脊柱髓核植入物的制作方法

專利名稱：：脊柱髓核植入物的制作方法脊柱髓楊植入物本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年10月5日、申請(qǐng)?zhí)枮?00780042201.6的同名申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。描述本發(fā)明涉及用于治療椎間盤(pán)的脊柱髓核植入物和因此特別地涉及CD-RAP蛋白的用途。椎間盤(pán)(IVD)的退變是牽涉機(jī)械、遺傳和生物因素的多因素過(guò)程。盡管病理生理學(xué)機(jī)制仍然不清楚，但已對(duì)所產(chǎn)生的椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)和功能的變化進(jìn)行了詳盡的描述。與關(guān)節(jié)軟骨不同，IVD由不同的組織組成。健康的IVD是包含由纖維性纖維環(huán)(annulusfibrosus)(AF)圍繞的果凍樣髓核(NP)的良好包覆的無(wú)血管器官，其提供椎骨之間的可動(dòng)性和緩沖。髓核位于各椎間盤(pán)的中央并且由軟骨細(xì)胞組成，所述軟骨細(xì)胞在成人中產(chǎn)生包含高百分比的蛋白聚糖(PG)和II型膠原的細(xì)胞外基質(zhì)。髓核由纖維環(huán)圍繞，所述纖維環(huán)由高度組織的、在同心性骨板(concentricIameIlae)中定向的定向排列的膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)組成。內(nèi)纖維環(huán)比外纖維環(huán)厚并且具有缺少片層結(jié)構(gòu)的纖維軟骨基質(zhì)(fibrocartilaginousmatrix)。薄的不同區(qū)域(過(guò)渡區(qū)(transitionzone)(TZ))將內(nèi)纖維環(huán)與髓核分開(kāi)。在衰老過(guò)程中，髓核的蛋白聚糖含量的減少導(dǎo)致減少的水合作用和退變的跡象，包括椎間盤(pán)高度的減少和脊柱外圍結(jié)構(gòu)上載荷的增加。在生物學(xué)水平上，其反映髓核細(xì)胞的正常合成代謝和分解代謝功能之間的不平衡。在退變性椎間盤(pán)疾病(DDD)的一些病例中，IVD的逐漸退變由機(jī)械不穩(wěn)定性引發(fā)。髓核上增加的載荷和壓力使細(xì)胞或侵入的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更大量的細(xì)胞因子或毒性量的金屬蛋白酶(MMP)。隨著DDD的發(fā)展，毒性水平的細(xì)胞因子和MMP降解細(xì)胞外基質(zhì)和導(dǎo)致蛋白聚糖的破壞，從而減少持水力，導(dǎo)致髓核脫水。隨后，髓核的彈性減少，結(jié)果可能產(chǎn)生纖維環(huán)的分層，最后發(fā)生內(nèi)裂縫(internalfissure)向外周展開(kāi)。這些改變引起甚至更大的機(jī)械不穩(wěn)定性和誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，這促進(jìn)了DDD，椎間盤(pán)開(kāi)始凸出(椎間盤(pán)脫出疾病)，最終破裂，導(dǎo)致神經(jīng)刺激和腰痛。不幸的是，與椎間盤(pán)相關(guān)的腰痛的大多數(shù)現(xiàn)有療法關(guān)注于獲得癥狀緩解而非修復(fù)根本的退變過(guò)程(degenerativeprocess)。保守性治療由物理手段、止痛藥、肌肉松馳藥、非類固醇抗炎藥、全身性糖皮質(zhì)激素的使用、細(xì)胞因子拮抗劑的硬膜外注射和注射組成。在療法的更后期，退變性椎間盤(pán)的治療是除去退變的椎間盤(pán)和在椎間盤(pán)的任一側(cè)融合相鄰的椎骨或用合成的椎間盤(pán)材料替換椎間盤(pán)。椎間盤(pán)替換或融合不恢復(fù)正常的椎間盤(pán)高度、生理或機(jī)械性質(zhì)，這很可能在手術(shù)部位或相鄰的椎間盤(pán)處導(dǎo)致其他癥狀。因此，需要抑制或逆轉(zhuǎn)退變背后的細(xì)胞平衡失調(diào)和恢復(fù)椎盤(pán)生物學(xué)功能的其他治療方法。全世界許多研究者正在尋找修復(fù)退變的椎間盤(pán)(degeneratedintervertebraldisc)的生物學(xué)方法?；瘜W(xué)髓核溶解劑(Chemonucleolyticagent)例如木瓜凝乳蛋白酶在過(guò)去一直用作治療脫出的IVD(herniatedIVD)的方法。疼痛的減輕與降解PG(從而減少椎間盤(pán)內(nèi)壓力和減輕受累神經(jīng)根的壓迫)的能力相關(guān)。然而，相關(guān)的并發(fā)癥例如過(guò)敏反應(yīng)、神經(jīng)損傷和感染減少了木瓜凝乳蛋白酶的用途。更近以來(lái)，軟骨素酶ABC(C-ABC)被建議用作化學(xué)髓核溶解術(shù)的備選，因?yàn)槠淙鄙俚鞍酌富钚圆⑶揖哂懈牡孜镒V。盡管軟骨基質(zhì)的再生在使用C-ABC治療后比使用木瓜凝乳蛋白酶更早發(fā)生，但椎間盤(pán)高度和PG含量沒(méi)有充分恢復(fù)，給IVD留下改變的最適度以下的生物化學(xué)性質(zhì)，從而加速事件的退變性級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Takegami等人,2005;Masuda等人,2004;Masuda和An,2004)。W02005/000283和其中的參考文獻(xiàn)描述了治療退變性椎間盤(pán)疾病的方法，包括將拮抗劑例如MMP的高親和力拮抗劑、高特異性細(xì)胞因子拮抗劑、高特異性P38激酶抑制劑、抗炎藥、環(huán)化素(cycline)化合物、抗增殖劑或抗凋亡劑注射入患病的椎間盤(pán)。這些化合物據(jù)認(rèn)為通過(guò)促炎細(xì)胞因子、MMP的抑制、前列腺素的調(diào)控或促炎效應(yīng)的減少來(lái)抑制DDD中的分解代謝過(guò)程或抑制軟骨細(xì)胞增殖或凋亡，但未描述合成代謝活性。W02006/086105描述了使用轉(zhuǎn)錄因子抑制劑治療和/或逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)的病癥的方法，所述抑制劑靶向轉(zhuǎn)錄因子例如NF-kB、E2F、GATA-3和STAT。W02006/031376描述了治療退變性椎間盤(pán)疾病的方法，包括將抗氧化劑單獨(dú)地或·與另外的治療劑例如血纖蛋白、透明質(zhì)酸、干細(xì)胞、骨髓或生長(zhǎng)因子一起施用入椎間盤(pán)。在其他研究中，已將外源生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子i3-l(TGF_i3I)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、生長(zhǎng)和分化因子_5(⑶F-5)以及成骨蛋白(0P-1)施用至椎間盤(pán)內(nèi)細(xì)胞或進(jìn)行椎間盤(pán)內(nèi)注射以刺激蛋白聚糖和膠原的合成，從而減慢或逆轉(zhuǎn)IVD的退變(Levicoff等人，2005;Sobajima等人，2004;Takegami等人，2005;Kawakami等人，2005)。然而，這些生長(zhǎng)因子具有相當(dāng)?shù)姆翘禺愋?，具有誘導(dǎo)成骨基因的風(fēng)險(xiǎn)，從而可誘導(dǎo)不希望的骨形成。該生長(zhǎng)因子技術(shù)的應(yīng)用的另一個(gè)限制是外源生長(zhǎng)因子的相對(duì)短的生物學(xué)半衰期，這使得在它們遞送后只能夠產(chǎn)生短暫的生物學(xué)效應(yīng)。因此，本發(fā)明的目的是提供改善或恢復(fù)椎盤(pán)(vertebraldisc)的生物機(jī)械性質(zhì)和/或抑制影響椎盤(pán)的疾病的進(jìn)一步發(fā)展的脊柱髓核植入物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含能夠逆轉(zhuǎn)影響椎盤(pán)的疾病過(guò)程、恢復(fù)椎盤(pán)的性質(zhì)或抑制疾病的進(jìn)一步發(fā)展的軟骨分化和維持因子的髓核植入物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)在犧牲IVD內(nèi)的分解代謝過(guò)程的情況下刺激合成代謝過(guò)程來(lái)改變軟骨動(dòng)態(tài)平衡以提供用于治療慢性病況例如DDD的新方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含用于治療椎盤(pán)的局部退變的軟骨分化和維持因子的髓核植入物，其中軟骨分化和維持因子為患者提供治愈、減緩疾病發(fā)展和/或改善患者健康的更好的機(jī)會(huì)。另一個(gè)目的是提供脊柱髓核植入物以增加IVD組織中的椎間盤(pán)高度和蛋白聚糖含量。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供髓核植入物，所述植入物包含用于在人中提供，除了軟骨維持外，特定細(xì)胞因子的作用的壓制和抑制以治療慢性病況例如DDD的軟骨分化和維持因子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可通過(guò)微創(chuàng)法(minimalinvasiveprocedure)或內(nèi)窺鏡植入或注射的脊柱髓核植入物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供髓核植入物遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)能夠提供治療劑的更長(zhǎng)水平或持續(xù)控制釋放，從而確保所述治療劑在退變的IVD的部位可使用更長(zhǎng)的時(shí)間范圍(timeframe)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供脊柱髓核植入物，所述植入物是能夠提供更長(zhǎng)水平的治療劑的遞送系統(tǒng)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，提供包含作為非抗體或非受體分子的軟骨分化和維持因子的脊柱髓核植入物或配制劑。所述植入物特別地是經(jīng)椎間盤(pán)可注射的或可植入的(injectableorimplantabletransdiscally)。為了清楚起見(jiàn)，非抗體是指軟骨分化和維持因子不是抗體例如抗TNFa的單克隆抗體、多克隆抗體或嵌合抗體。受體分子是指具有抗促炎細(xì)胞因子例如TNFa的高特異性的受體分子、其截短形式或其功能等同物。本發(fā)明者已開(kāi)發(fā)了許多通過(guò)對(duì)病理脊柱病癥(例如DDD)施用有效量的功能性生物分子來(lái)治療病理脊柱病癥例如退變性椎間盤(pán)疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)實(shí)施方案包括治療椎間盤(pán)的方法，其中優(yōu)選通過(guò)一次或重復(fù)注射經(jīng)椎間盤(pán)施用治療有效量的軟骨分化和維持因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，軟骨分化和維持因子選自能夠刺激IVD細(xì)胞的分化和維持同時(shí)抑制不希望的骨形成的高度軟骨特異性蛋白例如CD-RAP或其活性片段。這樣的軟骨分化和維持因子如⑶-RAP抑制細(xì)胞因子和MMP的活性和/或減少此類細(xì)胞因子和MMP的表達(dá)，同時(shí)刺激導(dǎo)致退變組織例如纖維軟骨的部分或完全恢復(fù)的合成代謝過(guò)程，從而能夠逆轉(zhuǎn)或終止疾病過(guò)程。因此，軟骨分化和維持因子的注射幫助阻止退變性椎間盤(pán)的衰老過(guò)程。因此，本發(fā)明使得能夠在較早的階段治療退變性椎間盤(pán)，從而阻止細(xì)胞外基質(zhì)的降解。此外，軟骨分化和維持因子減輕或阻止軟骨降解以及保持或改善IVD的結(jié)構(gòu)和功能，優(yōu)選沒(méi)有不希望的骨形成。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及軟骨決定和維持因子在制備用于治療需要該治療的哺乳動(dòng)物的脊柱病癥的藥物組合物中的用途。在優(yōu)選實(shí)施方案中，脊柱病癥是特發(fā)性腰痛、椎間盤(pán)脫出、椎間盤(pán)內(nèi)破裂或裂縫的椎間盤(pán)、神經(jīng)根病、椎管狹窄、脫出的髓核-誘導(dǎo)的坐骨神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、特發(fā)性脊柱側(cè)凸或脊髓病。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括脊柱核(spinalnucleus)植入物或配制劑(其包含作為非抗體或非受體分子的軟骨分化和維持因子，優(yōu)選其中植入物或制劑是經(jīng)椎間盤(pán)可注射的或可植入的)在制備用于治療需要該治療的哺乳動(dòng)物的脊柱病癥的藥物組合物中的用途。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“脊柱髓核植入物”是指將被施用至椎間盤(pán)，特別地施用入椎間盤(pán)的髓核(NP)的裝置或制劑。優(yōu)選，可通過(guò)AF將植入物直接施用入椎間盤(pán)或?qū)⑵渲苯又糜谧甸g盤(pán)的NP內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)針或微創(chuàng)法的其他方法將其注射入椎間盤(pán)。其還指脊柱髓核植入物是可注射入髓核、椎間盤(pán)內(nèi)間隙(intradisealspace)或椎間隙的藥物制劑。植入物可以是包含軟骨分化和維持因子的固體，例如海綿或固體載體。優(yōu)選，植入物是允許其容易施用的液體。植入物例如可以是包含軟骨分化和維持因子(任選與其他藥物、配制助劑(formulationaid)或載體一起)的液體。在使用更大大小的載體材料的情況下，椎間盤(pán)的部分或完全去除可以是優(yōu)選的。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)椎間盤(pán)施用(transdiscaladministration)”包括但不限于脊柱髓核植入物至椎間盤(pán)內(nèi)，特別地至椎間盤(pán)的NP內(nèi)的注射，所述椎間盤(pán)包括完整的椎間盤(pán)、不同階段的退變的椎間盤(pán)、脫出的椎間盤(pán)(herniateddisc)、破裂的椎間盤(pán)(ruptureddisc)、分層的椎間盤(pán)(delaminateddisc)或裂縫的椎間盤(pán)(fissureddisc)。如果待注射的體積可能對(duì)NP造成壓力，可在注射或施用用于脊柱的植入物之前去除至少部分NP。在一些情況下，去除的材料的體積為大約待施用的體積±20%的量。術(shù)語(yǔ)經(jīng)椎間盤(pán)施用還包括脊柱髓核植入物至退變的或完整的椎間盤(pán)(如上面對(duì)于NP所描述的)的AF內(nèi)的注射。在使用更大大小的載體材料的情況下，在施用脊柱髓核植入物之前，部分或完全去除椎間盤(pán)可能是必需的。其還包括將植入物提供入位于外部的但與相鄰椎體的AF壁或終板(endplate)緊密相鄰的位置，這可以避免AF的穿刺，從而避免椎間盤(pán)上的潛在負(fù)荷。術(shù)語(yǔ)“退變性椎間盤(pán)疾病(DDD)”是特征部分在于髓核的蛋白聚糖和水含量的逐漸喪失的慢性過(guò)程，其可表現(xiàn)在多種病癥例如特發(fā)性腰痛、椎間盤(pán)脫出、椎間盤(pán)內(nèi)破裂或裂縫的椎間盤(pán)、神經(jīng)根病、椎管狹窄、脫出的髓核-誘導(dǎo)的坐骨神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、特發(fā)性脊柱側(cè)凸和/或脊髓病中。椎間盤(pán)退變級(jí)別可通過(guò)手術(shù)前MRI的分析來(lái)分級(jí)。術(shù)語(yǔ)“軟骨分化和維持因子”是指一種或多種軟骨分化因子，所述因子可具有促有絲分裂能力，但特征在于它們?cè)黾雍?或保持細(xì)胞的軟骨細(xì)胞特異性表型(例如合成代謝活性)而無(wú)不希望的骨形成的能力。軟骨細(xì)胞特異性特征是例如聚集蛋白聚糖(aggrecan)、·II型膠原、S0X-9和蛋白聚糖的產(chǎn)生。軟骨形成形態(tài)發(fā)生素(Chondrogenicmorphogen)可將椎間盤(pán)細(xì)胞的去分化或纖維變性表型逆轉(zhuǎn)至與更年輕的和正常成人的椎間盤(pán)的椎間盤(pán)髓核細(xì)胞(discnucleuscell)相當(dāng)?shù)睦w維軟骨細(xì)胞表型。其還可對(duì)椎間盤(pán)的纖維環(huán)細(xì)胞(annuluscell)和/或終板細(xì)胞具有合成代謝作用。軟骨分化和維持因子優(yōu)選是分泌分子，從而可以以自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌的形式潛在地起作用。根據(jù)本發(fā)明的“間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)”是作為未定型的間充質(zhì)祖細(xì)胞存在于許多成熟骨骼組織中的原始細(xì)胞或靜止細(xì)胞群體。MSC是可變化的(flexible)并且具有向幾種成熟組織類型包括軟骨、骨、脂肪和其他組織(取決于提供給這些靜止細(xì)胞的環(huán)境和生物學(xué)信號(hào))分化的能力。MSC可從許多自體來(lái)源包括骨髓、血液、肌肉組織和脂肪獲得，所述自體來(lái)源可經(jīng)收獲來(lái)分離這些細(xì)胞而無(wú)顯著的供體部位發(fā)病率或免疫原性潛力。MSC可以是NP細(xì)胞或AF細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或可如AF或NP細(xì)胞那樣起作用的或可以分化成細(xì)胞或建立功能性NP和/或AF的其他活細(xì)胞的前體細(xì)胞。本文中所使用的“治療或醫(yī)治”是指與病癥或疾病相關(guān)的癥狀的減輕、癥狀的進(jìn)一步發(fā)展或惡化的停止、疾病或病癥的防治或預(yù)防。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即軟骨分化和維持因子例如MIA(黑素瘤抑制活性因子)家族的成員如CD-RAP可通過(guò)合成代謝作用(例如脊柱中的纖維軟骨的再生或恢復(fù))影響或改變脊柱病癥，同時(shí)阻止或抑制脊柱椎間盤(pán)內(nèi)的分解代謝退變過(guò)程(例如細(xì)胞外基質(zhì)的退變)。軟骨分化和維持因子對(duì)脊柱病癥的這樣的效應(yīng)是令人吃驚的，因?yàn)樽甸g盤(pán)(IVD)的軟骨與其他普通軟骨相當(dāng)不同。與稱為透明軟骨的關(guān)節(jié)軟骨相反，IVD的軟骨由其為特殊類型的軟骨的纖維軟骨組成。特別地，IVD的AF被認(rèn)為是纖維軟骨性的并且主要由高度定向的膠原纖維組成的片層組成。NP包含更高含量的隨機(jī)定向的II型膠原，和更高濃度的蛋白聚糖。AF的細(xì)胞已顯示沿著片層的占優(yōu)勢(shì)的膠原纖維方向定向排列。最里面的AF和NP區(qū)域的細(xì)胞更圓并且累積更多的II型和VI型膠原以及蛋白聚糖。在纖維軟骨和其他類型軟骨例如關(guān)節(jié)/透明軟骨之間存在顯著的物理和化學(xué)差異(W02005/091960和其中的參考文獻(xiàn))。例如，纖維軟骨的不同在于在其主要存在于纖維環(huán)中的基質(zhì)中具有許多I型膠原。來(lái)自纖維軟骨例如IVD軟骨的II型膠原比來(lái)自關(guān)節(jié)軟骨的II型膠原具有顯著更高水平的羥基化和糖基化并且聚集蛋白聚糖具有更多的取代。這些翻譯后修飾影響纖維軟骨膠原和IVD的結(jié)構(gòu)和物理功能。纖維軟骨IVD的出生前分化(Antenataldifferentiation)也與滑膜關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)軟骨的出生前分化不同。IVD具有復(fù)雜的發(fā)育史并且包含脊索來(lái)源的細(xì)胞，所述脊索來(lái)源的細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨中不具有等同物。在本發(fā)明之前，未曾顯示本發(fā)明的軟骨分化和維持因子例如CD-RAP具有在體外或體內(nèi)阻止纖維軟骨或纖維軟骨細(xì)胞退變的生物學(xué)效應(yīng)。本發(fā)明的軟骨分化和維持因子誘導(dǎo)和維持IVD中的軟骨合成代謝(例如蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的合成)，同時(shí)退變和軟骨分解代謝(包括基質(zhì)的分解、異常蛋白聚糖和膠原的合成)的發(fā)病機(jī)理部分或完全被阻止、抑制或甚至逆轉(zhuǎn)。異常椎間盤(pán)退變、增加的凋亡和減少的基質(zhì)分子合成至少部分由細(xì)胞因子例如IL-I介導(dǎo)，所述細(xì)胞因子顯示將軟骨細(xì)胞從合成代謝轉(zhuǎn)換至分解代謝，包括分子和形態(tài)學(xué)水平上的軟骨分解。由本發(fā)明介導(dǎo)的細(xì)胞因子和MMP(已知其參與椎間盤(pán)退變)的活性的抑制和/或此類細(xì)胞因子和MMP的表達(dá)的減少有助于正常椎間盤(pán)基質(zhì)的再合成并且影響椎間盤(pán)細(xì)胞功能。因此，軟骨分化和維持因子的注射幫助阻止或逆轉(zhuǎn)退變性椎間盤(pán)的老化或退變過(guò)程。因此，本發(fā)明使得能夠在較早階段治療退變性椎間盤(pán)，從而阻止細(xì)胞外基質(zhì)的降解和保持IVD的結(jié)構(gòu)和功能。優(yōu)選，本發(fā)明的軟骨分化和維持因子是非抗體和非受體分子。這表示根據(jù)本發(fā)明使用的因子既不是抗體分子也不是受體分子。軟骨分化和維持因子優(yōu)選是非轉(zhuǎn)錄因子(例如，不是S0X-9)或優(yōu)選是細(xì)胞外蛋白質(zhì)。更優(yōu)選，軟骨分化和維持因子不選自轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β例如TGF-βI)-、骨形態(tài)發(fā)生(BMP)-和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-家族蛋白(例如IGF-1)。BMP蛋白由Wozney等人(Wozney和Rosen,1998)描述并且包括例如BMP-2、BMP-7以及生長(zhǎng)和分化因子例如⑶F-5、⑶F-6和⑶F-7。優(yōu)選，軟骨分化和維持因子是軟骨形成形態(tài)發(fā)生素，更優(yōu)選是這樣的軟骨形成形態(tài)發(fā)生素，其為具有軟骨再生(合成代謝因子)和維持的合成代謝活性的蛋白質(zhì)(優(yōu)選軟骨特異性蛋白)。合成代謝因子，與誘導(dǎo)髓核區(qū)域降解的分解代謝因子例如金屬蛋白酶、凋亡因子、白細(xì)胞介素、前列腺素、蛋白質(zhì)水解和降解酶、氧自由基、一氧化氮和纖連蛋白片段相反，在椎盤(pán)內(nèi)增加細(xì)胞的軟骨細(xì)胞特異性表型。優(yōu)選，軟骨形成形態(tài)發(fā)生素是優(yōu)選對(duì)于軟骨組織是特異性的控制軟骨形成和維持同時(shí)又避免或抑制骨形成的軟骨決定因子(cartilagedeterminationfactor)。在一個(gè)實(shí)施方案中，軟骨分化因子具有小于80kDa，優(yōu)選彡30kDa,更優(yōu)選(15kDa，最優(yōu)選10至15kDa的分子量。根據(jù)本發(fā)明使用的軟骨分化和維持因子特別地是誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白例如蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和/或膠原的合成的因子。另外，優(yōu)選，所述因子導(dǎo)致細(xì)胞因子和MMP的量減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，軟骨分化和維持因子選自具有SH3-結(jié)構(gòu)域或具有采用SH3-樣結(jié)構(gòu)域折疊的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)例如CD-RAP。SH3-結(jié)構(gòu)域或SH3-樣結(jié)構(gòu)域描述于例如Stoll等人(Stoll等人,2001b)中并且可通過(guò)用Kelley等人(Kelley等人,2000)中公布的3D-PSSMWeb服務(wù)器預(yù)測(cè)SH3-折疊來(lái)確定。SH3-結(jié)構(gòu)域(也稱為Src同源結(jié)構(gòu)域)是在許多細(xì)胞內(nèi)蛋白中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)分子。到目前為止，還未描述過(guò)SH3-結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)用于治療脊柱病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，軟骨分化和維持因子是可特異性結(jié)合纖連蛋白、纖連蛋白片段和/或富含脯氨酸的序列的蛋白質(zhì)，如例如文獻(xiàn)(Stoll等人，2001a;Homandberg和Hui,1996;Homandberg等人，1997)中所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，軟骨分化和維持因子包含纖連蛋白或整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。軟骨分化和維持因子與細(xì)胞外蛋白例如纖連蛋白或纖連蛋白片段以及整聯(lián)蛋白的結(jié)合可以例如通過(guò)ELISA來(lái)確定?？蓪⒗w連蛋白、其片段或整聯(lián)蛋白涂鋪在塑料表面上并且暴露于軟骨分化和維持因子。結(jié)合的量可通過(guò)過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗軟骨分化和維持因子單克隆抗體來(lái)測(cè)定。整聯(lián)蛋白結(jié)合還可如Bauer等人(通過(guò)引用合并入本文)所述來(lái)測(cè)定。優(yōu)選，軟骨分化和維持因子選自a)包含或具有⑶-RAP的成熟序列(SeqIDNo.I)的軟骨細(xì)胞蛋白和其功能性片段或變體，b)與CD-RAP的C端4個(gè)半胱氨酸骨架(SeqIDNoI的氨基酸12至107)具有至少63%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%的氨基酸序列同源性的蛋白質(zhì)，或c)具有本文中定義的通式序列(genericsequence)I至3(SeqIDΝο·2、3和4)中的任一個(gè)的蛋白質(zhì)。具有與⑶-RAP相同的生物學(xué)功能的功能性片段優(yōu)選具有SeqIDNoI中所示的序列的至少20，特別地至少40和更優(yōu)選至少50，最優(yōu)選80個(gè)連續(xù)氨基酸的長(zhǎng)度。優(yōu)選，功能性片段包含SeqIDNo.I的位點(diǎn)I至50、I至70、I至80、20至80、20至107的氨基酸。成熟的CD-RAP序列(SeqIDNo.I)GPMPKLADRKLCADQECSHPISMAVALQDYMAPDCRFLTIHRGQVVYVFSKLKGRGRLFWGGSVQGDYY⑶LAARLGYFPSSIVREDQTLKPGKVDVKTDKWDFYCQ通式序列I(SeqIDNo.02)CX4CX17CX12VXn_13WX7_18FX4VX21CX通式序列2(SeqIDNo.03)KXCXDXECXnDX3PDCX12VX2KLX7_9WXGSX5_13GYFPX3VX18DFXCX通式序列3(SeqIDNo.04)KXCXDX2CX8AX2DX3PDCRFX5GXVX5KLX7WXGSVX12GYFPX22DFXCQ其中各獨(dú)立出現(xiàn)的“X”代表任何氨基酸，小寫(xiě)的數(shù)字表示任何氨基酸的數(shù)目。優(yōu)選，“X”獨(dú)立地代表天然存在的氨基酸，特別是A、R、N、D、B、C、Q、E、Z、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。特別優(yōu)選，軟骨分化和維持因子是CD-RAP(軟骨源性視黃酸敏感蛋白)(也稱為MIA(黑色素瘤抑制活性))、0T0R(纖維細(xì)胞來(lái)源的蛋白、FDP、MIA-樣、MIAL)和屬于分泌蛋白種類的TANGO130(Bosserhoff等人，2004;Bosserhoff和Buettner,2003;Bosserhoff等人，1997;W000/12762)。⑶-RAP或MIA是作為軟骨樣分化的高度特異性標(biāo)記的130個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(EP0710248，EP1146897，全部通過(guò)引用合并入本文)?；虮磉_(dá)在軟骨形成開(kāi)始時(shí)至整個(gè)軟骨發(fā)育過(guò)程中被激活(Dietz和Sandell,1996;Sakano等人，1999)。在由骨關(guān)節(jié)炎引起的軟骨損傷的情況下，CD-RAP在疾病開(kāi)始發(fā)生時(shí)表達(dá)水平增加，此時(shí)觀察到強(qiáng)合成代謝作用，一旦疾病惡化其表達(dá)下降(Saito等人，2002)。本文中涉及的蛋白質(zhì)可在原核或真核宿主細(xì)胞中從完整的或截短的基因組DNA或cDNA或從合成的DNA表達(dá)。蛋白質(zhì)可從培養(yǎng)基或內(nèi)含體分離和/或再折疊，從而形成生物學(xué)活性組合物。關(guān)于⑶-RAP的重組蛋白純化的示例性方案，參見(jiàn)例如EP0710248和Lougheed等人(Lougheed等人,2001)。在Tscheudschilsuren等人和Stoll等人(Tscheudschilsuren等人，2005;Stoll等人，2003)(其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文)中描述了如何檢測(cè)此類分離的蛋白質(zhì)的活性(例如軟骨形成)的詳細(xì)描述。軟骨誘導(dǎo)的生物測(cè)定法描述于EP1146897的實(shí)施例2至5中，其通過(guò)引用合并入本文。實(shí)施例5描述了用于軟骨誘導(dǎo)的小鼠異位植入測(cè)定法?？蛇x地，軟骨誘導(dǎo)和維持可在部分或完全厚度的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)模型中進(jìn)行測(cè)定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，脊柱髓核植入物還包含一種或多種另外的活性劑，優(yōu)選抗分解代謝劑(anticatabolic)(例如ΜΡ-1和ΜΡ-2)、促有絲分裂劑(例如IGF-1、PDGF,EGF、FGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白例如⑶F_5、BMP拮抗劑例如頭蛋白或脊索發(fā)生素和/或細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑(例如LMP-I、S0X-9)或其組合?？狗纸獯x劑的加入還例如通過(guò)抑制降解酶來(lái)增加由軟骨分化和維持因子或軟骨形成形態(tài)發(fā)生素介導(dǎo)的基質(zhì)合成。促有絲分裂分子是這樣的生長(zhǎng)因子，其增加細(xì)胞的有絲分裂速率并且還可能增加PG合成至不同程度(取決于細(xì)胞所來(lái)源的椎間盤(pán)的區(qū)域)，從而進(jìn)一步支持軟骨分化和維持因子或軟骨形成形態(tài)發(fā)生素的作用。通過(guò)將軟骨分化和維持因子與細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑組合，可在體外實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)軟骨分化和維持因子和/或PG合成的上調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脊柱髓核植入物還包含一種或多種抗金屬蛋白酶、環(huán)化素化合物、細(xì)胞因子拮抗劑、TNF抑制劑、IL抑制劑、抗血管生成物質(zhì)(anti-angiogenicsubstance)、蛋白水解酶的抑制劑、抗炎藥物包括英利昔單抗、依那西普(etanercerpt)、阿達(dá)木單抗(8(^1；[1]1111313)、奈瑞莫單抗(116代1；[1]10111]^13)、來(lái)那西普(lenercerpt)等，或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為了防止椎間盤(pán)的長(zhǎng)期結(jié)構(gòu)性損傷，將脊柱髓核植入物與化學(xué)髓核溶解劑例如C-ABC或US2005/0031666中描述的化學(xué)髓核溶解劑一起共施用或在注射或施用所述化學(xué)髓核溶解劑后再施用脊柱髓核植入物。優(yōu)選，脊柱核植入物是經(jīng)椎間盤(pán)可注射或可植入的。優(yōu)選，注射是局部或非全身性注射。經(jīng)椎間盤(pán)注射或植入的有利方面是可使用更高濃度的軟骨分化和維持因子同時(shí)引起最小的全身性毒性?？蓪④浌欠只途S持因子或IVD椎間盤(pán)修復(fù)劑于可接受的溶劑或媒介物例如但不限于生理鹽水溶液、無(wú)菌水、林格氏液中直接進(jìn)行植入或注射。優(yōu)選，將其施用入椎間盤(pán)內(nèi)或NP間隙。可通過(guò)單次或重復(fù)注射，優(yōu)選通過(guò)經(jīng)皮注射或經(jīng)由導(dǎo)管經(jīng)皮進(jìn)行施用。軟骨形成蛋白優(yōu)選CD-RAP的椎間盤(pán)內(nèi)注射將通過(guò)刺激椎間盤(pán)細(xì)胞上調(diào)蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和/或膠原合成來(lái)增加椎間盤(pán)的高度。因此可通過(guò)微創(chuàng)技術(shù)來(lái)進(jìn)行臨床應(yīng)用，從而顯著地節(jié)省費(fèi)用和與其他方法例如部分間盤(pán)切除術(shù)(disectomy)或椎體融合相比減少并發(fā)癥的可能性?？梢詫⒈景l(fā)明的脊柱髓核植入物加入至椎間盤(pán)，還可以去除椎間盤(pán)的部分并用本發(fā)明的植入物替代它。因此，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的髓核植入物替代一定量的例如在髓核摘除術(shù)(nucleotomy)或部分髓核摘除術(shù)中被除去的NP或補(bǔ)充由于年齡、損傷等原因而退變的NP。正在退變或已退變的椎間盤(pán)或其部分可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使用激光、刮刀或其他手術(shù)器械來(lái)去除。正在退變的椎間盤(pán)可以是完整的椎間盤(pán)或破裂的椎間盤(pán)。正在退變的椎間盤(pán)可被分層，可具有裂縫或可脫出。脊柱髓核植入物可與微創(chuàng)穩(wěn)定術(shù)結(jié)合。在其中持續(xù)刺激導(dǎo)致不希望的因子例如分解代謝因子產(chǎn)生的晚期椎間盤(pán)退變(advanceddiscdegeneration)的嚴(yán)重病例中，微創(chuàng)穩(wěn)定術(shù)可進(jìn)一步支持再生或抑制退變的椎間盤(pán)的發(fā)展。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，植入物或配制劑還可包含載體或藥物遞送裝置。本發(fā)明中使用的載體或藥物遞送裝置是生物相容的，因?yàn)槠涫菬o(wú)毒的并且在身體內(nèi)不引起炎癥反應(yīng)。載體可包括基質(zhì)或支架結(jié)構(gòu)。載體可以是固體、液體、凝膠、糊劑或其他可注射形式。優(yōu)選，載體包括水凝膠例如W02005/113032中描述的水凝膠，特別地可注射的水凝膠、硫酸化的透明質(zhì)酸、高度取代的羧甲基纖維素和其鹽、藻酸鹽、褐藻酸丙二醇酯(hydroxypropylalginate)、殼聚糖、輕乙基淀粉(hydroxethylstarch)、膠原、明膠、reversethermal凝膠(例如PluronicF128)、基于殼聚糖的熱敏共聚物(例如chitosan-Pluronic水凝膠)、多孔絲支架、多個(gè)微球體、脂質(zhì)體配制劑和羥基磷灰石纖維網(wǎng)。載體是適合IVD細(xì)胞的向內(nèi)生長(zhǎng)、增殖和駐留(residence)的細(xì)胞的適當(dāng)?shù)孜?。載體可包括聚合物例如Pluronics例如pluronicl68,環(huán)氧乙燒和環(huán)氧丙燒的嵌段共聚物，例如W02005/034800中描述的嵌段共聚物。優(yōu)選，載體包括硫酸軟骨素、明膠、乙酰透明質(zhì)酸和/或透明質(zhì)酸鈉或其混合物，包括三-共聚物例如明膠/軟骨素-6-硫酸/乙酰透明質(zhì)酸三-共聚物。三-共聚物的制備描述于Yang等人(Yang等人，2005),其完全合并入本文作為參考。載體可包括由富含血小板的血漿組成的血纖蛋白凝膠、與生物可降解明膠水凝膠一起的富含血小板的血衆(zhòng)、血纖蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合物(composite)、封裝有因子的明膠水凝膠微球體、可注射的生物可降解的水凝膠復(fù)合物(其包含例如聚合物例如寡(聚(乙二醇)延胡索酸酯、聚乳酸(PLA)/聚乙醇酸(PGA)和聚ε己內(nèi)酯(polyepsiIoncapronolactone))。優(yōu)選，載體包括殼聚糖-甘油磷酸酯或原位血凝塊或用殼聚糖-甘油磷酸酯溶液穩(wěn)定的血凝塊。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，脊柱髓核植入物還包含持續(xù)釋放裝置，例如包括水凝膠、聚陰離子水凝膠、多個(gè)微球體、脂質(zhì)體配制劑和羥基磷灰石纖維網(wǎng)的持續(xù)釋放裝置。持續(xù)釋放裝置特別地使得能夠進(jìn)行受控釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，持續(xù)釋放裝置提供了連續(xù)不斷的釋放，在另一個(gè)實(shí)施方案中，持續(xù)釋放裝置提供間歇性釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，軟骨分化和維持因子封裝在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體具有優(yōu)于晶體溶液的有利方面，因?yàn)榭杀苊庾甸g盤(pán)中的機(jī)械刺激，從而除了延長(zhǎng)治療劑的持續(xù)時(shí)間和減慢在施用部位的清除之外可避免治療誘導(dǎo)的炎癥。用于提高治療化合物和其他試劑的遞送效率的一個(gè)方法是在脂質(zhì)結(jié)構(gòu)例如脂質(zhì)體中進(jìn)行封裝。脂質(zhì)體通常包含具有核心(所述核心通常在水性介質(zhì)中包含化合物)的封閉脂滴。在某些實(shí)施方案中，將化合物化學(xué)結(jié)合至脂質(zhì)組分或僅將其包含在脂質(zhì)體的水性內(nèi)腔中。優(yōu)選以干燥的脂質(zhì)體組合物(其可進(jìn)行重構(gòu)以產(chǎn)生封裝軟骨分化和維持因子的脂質(zhì)體)的形式提供根據(jù)本發(fā)明的包含軟骨分化和維持因子的藥物組合物或脊柱髓核植入物。優(yōu)選，脂質(zhì)體制劑是干燥的重構(gòu)媒介物(DRV)，其在水性溶液中重構(gòu)后，形成封裝有軟骨分化和維持因子的脂質(zhì)體。本文中使用的脂質(zhì)體組合物是例如干燥的顆粒狀產(chǎn)物，其在加入水后分散，從而形成包含生物活性成分的多層脂質(zhì)體配制劑。有利地，通過(guò)使用干燥的脂質(zhì)體來(lái)避免活性劑和/或脂質(zhì)體的穩(wěn)定性問(wèn)題例如聚集或氧化。適合用于配制劑的單獨(dú)地或以混合物形式存在的脂質(zhì)包括中性或帶正電荷的脂質(zhì)例如膽固醇、磷脂酰膽堿、氫化磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、鞘磷脂、磷脂酰膽堿二油酯(dioleylphosphatidylcholine)、磷脂酰甘油二油酯(dioleylphosphatidyIglycerol)、磷脂酰甘油、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(dimyristoyIphos口1^1^(171(31101;[116)、二棕櫚酰膽堿((1丨。31111;[1071(31101;[116)、神經(jīng)節(jié)苷脂、神經(jīng)酰胺、磷脂酰肌醇、磷酸、雙十六燒基磷酸酯、dimyrylstoylphosphatidylcholine、硬脂酰胺、二棕櫚酰磷脂酰甘油(dipalmitoylphosphatidylgycerol)和其它相似脂質(zhì)。優(yōu)選脂質(zhì)混合物帶電荷。脂質(zhì)體配制劑通常是至少兩種脂質(zhì)例如膽固醇和磷脂酰膽堿的混合物，更常見(jiàn)三種或更多種脂質(zhì)的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的軟骨分化和維持因子PEG化(pegylated)。該經(jīng)修飾的軟骨分化和維持因子具有大于未經(jīng)修飾的試劑的生物學(xué)半衰期，從而可提高試劑用于脊柱病癥的醫(yī)學(xué)治療(medicaltreatment)的功效。PEG化可增加蛋白質(zhì)的大小、提高穩(wěn)定性、增加蛋白質(zhì)的溶解性、減少蛋白質(zhì)水解和減少給藥頻率。此外，可減少朝向蛋白質(zhì)聚集的傾向。PEG化可通過(guò)蛋白質(zhì)上的氨基或巰基與聚乙二醇(PEG)上的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)(碳酸酯、酯、醛或三氟乙基磺酸單甲氧基(tresylate))之間的穩(wěn)定的共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)。所得的結(jié)構(gòu)可以是線性的或分支的。PEG試劑例如描述于Roberts等人(Roberts等人，2002)中。其他PEG化試劑是但不限于甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)、甲基PEO12馬來(lái)酰亞胺PEG、包含胺反應(yīng)性、加甲基帽的(methyl-capped)聚環(huán)氧乙燒(PEO)的修飾試劑(甲基PEOn-NHS酯，n=4、8,12)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的脊柱核植入物包含髓核組織或細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的細(xì)胞。在軟骨分化和維持因子單獨(dú)地或與其他形態(tài)發(fā)生素或生長(zhǎng)因子如IGF-I成員或BMP—起存在的情況下，可將從供體組織(例如骨髓基質(zhì))分離的MSC或自體干細(xì)胞培養(yǎng)在三維的生物可降解的支架材料例如透明質(zhì)酸、絲、膠原、膠原/乙酰透明質(zhì)酸支架、水凝膠、殼聚糖、殼聚糖凝膠、可注射的可交聯(lián)的聚合物制劑、可降解的聚合物凝膠或支架、聚乳酸、明膠/軟骨素-6-硫酸/乙酰透明質(zhì)酸支架、透明質(zhì)酸的酯或衍生物例如Hyaff11、羥基磷灰石纖維網(wǎng)和血纖蛋白膠中或其上，所述形態(tài)發(fā)生素或生長(zhǎng)因子支持此類細(xì)胞分化成髓核-樣細(xì)胞并且優(yōu)選在氧張力下刺激PG合成。用于培養(yǎng)的方法例如描述于Honda等人，2000，其通過(guò)引用合并入本文(Honda等人，2004)。然后將所得的培養(yǎng)的細(xì)胞或新組織，優(yōu)選，與支架材料一起，移植入或注射入受累椎間盤(pán)以達(dá)到NP的再生。還可以在單層培養(yǎng)物中例如在體外低氧條件下分離和擴(kuò)增MSC，如在椎間盤(pán)的NP區(qū)域中發(fā)生的一樣。進(jìn)行移植的MSC可用刺激IVD愈合所需的一種或多種軟骨分化和維持因子進(jìn)行轉(zhuǎn)染或可用包含此類軟骨分化和維持因子(例如CD-RAP或其活性片段)的軟骨形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行刺激。優(yōu)選，可通過(guò)編碼此類軟骨分化和維持因子如⑶-RAP蛋白或其活性片段的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。可通過(guò)注射例如胰島素微量注射器(Sakai等人，2005)或另一種施用裝置將優(yōu)選包埋在生物材料例如膠原、去端肽膠原凝膠、藻酸鹽、褐藻酸丙二醇酯、羧甲基纖維素或羥乙基淀粉中的已轉(zhuǎn)染的和/或已刺激的MSC或培養(yǎng)的MSC移植入退變性椎間盤(pán)。細(xì)胞密度可以是例如IxlO4個(gè)細(xì)胞/ml至IxlO7個(gè)細(xì)胞/ml，優(yōu)選IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml至IxlO6個(gè)細(xì)胞/ml。還可在軟骨分化和維持因子單獨(dú)或與其他形態(tài)發(fā)生素或生長(zhǎng)因子如TGF-β成員和/或BMP(例如ΒΜΡ-2)—起存在的情況下將MSC培養(yǎng)在藻酸鹽、小丸(pellet)、微團(tuán)或聚集的細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述形態(tài)發(fā)生素或生長(zhǎng)因子支持此類細(xì)胞分化成NP樣細(xì)胞?！ぴ谝粋€(gè)實(shí)施方案中，遞送系統(tǒng)包含MSC或AF細(xì)胞與3-D多孔絲支架。多孔絲支架可來(lái)源于從家蠶提取的絲心蛋白。細(xì)胞可在未分化的情況下進(jìn)行擴(kuò)增和可通過(guò)用軟骨分化和維持因子培養(yǎng)來(lái)將其誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞?？蓪SC或AF細(xì)胞直接接種于絲支架或接種于裝載有軟骨分化和維持因子的絲支架，并且可培養(yǎng)在補(bǔ)充或未補(bǔ)充單獨(dú)的或與上述其他因子一起的軟骨分化和維持因子的培養(yǎng)基中。來(lái)自家蠶蠶繭的絲心蛋白支架可以如Sofia等人和Karageorgiou等人(Sofia等人，2001;Karageorgiou和Kaplan,2005)中所述進(jìn)行提取。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用至少一種軟骨分化和維持因子的基因離體轉(zhuǎn)染AF、NP或MSC細(xì)胞以提供刺激IVD愈合所需的細(xì)胞和蛋白質(zhì)，然后在于例如單層培養(yǎng)物、藻酸鹽珠?；蛉S生物可降解支架材料中培養(yǎng)或不培養(yǎng)的情況下將其再植入被靶向的宿主組織。例如，以單層的形式接種分離的NP細(xì)胞，然后使用轉(zhuǎn)染劑例如FuGene6試劑，用例如包含軟骨分化和維持因子的表達(dá)載體或病毒基因治療載體例如腺病毒或腺相關(guān)病毒(AAV)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在數(shù)天的培養(yǎng)(例如，7天)后，將細(xì)胞傳代和封裝在藻酸鹽中，例如優(yōu)選大約O.5至2%的藻酸鹽中?；虻谋磉_(dá)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法例如RT-PCR或ELISA來(lái)分析。可將藻酸鹽珠粒中的此類轉(zhuǎn)染的髓核細(xì)胞用于IVD的組織工程和用于退變性椎間盤(pán)疾病的治療。其他的基因療法描述于例如Wells,2004;Paul等人，2003和Sobajima等人，2004中。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用例如編碼刺激IVD愈合所需的軟骨分化和維持因子的重組猿猴病毒40腺病毒載體或桿狀病毒載體暫時(shí)永生化細(xì)胞例如優(yōu)選人來(lái)源的NF細(xì)胞、MSC或自體軟骨細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可用攜帶外源因子例如軟骨分化和維持因子的腺病毒載體轉(zhuǎn)染退變性人IVD細(xì)胞(例如NP細(xì)胞)。然后，隨后的步驟是將這些經(jīng)修飾的細(xì)胞注射回患病的IVD。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的軟骨分化和維持因子在培養(yǎng)用于制備藥物組合物的間充質(zhì)干細(xì)胞中的用途，所述藥物組合物用于治療需要該治療的哺乳動(dòng)物特別是人中的脊柱病癥。本發(fā)明通過(guò)附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。圖I舉例說(shuō)明了包含CD-RAP的脂質(zhì)體配制劑在數(shù)天中的穩(wěn)定性(三角形)。按照實(shí)施例3測(cè)定脂質(zhì)體配制劑的穩(wěn)定性。上面的曲線(正方形)顯示⑶-RAP在37°C下在緩沖液中的穩(wěn)定性，從而測(cè)定蛋白質(zhì)在這些條件下的穩(wěn)定性。圖2顯示在37°C下24小時(shí)后50μgCD-RAP在血纖蛋白凝塊(fibrinclot)系統(tǒng)中的固定作用。A:Tachotop,14mm的直徑，4mm的高度，來(lái)自Nycomed;B:豬I型膠原海綿，BiomUp;C:再水化的Hyalofi11-F。圖3舉例說(shuō)明與未加入⑶-RAP和BMP-2的陰性對(duì)照相比，在用⑶-RAP(100ng/ml)刺激后，培養(yǎng)的兔IVD細(xì)胞的百分比(%)蛋白聚糖(GAG)誘導(dǎo)(n=3)。實(shí)施例實(shí)施例I:纖維環(huán)穿刺模型在本實(shí)施例中，在兔纖維環(huán)穿刺模型中，CD-RAP的注射有效地部分恢復(fù)椎間盤(pán)高度?？墒褂么_定的針規(guī)通過(guò)椎間盤(pán)的纖維環(huán)的穿刺來(lái)在青少年期的新西蘭白兔(NewZealandWhiteRabbit)中誘導(dǎo)椎間盤(pán)退變(Singh等人，2005)。在通過(guò)向椎間盤(pán)的背部區(qū)域注射利多卡因提供局部麻醉后，獲得側(cè)平面射線照片以測(cè)定IVD高度的注射前基線值。然后將兔置于側(cè)伏臥位，并且使用后外側(cè)腹膜后手術(shù)(posterolateralretroperitonealapproach)暴露腰IVD。在每一只兔中，使用18G針對(duì)AF穿刺。在4、8和10周后，動(dòng)物接受緩沖鹽溶液(磷酸精氨酸或PBS)或媒介物脂質(zhì)體(作為對(duì)照)或2.5mg/ml至10mg/mlCD-RAP(于PBS中)的蛋白質(zhì)溶液或脂質(zhì)體封裝的CD/RAP(2.5mg/ml)至髓核的注射。然后觀察動(dòng)物8或12周(誘導(dǎo)和治療期)。臨床前結(jié)果通過(guò)腰脊骨的磁共振成像(MRI)掃描來(lái)分析，使用成像軟件通過(guò)用定制程序測(cè)量的放射學(xué)觀察來(lái)監(jiān)測(cè)IVD高度，并計(jì)算％DHI(手術(shù)后DHI/手術(shù)前DHIxlOO)。關(guān)于IVD的組織學(xué)分析，切片用蘇木精伊紅和番紅O染色。通過(guò)使用單因素方差分析法(one-wayanalysisofvariance)(ANOVA)分析組間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。椎間盤(pán)退變治療的可選的緩慢進(jìn)行性和重現(xiàn)性動(dòng)物模型是如Sobajima等人(Sobajima等人，2005)中所描述的Lipson和Muir的經(jīng)典“刺傷模型”。關(guān)于刺傷方法，可在新西蘭白兔的AF中產(chǎn)生切口。對(duì)于每一只兔，將用⑶-RAP處理一個(gè)椎間盤(pán)，用鹽溶液或媒介物處理另一個(gè)椎間盤(pán)。纖維環(huán)針穿刺模型導(dǎo)致椎間盤(pán)在12周的觀察期中變窄。鹽溶液處理的椎間盤(pán)展示椎間盤(pán)的大面積退變。然而，%DHI顯示與注射鹽溶液或媒介物的椎間盤(pán)相比，CD-RAP組具有保持椎間盤(pán)高度的傾向。組織學(xué)分析顯示與對(duì)照組相比，蛋白聚糖合成和抗退變性變化的保護(hù)增加。實(shí)施例2:包含⑶/RAP的脂質(zhì)體的制備為了制備持續(xù)的脂質(zhì)體制劑，將750mg磷脂酰膽堿和250mg膽固醇在圓底燒瓶中溶解于20ml乙醇中。在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中定量除去溶劑。通過(guò)在室溫下溫和攪拌，使產(chǎn)生的薄脂質(zhì)膜在IOml水中再水化，從而獲得脂質(zhì)體(10%(w/v)脂質(zhì))。通過(guò)隨后的超聲處理制備直徑大約IOOnm的單層囊泡(SUV)。將300μISUV與250μICD-RAP溶液(3mg/ml于420mM/lArg/P04pH7.5中)混合，然后進(jìn)行凍干。在即將使用干燥的重構(gòu)囊泡之前通過(guò)用蒸餾水重構(gòu)Iyocake來(lái)產(chǎn)生封裝蛋白質(zhì)的多層脂質(zhì)體(MLV)。該再水化導(dǎo)致大約50%或更大的至MLV(具有大約I.5μm或更大的平均直徑)中的捕獲效率而無(wú)被捕獲的藥物的化學(xué)變化。實(shí)施例3:包含⑶-RAP的脂質(zhì)體配制劑的穩(wěn)定性本實(shí)施例舉例說(shuō)明包含CD-RAP的脂質(zhì)體配制劑在數(shù)天內(nèi)的穩(wěn)定性。如下測(cè)定脂質(zhì)體配制劑的穩(wěn)定性如上所述將120μg⑶-RAP封裝在300μI脂質(zhì)體懸浮液中。將100μI的等分用300μI雙蒸水稀釋，然后通過(guò)在ieooorcf下離心15分鐘來(lái)對(duì)其進(jìn)行分離。為了測(cè)定封裝效率，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)RP-HPLC定量未封裝的CD-RAP。重懸浮和離心步驟的6次重復(fù)未顯不涵^尚CD-RAP增加。通過(guò)在7天的時(shí)間內(nèi)測(cè)量通過(guò)離心(在16000rcf下進(jìn)行15分鐘)分離的上清液中CD-RAP的游離濃度來(lái)描述釋放。在各時(shí)間點(diǎn)上，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)RP-HPLC測(cè)量游離CD-RAP的量。圖I中顯示的結(jié)果顯示高于50%的高封裝效率(時(shí)間第O天)。在隨后于37°C下長(zhǎng)達(dá)7天的觀察期中，獲得保持大約45%的封裝的平臺(tái)，從而指示重構(gòu)的包含CD-RAP的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。實(shí)施例4:固定⑶-RAP的植入物本實(shí)施例舉例說(shuō)明在基于膠原或透明質(zhì)酸的支架中的固定CD-RAP的植入物。將50ygCD-RAP配制于125μI20mMKH2PO4U50mMKC1、KOH、pH7.5,0.01%Tween80中。使溶液滲入膠原海綿(A:Tachotop(A)，14mm直徑，4mm高度，來(lái)自Nycomed;⑶豬I型膠原海綿，BiomUp);或與500μIHyaff凝膠(再水化的Hyalofill-F(C)，30mg于0.5ml雙蒸水中，3h，5°C)混合以吸附CD-RAP。隨后通過(guò)冷凍干燥除去水。為了測(cè)定吸附至膠原或Hyaff上的⑶-RAP的固定動(dòng)力學(xué)，將⑶-RAP浸透的樣品固定在500μI牛血纖蛋白凝塊(4.9mg血纖蛋白原、0.3U凝血酶于50mM檸檬酸鈉、150mM氯化鈉、IOmM氯化I丐,pH6.4中)中，如由Meyenburg等人(Meyenburg等人，2000)所述。然后用2ml接受體培養(yǎng)基(acceptormedium)(磷酸鹽緩沖液，0.02%Tween80)完全覆蓋凝塊。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)RP-HPLC在24小時(shí)后定量游離⑶-RAP的量。圖2中顯示的結(jié)果顯示不同生物材料的固定功效的差異，材料A和C顯示對(duì)重組⑶-RAP蛋白的強(qiáng)結(jié)合性質(zhì)。這些結(jié)合性質(zhì)可用于軟骨決定和維持因子在缺陷部位例如退變的椎間盤(pán)中的局部靶向和保留，從而避免CD-RAP的高起始發(fā)生并在再生部位提供長(zhǎng)期的維持。實(shí)施例5:人和動(dòng)物椎間盤(pán)細(xì)胞的分離本實(shí)施例舉例說(shuō)明制備IVD細(xì)胞的方法，所述IVD細(xì)胞用于分析CD-RAP對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)組分(其對(duì)于軟骨細(xì)胞的刺激和CD-RAP的合成代謝活性是特異性的)的產(chǎn)生的影響。人椎間盤(pán)細(xì)胞可從通過(guò)在患有退變性椎間盤(pán)疾病的患者的治療中進(jìn)行的間盤(pán)切除術(shù)回收的人椎間盤(pán)組織分離。樣品(髓核或纖維環(huán))用PBS漂洗以除去殘留的血液或細(xì)胞外基質(zhì)。在組織切碎后，使用膠原酶溶液(0.5mg/ml于PBS中)在37°C下進(jìn)行45分鐘以從細(xì)胞外基質(zhì)釋放細(xì)胞,然后可通過(guò)離心分離細(xì)胞(參見(jiàn)Klagsburn,"MethodsinEnzymology",第VII卷)。在除去上清液后,將收獲的細(xì)胞在6孔板上培養(yǎng)于具有或不具有胎牛血清的Eagle最小必需培養(yǎng)基中。來(lái)自動(dòng)物組織的牛IVD細(xì)胞通過(guò)連續(xù)酶促消化來(lái)分離。在增濕的大氣中于37°C，5%C02下培養(yǎng)細(xì)胞(每天更換補(bǔ)充有10%胎牛血清、25μg/ml抗壞血酸、360μg/mlL-谷氨酰胺和50μg/ml慶大霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基)直至它們達(dá)到大約80%的匯合。來(lái)自動(dòng)物組織的兔IVD細(xì)胞通過(guò)連續(xù)的酶促消化來(lái)分離。在增濕的大氣中于37°C，5%C02下在補(bǔ)充有10%FCS、1%青霉素/鏈霉抗生物素蛋白和50ng/ml抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞直至它們達(dá)到大約90%的匯合。此后，將它們傳代，再培養(yǎng)另外7天。實(shí)施例6:椎間盤(pán)細(xì)胞在藻酸鹽珠粒中的培養(yǎng)通過(guò)將60μII.2%的藻酸鹽(于O.15NaCl中)和實(shí)施例5中的IVD細(xì)胞一起快速遞送至102mmol/L氯化I丐溶液中形成半固體珠粒來(lái)形成藻酸鹽珠粒。清洗珠粒兩次,將其置于具有Iml培養(yǎng)基的12孔板中(Aota等人，2005)。所得的藻酸鹽珠?？捎糜诜治鲈诩尤牖虿患尤隒D-RAP的情況下，纖連蛋白片段(120kDa片段(Chemicon，Cat.No.F1904),來(lái)自人血漿的70kDa的纖連蛋白的蛋白水解片段(Sigma，Cat.No.F0287))對(duì)蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖表達(dá)的影響。實(shí)施例7:CD_RAP介導(dǎo)的IVD細(xì)胞中聚集蛋白聚糖和蛋白聚糖合成的誘導(dǎo)本實(shí)施例舉例說(shuō)明脊柱植入物用于證明⑶-RAP(當(dāng)加入至IVD細(xì)胞時(shí))在培養(yǎng)期間顯著增加IVD細(xì)胞的蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表達(dá)的用途。在第7天，將實(shí)施例5的IVD細(xì)胞置于24孔板中以研究蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表達(dá)。將細(xì)胞在含有0.5μΜ和O.IyM的70kDa的纖連蛋白片段(F0297Sigma)的無(wú)血清培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7天。為了分析CD-RAP對(duì)蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表達(dá)的影響，在用纖連蛋白培養(yǎng)后2天加入不同濃度的⑶-RAP(I、5、10、20ug/ml)。7天后，通過(guò)Lightcycler分析(SybrGreen)分析聚集蛋白聚糖的表達(dá)。為了從珠粒釋放細(xì)胞，將珠粒溶解在含有55mmol/L檸檬酸鈉、30mmol/LNa2EDTA,O.15M氯化鈉pH6.8的緩沖液中。清洗細(xì)胞沉淀并將其重懸浮于裂解緩沖液中以進(jìn)行RNA提取(Qiagen)。使用RNeasyMiniKit(Qiagen)進(jìn)行RNA分離。按照Invitrogen的SuperscriptIIRT試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行⑶NA合成。β-肌動(dòng)蛋白用作對(duì)照。用于擴(kuò)增的引物如下a)牛β_肌動(dòng)蛋白引物5'GGAAATCGTCCGTGACATCAA3';5/AAGGAAGGCTGGAAGAGAGC3';聚集蛋白聚糖引物是5'AAGAGAGCCAMCAGCCGA3';5/CTGGTAGTCCTGGGCATTGT3'。按照Farndale等人(Farndale等人，1982)中描述的方法，使用二甲基亞甲藍(lán)(DMMB)比色測(cè)定法測(cè)量蛋白聚糖合成?？墒褂秒x心過(guò)濾裝置(centriconfilter)以5000rev/分鐘進(jìn)行10至20分鐘來(lái)濃縮培養(yǎng)基。GAG含量可通過(guò)將20μI濃縮的或稀釋的培養(yǎng)基與200μIDMMB溶液混合，然后測(cè)量525-530nm處的光密度來(lái)測(cè)定。為進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，可使用硫酸軟骨素(硫酸軟骨素A94%,牛氣管，ICN)。計(jì)算每微克DNA或細(xì)胞數(shù)目的所有測(cè)量值的平均值。實(shí)施例8:兔椎間盤(pán)細(xì)胞中蛋白聚糖的誘導(dǎo)當(dāng)按照實(shí)施例5分離的兔IVD細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)，將細(xì)胞置于6孔板中以研究蛋白聚糖合成。將細(xì)胞再培養(yǎng)5天。為了分析CD-RAP對(duì)蛋白聚糖合成的影響，將培養(yǎng)基改變成1%FCS，并且將BMP-2(100ng/ml)單獨(dú)地或與CD-RAP(100ng/ml)—起加入至培養(yǎng)物。5天后，使用實(shí)施例7中描述的二甲基亞甲藍(lán)(DMMB)比色測(cè)定法在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中測(cè)量蛋白聚糖的合成。3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的GAG剌激的結(jié)果總結(jié)于圖3中。這些數(shù)據(jù)表明向經(jīng)BMP-2剌激的IVD細(xì)胞中加入CD-RAP在培養(yǎng)的兔IVD細(xì)胞中導(dǎo)致GAG增加。本文中公開(kāi)的所有參考文獻(xiàn)明確地以它們的全文通過(guò)引用合并入本文。盡管已舉例說(shuō)明和描述了優(yōu)選實(shí)施方案，但應(yīng)當(dāng)理解，可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)進(jìn)行改變而不在其由權(quán)利要求界定的更廣泛的方面背離本發(fā)明。文獻(xiàn)目錄Aota,Y.，An，H.S.，Homandberg,G.，Thonar，E.J.，Andersson,G.B.，Pichika,R.，andMasuda，K.(2005).Differentialeffectsoffibronectinfragmentonproteoglycanmetabolismbyintervertebraldisccellsacomparisonwitharticularchondrocytes.Spine30，722-728.Bauer,R.，Humphries，M.，F(xiàn)assler,R.，Winklmeier,A.，Craig,S.E.，andBosserhoff,A.K.(2006).RegulationofintegrinactivitybyMIA.JBiolChem281,11669-11677.Bosserhoff,A.K.andBuettner,R.(2003)·EstablishingtheproteinMIA(melanomainhibitoryactivity)asamarkerforchondrocytedifferentiation.Biomaterials24，3229-3234.Bosserhoff,A.K.，Kondo，S.，Moser,M.，Dietz,U.H.，Copeland，N.G.，Gilbert,D.J.，Jenkins，N.A.，Buettner,R.，andSandelI,LJ.(1997).MouseCD-RAP/MIAgene!structure，chromosomallocalization,andexpressionincartilageandchondrosarcoma.Dev.Dyn.208，516-525.Bosserhoff，A.K.，Moser,M.，andBuettner,R.(2004).CharacterizationandexpressionpatternofthenovelMIAhomologTANGO.GeneExpr.Patterns.4,473-479.Dietz,U.H.andSandelI,L.J.(1996).Cloningofaretinoicacid-sensitivemRNAexpressedincartilageandduringchondrogenesis.J.Biol.Chem.271，3311-3316.Farndale,R.W.，Sayers,C.A.，andBarrett,A.J.(1982)·AdirectspectrophotometricmicroassayforsuIfatedglycosaminoglyeansincartilagecultures.Connect.TissueRes.9，247—248.Homandberg，G.A.andHui,F.(1996).Associationofproteoglycandegradationwithcataboliccytokineandstromelysinreleasefromcartilageculturedwithfibronectinfragments.Arch.Biochem.Biophys.334，325—331.Homandberg,G.A.，Hui,F.，Wen,C.，Purple,C.，Bewsey,K.，Koepp,H.，Huch,K.，andHarris，A.(1997).Fibronectin-fragment-inducedcartilagechondrolysisisassociatedwithreleaseofcataboliccytokines.Biochem.J321(Pt3)，751-757.Honda，M.J.，Yada，T.，Ueda，M.，andKimata,K.(2004).Cartilageformationbyserialpassagedculturedchondrocytesinanewscaffoldhybrid75；25poly(L-lactide-epsilon-caprolactone)sponge.JOralMaxillofacSurg62，1510-1516.Karageorgiou,V.andKaplan，D.(2005).Porosityof3Dbiomaterialscaffoldsandosteogenesis.Biomaterials26，5474—5491.Kawakami,M.，Matsumoto,T.，Hashizume，H.，Kuribayashi,K.，Chubinskaya，S.，andYoshida，M.(2005).Osteogenicprotein-1(osteogenicprotein-l/bonemorphogeneticprotein-7)inhibitsdegenerationandpain-relatedbehaviorinducedbychronicallycompressednucleuspulposusintherat.Spine30，1933—1939.Kelley,L.A.，MacCallum，R.M.，andSternberg,M.J.(2000)·Enhancedgenomeannotationusingstructuralprofilesintheprogram3D-PSSM.JMol.Biol299,499-520.Levicoff，E.A.，Gilbertson,LG.，andKang,J.D.(2005).Genetherapyfordiscrepair.SpineJ5,287S-296S.Lougheed，J.C.，Holton，J.M.，Alber，T.，Bazan，J.F.，andHandel，Τ·Μ·(2001).Structureofmelanomainhibitoryactivityprotein，amemberofarecentlyidentifiedfamilyofsecretedproteins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A98，5515—5520.Masuda，K.andAn，H.S.(2004).Growthfactorsandtheintervertebraldisc.SpineJ4，330S-340S.Masuda，K.，Oegema，T.R.，Jr.，andAn，H.S.(2004).Growthfactorsandtreatmentofintervertebraldiscdegeneration.Spine29，2757—2769.Meyenburg,S.，Lilie，H.，Panzner,S.，andRudolph，R.(2000)·Fibtinencapsulatedliposomesasproteindeliverysystem.Studiesontheinvitroreleasebehavior.JControlRelease69，159—168.Paul，R.，Haydon,R.C.，Cheng,H.，Ishikawa，A.，Nenadovich，N.，Jiang,W.，Zhou,L，Breyer,B.，F(xiàn)eng,T.，Gupta,P.，He，T.C.，andPhillips，F(xiàn).M.(2003)·PotentialuseofSox9genetherapyforintervertebraldegenerativediscdisease.Spine28，755-763.Roberts,M.J.,Bentley,M.D.,andHarris,J.M.(2002).ChemistryforpeptideandproteinPEGylation.Adv.DrugDeliv.Rev54，459-476.Saito，S.，Kondo,S.，Mishima，S.，Ishiguro，N.，Hasegawa，Y.，Sandell,LJ.，andlwata，H.(2002).Analysisofcartilage-derivedretinoic-acid-sensitiveprotein(CD-RAP)insynovialfluidfrompatientswithosteoarthritisandrheumatoidarthritis.JBoneJointSurgBr84，1066-1069.Sakai,D.，Mochida，J.，Iwashina，T.，Watanabe,T.，Nakai，T.，Ando,K.，andHotta，T.(2005).Differentiationofmesenchymalstemcellstransplantedtoarabbitdegenerativediscmodel!potentialandlimitation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