.01%~20%水溶性高分子基質，0.1%~10%pH調節劑，0.01%~10%抑菌劑，0.1%~10%粘度調節劑，以pH5.0~6.5為緩沖液。本發明處方延長了藥物溶菌酶在眼部滯留時間，提高了溶菌酶在眼部的抑菌效能。
文檔編號A61K38/47GK102961324SQ201210461620
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者王思玲, 姜同英, 王笑笑 申請人:沈陽藥科大學