專利名稱：一種白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球、應用及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種治療膠質瘤的藥物，特別是一種抗膠質瘤的雙藥納米載藥微球及其制備方法。
背景技術：
替莫唑胺于1991年8月通過FDA批準用于治療成人頑固性多形性成膠質細胞瘤， 是治療惡性神經膠質瘤的一線藥物。其主要劑型為口服膠囊制劑，口服后血漿藥物濃度于 Ih內達峰，能不經肝臟代謝廣泛分布于全身，并可透過血腦屏障，進入腦脊液中樞神經系統達到有效的藥物濃度。但是由于其口服消除迅速，在腦內難以維持有效的藥物濃度。同時由于其口服劑量較大，容易產生一定的副作用。如其重度的惡心嘔吐(CTC 3級或4級)的發病率為10或6，而且具有一定的劑量依賴性的骨髓抑制毒性，對臨床應用產生了明顯的限制。
此外，自替莫唑胺應用于臨床治療腦膠質瘤以來，眾多的研究結果顯示其臨床有效率不足45%，還有一部分患者應用替莫唑胺后近期療效較好，但長期應用的療效不佳，這嚴重影響了它在臨床中的廣泛應用。究其原因，是因為腫瘤細胞對替莫唑胺具有原發或繼發性耐藥作用。因此尋找能夠有效逆轉替莫唑胺耐藥性以及增強替莫唑胺療效的方法勢在必行。
白藜蘆醇作為一種中藥單體，已經被發現作為天然的腫瘤化學預防劑對腫瘤的起始、促進、發展三個階段均有抑制作用。目前已經有許多研究報道了白藜蘆醇在體內及體外實驗中有效的抑制肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤的生長。但其由于極差的水溶性使其在應用和開發上收到了極大的限制。
因此，有相關人員采用納米負載的方法來制備替莫唑胺或者白藜蘆醇的單藥載藥微球。如中國專利號ZL200610161053. 3公布了一種替莫唑胺聚乳酸納米微球的制備方法。 但由聚乳酸等形成的納米微球穩定性不夠理想，體外環境以及體內環境中容易降解。而且該法制備出的粒徑分布范圍較廣，在IOnm-1O μ m之間，均一性較差，靜脈應用容易后容易形成栓塞，將限制其在臨床上的進一步應用。中國專利申請號200710306513. 5，中國專利號 CN 101579291· B，中國專利申請號201110030051. 5，中國專利申請號201110029485. 3均公布了白藜蘆醇的單藥納米載藥微球的制備方法。但是以上專利均為單藥替莫唑胺或者白藜蘆醇的納米載藥微球的制備方法，所得到的單藥納米微球仍然不能避免單藥治療所存在的問題。
如何克服現有技術的不足已成為當今抗腫瘤藥物技術領域中亟待解決的重大難題。發明內容
本發明的目的是，為克服現有技術的不足，提供雙藥納米載藥微球及其制備方法，以及在抗膠質瘤的應用，本發明制得的抗膠質瘤的雙藥納米載藥微球不僅具有顯著的抗腫瘤效果，而且其毒性反應顯著降低；本發明的制備方法簡便可靠，能夠保證產品的質量和應用的效果。
本發明的技術方案包括白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球、應用及其制備方法，本發明白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球，由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料混合組成，其中，載藥材料為聚己內酯或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA);白藜蘆醇(RES)和載藥材料二種原料組分溶于水溶性無毒性溶劑有機溶劑中，替莫唑胺溶解于純水并經攪拌后；去掉溶劑并用220±30nm的微孔濾膜過濾所得到的(一般為)淡藍色分散液即為粒徑為80-120nm抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液；并經加熱干燥或凍干。
進一步的，由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料組成的納米載藥微球與外加的凍干保護劑混合組成，其中，凍干保護劑為嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。
進一步的，按重量配比的組份為由3-18份替莫唑胺(TEM)、3-18份白藜蘆醇 (RES)和64-94份載藥材料混合組成。
進一步的，按重量配比的組份為替莫唑胺(TEM) 5-15份、白藜蘆醇(RES) 5-15份和載體材料70-90份混合組成。
進一步的，由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料組成的納米載藥微球與外加的凍干保護劑混合組成，其中，凍干保護劑為嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。
進一步的，按重量配比的組份為由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料組成的納米載藥微球混合藥20-30份和外加的凍干保護劑70-80份混合組成。
所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球或外加的凍干保護劑的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球在抗膠質瘤的應用。
本發明的另一種技術方案是在前述技術方案或者優選方案的基礎上，由替莫唑胺 (TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料組成的納米載藥微球與外加的凍干保護劑混合組成，其中，凍干保護劑為嵌段式聚醚(Pluixmic F-68)。本發明另一種技術方案的優選方案，其特征是按重量配比的組份為由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料組成的納米載藥微球混合藥20-30份和外加的凍干保護劑70-80份混合組成。
所述的一種抗腫瘤的雙藥納米載藥微球的制備方法，其特征在于
步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取3-18份替莫唑胺(TEM)、3_18份的白藜蘆醇(RES)和64-94份的載藥材料；載藥材料為聚己內酯或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇 (mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；
步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的白藜蘆醇(RES)和載藥材料(二親嵌段共聚物)二種原料組分溶于一定量的丙酮或乙醇(也包括異丙醇、丁醇等水溶性無毒性溶劑)有機溶劑中，其中，按組分的重量配比，原料藥及載體50-80份、有機溶劑20-50份； 將步驟一中稱取的替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50攝氏度的蒸餾水中，其中按組份的重量配比，替莫唑胺20-50份，蒸餾水50-80份；
步驟三，制備將步驟二得到的白藜蘆醇及載體的有機溶劑在攪拌條件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中；再將所得到的有機溶劑與水的混合溶液在攪拌條件下緩慢加入一定量的蒸餾水中；其中有機溶劑與水的混合溶液與蒸餾水的體積比為，有機溶劑與水的混合溶液蒸餾水=1:5-8 ；
步驟四，純化將步驟三得到的有機溶劑稀釋液，通過旋轉蒸發法除去有機溶劑， 或者用透析法(透析袋Cutoff分子量在20kd以下)除去有機溶劑；
步驟五，過濾將步驟四得到的除去有機溶劑的稀釋液，用220±30nm的微孔濾膜過濾以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料，所得到的淡藍色分散液即為粒徑為80-120nm抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液；
步驟六，干燥或凍干將步驟五得到的抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液置于 40+-5°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發，即制得抗腫瘤的雙藥納米載藥微球成品；或者在步驟五得到的抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液中，加入凍干保護劑嵌段式聚醚(Pluronic F-68)，冷凍干燥后即制得抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液凍干成品，其中，按組分的重量配比，該溶液凍干成品中的雙藥納米載藥微球混合藥20-30、凍干保護劑70-80。
有機溶劑(水溶性溶劑)包括丙酮或乙醇、異丙醇、丁醇、乙二醇、二甘醇、丙二醇、 丙三醇(甘油)，甚至還包括甲醇。本發明中實施例中采用了丙酮或乙醇。但上述水溶性溶劑均可以使用，由于藥物的成品是去掉有機溶劑的，不至產生藥物毒性。
白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球在抗膠質瘤的應用按現有替莫唑胺的藥量進行使用。如典型的應用為替莫唑胺膠囊(泰道)在臨床上化療的常用劑量為 175-200mg/m2/日，每日一次，共五天，休息23天(即每個周期為28天，服藥時間為5天)。
根據體表面積與體重換算可得出人的給藥劑量即為4. 73-5. 41mg/kg,再根據動物與人之間的換算公式可得出小鼠與人的等效劑量為55. 2-63. lmg/kg。在本實驗中我們選取了遠小于臨床等效劑量的劑量進行試驗，雙藥微球中替莫唑胺的劑量為20mg/kg，白藜蘆醇的劑量為30mg/kg。由圖7中可見，白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米微球的凍干粉劑復溶后經靜脈給藥對U87裸鼠皮下移植瘤產生了優于裸藥替莫唑胺以及替莫唑胺與白藜蘆醇裸藥聯合的抑瘤效果。
本發明的作用原理是第一，本發明選擇白藜蘆醇(RES)作為替莫唑胺(TEM)的協同藥，不僅白藜蘆醇本身具有抗膠質瘤細胞增生和誘導凋亡的抑瘤增效作用，而且還能夠明顯協同增強替莫唑胺(TEM)的抗膠質瘤療效。第二，利用具有可生物降解特性的醫用聚己內酯與聚乙二醇等合成的二親嵌段共聚物作為負載替莫唑胺與白藜蘆醇的雙藥載藥材料，聚己內脂作為疏水端、聚乙二醇作為親水端，兩者在水相中能夠自動合成二嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)的納米載藥微球，將替莫唑胺與白藜蘆醇同時投入該納米載藥微球，即可避免其雙藥的各自聚集并凸顯其雙藥納米載藥微球的穩定性。第三，聚己內脂的疏水性能夠使具有一定脂溶性的替莫唑胺與白藜蘆醇更容易被載入納米載藥微球，而聚乙二醇的親水性則使納米載藥微球在患者體內循環的時間大大延長，更容易穿透血腦屏障從而達到對腦腫瘤部位發揮藥效，同時該雙藥納米載藥微球具有單藥或單藥納米載藥微球所不能比擬的低毒副作用，為在患者使用中增加藥物的使用劑量而又不引起過高的毒性反應提供了保證。第四，該雙藥納米載藥微球能夠通過腫瘤細胞的包吞作用被攝入細胞內， 這種進入方式效率遠大于小分子裸藥逐漸滲入方式的效率，從而使替莫唑胺與白藜蘆醇能夠迅速在細胞內達到較高的藥物濃度，產生更好的協同抗膠質瘤效果。
本發明有益效果是與現有技術相比其顯著優點是第一，本發明通過納米載藥體系共同投遞替莫唑胺與白藜蘆醇，充分發揮白藜蘆醇具有增強替莫唑胺抗膠質瘤的協同作用，從而提高雙藥協同抗腫瘤的藥效。第二，本發明的雙藥納米載藥微球的粒徑在IOOnm 左右，可用于靜脈給藥，能夠在體內長時間的循環，從而達到更加優越的抗腫瘤藥效，副作用明顯減小。第三，本發明的雙藥納米載藥微球的制備方法簡便易行，可以顯著提高其雙藥納米載藥微球的穩定性，易實現工業化生產。
圖1是本發明提出的一種抗膠質瘤的雙藥納米載藥微球成品制備方法的流程示意圖。
圖2是本發明提出的一種抗膠質瘤的雙藥納米載藥微球溶液凍干成品制備方法的流程示意圖。
圖3是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇雙藥納米載藥微球在凍干前的透射電子顯微鏡影像照片。
圖4是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇雙藥納米載藥微球在室溫條件下的體外釋放曲線。
圖5是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇兩藥聯合對大鼠膠質瘤C6的體外協同抑瘤效果評價。
圖6是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇雙藥納米載藥微球對大鼠膠質瘤C6的體外協同抑瘤效果評價。
圖7是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇雙藥納米載藥微球對人膠質瘤U87的體內協同抑瘤效果評價。
圖8是本發明的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球(凍干粉劑)在裸小鼠人膠質瘤U87細胞的體內協同抑瘤效果評價。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細說明。結合附圖1和圖2，制備本發明提出的一種抗膠質瘤的雙藥納米載藥微球成品或者一種抗膠質瘤的雙藥納米載藥微球溶液凍干成品，所采用的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇 (RES)和載藥材料以及溶劑、凍干保護劑等全部原料均為市售醫藥原料，符合中華人民共和國藥典標準。其中載藥材料為聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇 (mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)合成的二親嵌段共聚物，不論采用所述的何種載藥材料都能夠達到本發明所述的載藥效果。本發明的原料規格如下
1、替莫唑胺(TEM):分子式C6H6N602 ;分子量194. 15 ;純度HPLC>99。2、白藜蘆醇 (RES):分子式C14H1203 ;分子量228. 24 ;純度HPLC>99。3、載藥材料
①聚己內酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物為聚己內脂-聚乙二醇 (mPEG-PCL);經過核磁(NMR)和凝膠濾過色譜(GPC)驗證。
②聚乳酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物為聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA);經過核磁(NMR)和凝膠濾過色譜(GPC)驗證。
③聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物為聚羥基乙酸-聚乙二醇 (mPEG-PLGA);經過核磁(NMR)和凝膠濾過色譜(GPC)驗證。
4、溶劑①丙酮為色譜純乙醇為色譜純；③蒸餾水為色譜純。
5、凍干保護劑為嵌段式聚醚(Pluronic F-68)，又名Lutrol F68 (泊洛沙姆188)， 分子式(C3H60C2H40)X ;分子量:8350 ;級別醫用級。
結合附圖1，以制備IOOOg抗膠質瘤的雙藥納米載藥微球成品為例，本發明的具體實施方式
如下。
實施例1:
步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取30g替莫唑胺(TEM)、30g漢白藜蘆醇(RES)以及940g載藥材料，其中，載藥材料為聚己內酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PCL分子量20000 (分子量主要分布于此區間)；
步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的30g白藜蘆醇(RES)和940g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分80、丙酮溶劑20); 將步驟一中稱取的30g替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50攝氏度的蒸餾水中，(其中按組份的重量配比，替莫唑胺20，蒸餾水80)；
步驟三，制備將步驟二得到的白藜蘆醇及載體的丙酮在攪拌條件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再將所得到的混合溶液在攪拌條件下緩慢加入一定量的蒸餾水中。其中丙酮與水的混合溶液與蒸餾水的體積比為，丙酮與水的混合溶液蒸餾水=1:5。即得到淡藍色的雙藥微球丙酮及水的混合溶液；
步驟四，純化將步驟三得到的雙藥微球丙酮及水的混合溶液裝入透析袋中(透析袋cut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；
步驟五，過濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的溶液，用220nm的微孔濾膜(常用的規格)過濾以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料，所得到的淡藍色分散液即為粒徑96. 3nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液；
步驟六，干燥將步驟五得到的抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發，即制得抗腫瘤的雙藥納米載藥微球成品。
有機溶劑還可以采用乙醇、丙二醇、丙三醇(甘油)、聚乙二醇或甲醇，均可以除去， 對藥物無顯著影響。
實施例2
步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取IOOg替莫唑胺(TEM)UOOg漢白藜蘆醇(RES)以及800g載藥材料，其中，載藥材料為聚己內酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PLA分子量40000 ；
步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的IOOg白藜蘆醇(RES)和800g載藥材料等原料組分溶于一定量的乙醇溶劑中(按組分的重量配比，原料組分60、丙酮溶劑 40);將步驟一中稱取的IOOg替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50攝氏度的蒸餾水中，其中按組份的重量配比，替莫唑胺40，蒸餾水60 ；
步驟三，制備將步驟二得到的白藜蘆醇及載體的乙醇在攪拌條件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再將所得到的混合溶液在攪拌條件下緩慢加入一定量的蒸餾水中。其中乙醇與水的混合溶液與蒸餾水的體積比為，乙醇與水的混合溶液蒸餾水=1:6。即得到淡藍色的雙藥微球丙酮及水的混合溶液；
步驟四，純化將步驟三得到的雙藥微球丙酮及水的混合溶液裝入透析袋中(透析袋cut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；
步驟五，過濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的溶液，用220nm的微孔濾膜過濾以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料，所得到的淡藍色分散液即為粒徑108. 3nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液；
步驟六，干燥將步驟五得到的抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發，即制得抗腫瘤的雙藥納米載藥微球成品。
有機溶劑還可以采用丙酮、丙二醇、丙三醇(甘油)、聚乙二醇或甲醇，均可以除去， 對藥物無顯著影響。
實施例3
步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取150g替莫唑胺(TEM)、150g漢白藜蘆醇(RES)以及700g載藥材料，其中，載藥材料為聚己內酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PLGA分子量36000 ；
步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的150g白藜蘆醇(RES)和700g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分50、丙酮溶劑 50);將步驟一中稱取的IOOg替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50攝氏度的蒸餾水中，其中按組份的重量配比，替莫唑胺50，蒸餾水50 ；
步驟三，制備將步驟二得到的白藜蘆醇及載體的有機溶劑在攪拌條件下逐滴加入替莫唑胺的 水溶液中。再將所得到的混合溶液在攪拌條件下緩慢加入一定量的蒸餾水中。其中有機溶劑與水的混合溶液與蒸餾水的體積比為，有機溶劑與水的混合溶液蒸餾水=1:6。即得到淡藍色的雙藥微球丙酮及水的混合溶液；
步驟四，純化將步驟三得到的雙藥微球丙酮及水的混合溶液裝入透析袋中(透析袋cut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；
步驟五，過濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的溶液，用220nm的微孔濾膜過濾以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料，所得到的淡藍色分散液即為粒徑100. 5nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液；
步驟六，干燥將步驟五得到的抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發，即制得抗腫瘤的雙藥納米載藥微球成品。
以上述條件(溶劑略加減少)采用75g替莫唑胺(TEM)、150g白藜蘆醇(RES);和 150g替莫唑胺(TEM)、75g白藜蘆醇(RES)能夠得到抗腫瘤的雙藥納米載藥微球成品(成品中替莫唑胺(TEM)與白藜蘆醇的重量比不同)。總之，載體投入量按比例調整即可。
結合附圖2，以制備7000g抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液凍干成品為例，本發明的具體實施例如下。
實施例4
步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取30g替莫唑胺(TEM)、30g漢白藜蘆醇(RES)以及940g載藥材料，其中，載藥材料為聚己內酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PCL分子量20000 ；
步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的30g白藜蘆醇(RES)和940g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分80、丙酮溶劑20); 將步驟一中稱取的30g替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50攝氏度的蒸餾水中，其中按組份的重量配比，替莫唑胺20，蒸餾水80 ；
步驟三，制備將步驟二得到的白藜蘆醇及載體的有機溶劑在攪拌條件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再將所得到的混合溶液在攪拌條件下緩慢加入一定量的蒸餾水中。其中有機溶劑與水的混合溶液與蒸餾水的體積比為，有機溶劑與水的混合溶液蒸餾水=1:5。即得到淡藍色的雙藥微球丙酮及水的混合溶液；
步驟四，純化將步驟三得到的雙藥微球丙酮及水的混合溶液裝入透析袋中(透析袋cut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；步驟五，過濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的溶液，用220nm的微孔濾膜過濾以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料，所得到的淡藍色分散液即為粒徑96. 3nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液；
步驟六，凍干將步驟五得到的納米載藥微球溶液中，加入凍干保護劑嵌段式聚醚 (Pluronic F-68) 5000g，冷凍干燥后即制得含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液凍干成品。
實施例5
步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取IOOg替莫唑胺(TEM)UOOg漢白藜蘆醇(RES)以及800g載藥材料，其中，載藥材料為聚己內酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PLA分子量40000 ；
步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的IOOg白藜蘆醇(RES)和800g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙二醇溶劑中(按組分的重量配比，原料組分60、丙酮溶劑 40);將步驟一中稱取的IOOg替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50攝氏度的蒸餾水中，其中按組份的重量配比，替莫唑胺40，蒸餾水60 ；
步驟三，制備將步驟二得到的白藜蘆醇及載體的丙二醇在攪拌條件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再將所得到的混合溶液在攪拌條件下緩慢加入一定量的蒸餾水中。 其中丙二醇與水的混合溶液與蒸餾水的體積比為，丙二醇與水的混合溶液蒸餾水=1:6。 即得到淡藍色的雙藥微球丙酮及水的混合溶液；
步驟四，純化將步驟三得到的雙藥微球丙二醇及水的混合溶液裝入透析袋中(透析袋cut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙二醇溶劑全部除去；
步驟五，過濾將步驟四得到的除去丙二醇溶劑的溶液，用220nm的微孔濾膜過濾以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料，所得到的淡藍色分散液即為粒徑108. 3nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液；
步驟六，凍干將步驟五得到的納米載藥微球溶液中，加入凍干保護劑嵌段式聚醚 (Pluronic F-68) 6000g，冷凍干燥后即制得含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液凍干成品。
實施例6
步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取150g替莫唑胺(TEM)、150g漢白藜蘆醇(RES)以及700g載藥材料，其中，載藥材料為聚己內酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PLGA分子量36000 ；
步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的150g白藜蘆醇(RES)和700g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分50、丙酮溶劑 50);將步驟一中稱取的IOOg替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50攝氏度的蒸餾水中，其中按組份的重量配比，替莫唑胺50，蒸餾水50 ；
步驟三，制備將步驟二得到的白藜蘆醇及載體的丙酮(有機溶劑還可以采用乙醇、丙二醇、丙三醇(甘油)、聚乙二醇或甲醇均可以除去，對藥物無顯著影響)在攪拌條件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再將所得到的混合溶液在攪拌條件下緩慢加入一定量的蒸餾水中。其中丙酮與水的混合溶液與蒸餾水的體積比為，丙酮與水的混合溶液蒸餾水 =1:6。即得到淡藍色的雙藥微球丙酮及水的混合溶液；
步驟四，純化將步驟三得到的雙藥微球丙酮及水的混合溶液裝入透析袋中(透析袋cut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；
步驟五，過濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的溶液，用220nm的微孔濾膜過濾以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料，所得到的淡藍色分散液即為粒徑100. 5nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液；
步驟六，凍干將步驟五得到的納米載藥微球溶液中，加入凍干保護劑嵌段式聚醚 (Pluronic F-68) 6000g，冷凍干燥后即制得含替莫唑胺(TEM)和白藜蘆醇(RES)雙藥的納米載藥微球溶液凍干成品。
有機溶劑還可以采用乙醇、丙二醇、丙三醇(甘油)、聚乙二醇或甲醇均可以除去， 對藥物無顯著影響。表1、不同濃度的白藜蘆醇聯用下替莫唑胺對C6膠質瘤的IC50值(一定濃度的某種藥物誘導腫瘤細胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細胞與全部細胞數之比等于50%時所對應的濃度)
表1.不同濃度的白藜蘆醇聯用下替莫唑胺對C6膠質瘤的IC50值RESTEMTEMTEM+2pg/mL RES+4pg/mL RESIC50s(pg/mL8 33113.3670.5211.83
本發明經反復實驗驗證，取得了滿意的應用效果。現以替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇 (RES)和聚己內酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)混合制得的雙藥納米載藥微球為例，其應用效果圖示如下
圖3是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇雙藥納米載藥微球成品的透射電子顯微鏡影像照片。圖3中可見雙藥納米載藥微球為較為規則的圓形，表面光滑，其粒徑較為均勻， 均在IOOnm左右。
圖4是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇雙藥納米載藥微球在室溫條件下的體外釋放曲線。圖4中可見替莫唑胺與白藜蘆醇分別表現為緩慢釋放的特征，這樣使得該雙藥納米載藥微球在患者體內發揮療效時可以通過最初的突釋來達到一個較高的血藥濃度，而隨后的長時釋放則為保持一定的有效濃度提供了保證，從而達到了長效緩釋的抗腫瘤效果。
圖5及表I是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇裸藥聯合對鼠膠質瘤C6細胞的體外協同抗腫瘤效果評價，采用MTT方法測定。采用IC50法測定協同效果，如表I及圖5所示，與細胞作用36小時后，測定單藥替莫唑胺對C6的IC50值為113. 36 μ g/mL，而單藥白藜蘆醇對C6的IC50值為8. 33 μ g/mL。在固定白藜蘆醇的濃度分別為2 μ g/mL (該濃度對細胞增殖不產生明顯的抑制效果)或4 μ g/mL (該濃度對細胞增殖不產生明顯的抑制效果)的情況下，其與替莫唑胺聯用后測定替莫唑胺對C6的IC50值分別為70. 51 μ g/mL和11. 83 μ g/ mL。由圖5中可以看出在兩種不同濃度的白藜蘆醇(2μ g/mL或4μ g/mL)與替莫唑胺聯用后所測得的IC50值均在兩個單藥IC50連線內，代表Cl (協同指數Xl (表示兩種藥物聯用具有協同效果)，也即兩種單藥具有協同抗膠質瘤效果。
圖6以及圖7是本發明的替莫唑胺與白藜蘆醇裸藥及雙藥納米載藥微球對鼠膠質瘤C6細胞(圖6)以及人膠質瘤U87細胞(圖7)的體外抗腫瘤效果評價。采用MTT方法測定。實驗分三組，分別為替莫唑胺裸藥(TEM)，替莫唑胺及白藜蘆醇裸藥聯合(TEM+RES)，以及替莫唑胺及白藜蘆醇雙藥納米載藥微球(TEM/RES NPs)。其中，TEM+RES裸藥聯合以及 TEM/RES NPs雙藥納米微球中RES的濃度均設為2 μ g/mL來觀察RES對于TEM的細胞抑制作用的影響(在預試驗中該濃度對膠質瘤細胞無明顯抑制作用)。圖5中可見當小劑量的白藜蘆醇聯合替莫唑胺時，細胞抑制率較之替莫唑胺裸藥有了一個明顯的升高，而替莫唑胺及白藜蘆醇雙藥納米載藥微球顯示了比替莫唑胺及白藜蘆醇裸藥聯合更強的細胞殺傷作用。
圖8是本發明的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球(凍干粉劑)在裸小鼠人膠質瘤U87細胞的體內協同抑瘤效果評價。將體外培養人源性膠質瘤U87細胞，使細胞一直處于對數生長期。取制備好的細胞接種于裸小鼠一側腋下。細胞種植后7 — 8天，選擇腫瘤體積100 mm3左右的小鼠為實驗模型。將符合條件的小鼠隨機分為4組，每組8只。各組藥物如圖7所示，其中，TEM劑量為20mg/kg，RES劑量為30mg/kg。TEM/TES NPs中的TEM 與RES劑量等同于裸藥。各組均靜脈給藥，隔天測一次腫瘤長徑a和垂直于a的最大橫徑 b,計算瘤體積并且繪制腫瘤體積生長曲線。瘤體積=l/2*a*b2。每日觀察各組動物的飲食、 活動、皮色等方面的變化，每2天測量一次小鼠體重，觀察體重變化情況。圖7中可見體內實驗結果顯示白藜蘆醇與替莫唑胺 雙藥納米載藥微球產生了顯著優于替莫唑胺裸藥以及白藜蘆醇與替莫唑胺兩藥聯合的抑瘤效果。同時觀察各組小鼠的狀態可見1、TEM組及對照組小鼠在觀察終點時狀態較差，活動遲緩，毛色無光澤，每日進食較少。2、TEM+RES組狀態較裸藥TEM組稍好。TEM/RES NPs組小鼠狀態最佳，活動仍靈敏，毛色光亮，每日進食量未見減少。白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球在抗膠質瘤的應用效果良好。
權利要求
1.白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球，其特征是由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料混合組成，其中，載藥材料為聚己內酯或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA);白藜蘆醇(RES)和載藥材料二種原料組分溶于水溶性無毒性溶劑有機溶劑中，替莫唑胺溶解于純水并經攪拌后；用220±30nm的微孔濾膜過濾所得到的淡藍色分散液即為粒徑為80-120nm抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液；并加熱干燥或凍干。
2.根據權利要求1所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球，其特征是替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇RES和載藥材料組成的納米載藥微球與外加的凍干保護劑混合組成，其中，凍干保護劑為嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。
3.根據權利要求1或2所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球，其特征是按重量配比的組份為由3-18份替莫唑胺(TEM)、3-18份白藜蘆醇(RES)和64-94份載藥材料混合組成。
4.根據權利要求3所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球，其特征是按重量配比的組份為5-15份替莫唑胺(TEM)、5-15份白藜蘆醇(RES)和70-90份載體材料混合組成。
5.根據權利要求1、2或4所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球，其特征是由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料組成的納米載藥微球與外加的凍干保護劑混合組成，其中，凍干保護劑為嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。
6.根據權利要求5所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球，其特征是按重量配比的組份為由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料組成的納米載藥微球混合藥20-30份和外加的凍干保護劑70-80份混合組成。
7.根據權利要求1或6之一所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球或外加的凍干保護劑的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球在抗膠質瘤的應用。
8.一種白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球的制備方法，其特征在于步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取3-18份替莫唑胺(TEM)、3-18份的白藜蘆醇(RES)和64-94份的載藥材料；載藥材料為聚己內酯或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的白藜蘆醇RES和二親嵌段共聚物載藥材料二種原料組分溶于有機溶劑中，其中，按組分的重量配比，藥及載體50-80、有機溶劑20-50 ;將步驟一中稱取的替莫唑胺TEM溶于45-50攝氏度的純水(包括蒸餾水等)中，其中按組份的重量配比，替莫唑胺20-50，蒸餾水50-80 ；步驟三，制備將步驟二得到的白藜蘆醇及載體的有機溶劑在攪拌條件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再將所得到的有機溶劑與水的混合溶液在攪拌條件下緩慢加入一定量的蒸餾水中；其中有機溶劑與水的混合溶液與蒸餾水的體積比為，有機溶劑與水的混合溶液蒸餾水=1 5-8 ；步驟四，純化將步驟三得到的有機溶劑稀釋液，通過旋轉蒸發法除去有機溶劑，或者用透析法除去有機溶劑；步驟五，過濾將步驟四得到的除去有機溶劑的稀釋液，用220nm±30nm的微孔濾膜過濾以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料，所得到的淡藍色分散液即為粒徑為80-120nm抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液；步驟六，加熱干燥或凍干。
9.根據權利要求8所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球的制備方法，其特征在于將步驟五得到的抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液置于40+-5°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發，即制得抗腫瘤的雙藥納米載藥微球成品；或者在步驟五得到的抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液中，加入凍干保護劑嵌段式聚醚Pluronic F-68，冷凍干燥后即制得抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液凍干成品，其中，按組分的重量配比，該溶液凍干成品中的雙藥納米載藥微球混合藥20-30份、凍干保護劑70-80份。
10.根據權利要求8或9所述的白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球的制備方法，其特征在于有機溶劑包括丙酮、乙醇、乙二醇、二甘醇、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇或甲醇。
全文摘要
白藜蘆醇與替莫唑胺雙藥納米載藥微球，由替莫唑胺(TEM)、白藜蘆醇(RES)和載藥材料混合組成，其中，載藥材料為聚己內酯或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；白藜蘆醇(RES)和載藥材料二種原料組分溶于水溶性無毒性溶劑有機溶劑中，替莫唑胺溶解于純水并經攪拌后；用220±30nm的微孔濾膜過濾所得到的淡藍色分散液即為粒徑為80-120nm抗腫瘤的雙藥納米載藥微球溶液；并加熱干燥或凍干。
文檔編號A61K31/4188GK102988361SQ20121044695
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者王虹, 解衛平, 徐華娥, 李曉林 申請人:徐華娥, 李曉林