一種調控胰腺癌干細胞的中藥復方制劑的制作方法
【專利摘要】本發明屬中藥領域，涉及調控胰腺癌干細胞的中藥制劑，該中藥復方制劑適用于在胰腺癌治療過程中對胰腺癌干細胞的控制。本發明根據我國傳統中醫藥濕熱毒蘊病機理論，針對胰腺癌“濕熱”和“熱毒”的病理特點，以“清熱化濕，散結解毒”為組方原則，選取蛇六谷、半枝蓮、白花蛇舌草、絞股藍、白豆蔻、生米仁和靈芝七味藥物制成。經動物實驗證實，本發明對SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠的瘤體有明顯的抑制作用，調控瘤體內胰腺癌干細胞的分化。與吉西他濱合用，明顯增強抑瘤作用，同時調控腫瘤干細胞的分化。
【專利說明】一種調控胰腺癌干細胞的中藥復方制劑
【技術領域】
[0001]本發明屬中藥領域，涉及調控胰腺癌干細胞的中藥制劑，該中藥復方制劑適用于在胰腺癌治療過程中對胰腺癌干細胞的控制。
【背景技術】
[0002]腫瘤干細胞(CSC)是腫瘤組織中小部分具有自我更新和多向分化的細胞亞群，它決定著腫瘤的形成和發展。換而言之，即使體內殘存了極小部分CSC，都會因其高致瘤性而誘發腫瘤的復發和遠處轉移，最終導致治療失敗，疾病進展，甚至死亡。因此，CSC與腫瘤不良預后有著非常密切的聯系。
[0003]CSC與腫瘤預后的相關性已被大量臨床研究所證實。Hisae等研究證實結腸癌B期或C期患者外周血腫瘤干細胞標記CEA/CK/⑶133陽性往往提示預后不佳，與CEA/CK/⑶133陰性患者相比，總生存率明顯降低，無病進展期明顯縮短。Al-Hajj等對乳腺癌患者進行研究，發現CD44+/CD24-乳腺癌干細胞早期就可以在轉移性胸腔積液中檢測到，并且多數早期擴散至骨髓的乳腺癌細胞都具有腫瘤干細胞的表型特征，與此同時，乳腺癌中CD44+細胞比例升高與不良預后相關。急性髓性白血病中，確診時較高的腫瘤干細胞比例多預示治療后較多的微小殘余癌細胞和較差的預后。
[0004]針對CSC的治療策略可改善腫瘤患者生存預后，是未來治療進展的突破口。如靶向治療藥物伊馬替尼對分化活躍和成熟的白血病細胞效果較好，但對處于靜止狀態，未分化的腫瘤干細胞的作用較差，治療后仍多見復發，聯合針對CSC自我更新和多向分化相關的Hedgehog信號通路抑制 劑的藥物可能消除伊馬替尼治療引起的耐藥和復發。靶向治療藥物曲妥珠單抗對乳腺癌干細胞也發揮作用，具有減少體外克隆球形成，可以使得轉移性乳腺癌患者的生存期延長I年左右。局部晚期乳腺癌患者新輔助化療后，⑶44+/⑶24-/lOW乳腺癌CSC比例較化療前明顯升高，而針對EGFR的靶向藥物拉帕替尼治療后，CSC比例卻較化療前下降，患者生存期與腫瘤干細胞變化明顯相關。
[0005]中醫藥治療惡性腫瘤具有增效減毒、緩解癥狀、改善生活質量、延長生存期的作用，臨床常表現為患者長期帶瘤生存，這常是中藥治療的優勢所在。胰腺癌的預后極差，5年生存率一直徘徊在5%左右。近10年的中西醫綜合治療晚期胰腺癌顯示出了明顯的優勢，5年生存率可達8.4%，中位生存期7.6月，療效明顯優于目前國內外同類研究先進水平，其中16例患者獲得3年以上長期帶瘤生存(5例生存超過5年)，至今仍然存活良好，這在國內外均屬罕見。由此可見，中藥制劑在維持晚期腫瘤患者長期帶瘤生存方面有很大的優勢，可能與調控胰腺癌干細胞的功能有關。
[0006]鑒于此，通過臨床經驗總結及實驗研究，探索出一種調控胰腺癌干細胞的中藥復方制劑顯得尤為重要。
【發明內容】
[0007]為了彌補上述藥物和敷料的不足，發明人經過多年的研究，根據我國傳統中醫藥濕熱毒蘊病機理論，針對胰腺癌“濕熱”和“熱毒”的病理特點，以“清熱化濕，散結解毒”為組方原則，提出一種能夠對抑制胰腺癌有很好的療效，通過調控胰腺癌干細胞發揮作用的調控胰腺癌干細胞的中藥復方制劑。
[0008]本發明的復方制劑采用中藥材或所述中藥材的提取物:蛇六谷、白花蛇舌草、半枝蓮、絞股藍、白豆蘧、生(或炒)米仁、靈芝配制而成，其中:
[0009]半枝蓮:清熱解毒、利濕消腫為君
[0010]白花蛇舌草、蛇六谷:清熱解毒、化痰散積為臣；
[0011]絞股藍、生(或炒)米仁、靈芝:化濕健脾、扶助正氣、提高機體的免疫功能，增強患者自身的防癌、抗癌能力，為佐；
[0012]白豆蘧:化濕和胃、行氣寬中為使；。
[0013]諸藥合用，發揮清熱化濕、解毒化積之功效。
[0014]本發明制劑的各組分按下述重量比的中藥材或所述中藥材的提取物制備:
[0015]半枝蓮15~300g、蛇六谷10~200g、白花蛇舌草10~300g、絞股藍30~300g、白豆蘧5~100g、生(炒)米仁30~300g、靈芝10~300g。
[0016]本發明中藥復合制劑可采用以下兩種方法制備:
[0017]制備工藝1:
[0018]將上述中藥組分的中藥材根據病情按比例用量置于鍋中，第一次按中藥組分總重8倍加水，加熱煎煮2小時，得一煎液；第二次按中藥組分總重6倍加水，加熱煎煮I小時，得二煎液。然后將一煎液和二煎液合并，采用文火蒸發濃縮至稠厚狀。再加入95%的等量乙醇，充分混勻，放置過夜，使其沉淀，次日取其上清液，蒸餾回收乙醇，濃縮后靜置24小時，使沉淀完全過濾，濾液再濃縮至稠厚狀(比重為1.32/25°C)。取濃縮膏1份，干燥蔗糖粉3份，糊精1.25份，用70%乙醇調整干濕度，然后用顆粒機12目篩制成顆粒，將濕顆粒置低溫干燥處，使其干燥，包裝后即可。
[0019]或，制備工藝2:
[0020]將所述中藥組分中的7味藥材飲片，先分別單獨分兩次煎煮，經濾過、濃縮、噴霧干燥、加適量麥芽糊精、粉碎混勻后制成中間體(制成顆粒)，最后將等量7味中藥材的所述的中間體混合均勻，制粒，得成品；
[0021 ] 其中，分別制備組分中的7味藥材飲片的中間體(制成顆粒)，
[0022]1、半枝蓮15000g，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體；
[0023]2、白花蛇舌草15000g，加水煎煮二次，每次I小時,合并煎液,濾過,濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加入麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒1000g，得所述的中間體；
[0024]3、蛇六谷lOOOOg，加水煎煮二次，第一次I小時，第二次I小時，合并煎液，濾過，濾
液濃縮至相對密度為1.10~1.12 (60°C)的清膏，噴霧干燥，加入麥芽糊精適量，混勻，制粒，干燥，制成顆粒1000g，得所述的中間體；
[0025]4、取生(炒)米仁20000g，加水煎煮二次，一煎I小時，二煎0.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體；
[0026]5、絞股藍lOOOOg，加水煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體；
[0027]6、靈芝12000g，加水煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體；
[0028]7、豆蘧配方顆粒制備工藝:取豆蘧lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成1000g顆粒，得所述的中間體；
[0029]最后將等量7味中藥材的所述的中間體混合均勻，制粒，得本發明的復方制劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為實驗設計思路示意圖。
[0031]圖2為本發明作用于SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠瘤體生長曲線示意圖。
[0032]圖3為本發明作用于SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠體重的變化示意圖。
[0033]圖4為本發明及其他治療組干預SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠后瘤體照片。
[0034]圖5為本發明對胰腺癌干細胞的調控作用示意圖。
[0035]圖6為本發明對胰腺癌干細胞的調控作用示意圖。
[0036]圖7為本發明干預后胰腺癌干細胞相關標志物mRNA水平的變化示意圖。
[0037]圖8為各中藥組分的制備工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0038]實施例1
[0039]按下述重量比的中藥材或所述中藥材的提取物制備中藥復方制劑:
[0040]半枝蓮15~300g、蛇六谷10~200g、白花蛇舌草10~300g、絞股藍30~300g、白豆蘧5~100g、生(炒)米仁30~300g、靈芝10~300g。
[0041]將上述中藥組分的中藥材根據病情按比例用量置于鍋中，第一次按中藥組分總重8倍加水，加熱煎煮2小時，得一煎液；第二次按中藥組分總重6倍加水，加熱煎煮I小時，得二煎液。然后將一煎液和二煎液合并，采用文火蒸發濃縮至稠厚狀。再加入95%的等量乙醇，充分混勻，放置過夜，使其沉淀，次日取其上清液，蒸餾回收乙醇，濃縮后靜置24小時，使沉淀完全過濾，濾液再濃縮至稠厚狀(比重為1.32/25°C)。取濃縮膏1份，干燥蔗糖粉3份，糊精1.25份，用70%乙醇調整干濕度，然后用顆粒機12目篩制成顆粒，將濕顆粒置低溫干燥處，使其干燥，包裝后即得本發明中藥復合制劑。
[0042]實施例2
[0043]將所述中藥組分中的7味藥材(飲片)半枝蓮、蛇六谷、白花蛇舌草、絞股藍、白豆蘧、生(炒)米仁、靈芝，先分別單獨分兩次煎煮，經濾過、濃縮、噴霧干燥、加適量麥芽糊精、粉碎混勻后制成中間體(制成顆粒)，最后將等量7味中藥材的所述的中間體混合均勻，制粒，得成品；[0044]其中，分別制備組分中的7味藥材(飲片)的中間體(制成顆粒)(如圖8所示)，
[0045]1、半枝蓮15000g，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體；
[0046]2、白花蛇舌草15000g，加水煎煮二次，每次I小時,合并煎液,濾過,濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加入麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒1000g，得所述的中間體；
[0047]3、蛇六谷10000g，加水煎煮二次，第一次I小時，第二次I小時，合并煎液，濾過，濾
液濃縮至相對密度為1.10~1.12 (60°C)的清膏，噴霧干燥，加入麥芽糊精適量，混勻，制粒，干燥，制成顆粒1000g，得所述的中間體；
[0048]4、取生(炒)米仁20000g，加水煎煮二次，一煎I小時，二煎0.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒1000g，得所述的中間體；
[0049]5、絞股藍lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體；
[0050]6、靈芝12000g，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體；
[0051]7、豆蘧配方顆粒 制備工藝:取豆蘧lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成1000g顆粒，得所述的中間體；
[0052]最后將等量7味中藥材的所述的中間體混合均勻，制粒，得本發明的復方制劑。
[0053]實施例3本發明對SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠瘤體有明顯的抑制作用
[0054]1.SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠模型建立:取生長良好的SW1990胰腺癌細胞，調整濃度為107/ml的SW1990單細胞懸液。在無菌條件下，用Iml注射器接種于裸鼠左腋下皮下，接種量為0.2ml/只，共48只。隨機分為對照組10只、SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠模型組38只。將SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠模型組50只裸鼠經75mg/Kg濃度的吉西他濱腹腔注射dl，d5，d9干預3次后，處死對照組及10只SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠模型組裸鼠，取瘤。將剩余28只SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠模型組裸鼠隨機分為生理鹽水組、吉西他濱組、本發明組、吉西他濱+本發明組，每組7只。各組分別繼續干預4周后，處死取瘤。
[0055]藥物干預:
[0056]生理鹽水組:生理鹽水，每次灌胃0.1ml，每天I次。
[0057]本發明組方:由半枝蓮15~300g、蛇六谷10~200g、白花蛇舌草10~300g、絞股藍30~300g、白豆蘧5~100g、生(炒)米仁30~300g、靈芝10~300g組成，按《中藥藥理研究方法學》人鼠等效劑量進行劑量換算，成人體重以60kg計算，小鼠體重以20g計算，清胰化積方為155g/帖/人/日，則人鼠等效劑量為36g/kg/只/日，濃縮為每毫升含生藥
3.6g/ml的藥液，置于4°C冰箱保存，每次灌胃0.2ml，每天I次。[0058]吉西他濱組:吉西他濱注射液(LILLY FRANCES,劑型:200mg/支)，每只小鼠按50mg/kg,0.2ml/次,第 1,8,15 天腹腔注射；
[0059]吉西他濱+本發明組:吉西他濱給藥方式同上，本發明給藥方式同上。
[0060]2抑瘤作用實驗
[0061]2.1腫瘤生長曲線
[0062]造模后第7天用游標卡尺測量腫瘤大小，測量其長徑㈧和垂直橫徑⑶，之后每周測量一次。按公式v=0.52XAXB2計算腫瘤體積，描繪腫瘤體積增長曲線。
[0063]2.2抑瘤率
[0064]脫頸處死，剝離瘤塊，稱取瘤重,計算抑瘤率:抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重一治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重X 100%。結果顯示，本發明對SW1990胰腺癌干細胞荷瘤小鼠瘤體有明顯的抑制作用，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P〈0.05)。見圖5。
[0065]實施例4本發明對胰腺癌干細胞的調控作用
[0066]l.ffestern blot法檢測本發明干預后胰腺癌干細胞相關標志物蛋白水平的變化Western blot組織總蛋白的制備及濃度測定:取IOOmg腫瘤組織,充分研磨，PBS洗漆離心沉淀，5倍體積4% SDS重懸、攪勻，沸水浴中加熱10分鐘，反復吹打剪切，室溫1000Orpm離心10分鐘，上清液移至另一管，即為提取好的蛋白質，Lowry法檢測蛋白質濃度，從標準曲線上讀出抽提蛋白質對應的吸 光值和濃度。Western blotting:固定:蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并從凝膠上轉移到PVDF膜上；封閉:取下PVDF膜，在盛有封閉液的玻璃平皿中室溫平緩搖動I~2小時后，4°C過夜；與第一抗體結合；與第二抗體結合；顯色:將PVDF膜放入檢測緩沖液中平衡5分鐘，在2ml檢測緩沖液中加入40 μ I底物，按膜面積
0.1ml/cm2的量加人玻璃平皿中，放入PVDF膜，放入塑料袋中，并塑封，暗中顯色lh，棄去顯色液，將膜用TE洗滌2次，在TE中浸泡。觀察并分析實驗結果。
[0067]結果表明本發明干預胰腺癌干細胞后腫瘤干細胞相關標志物⑶24，⑶44，ALDH1A1，⑶133，0CT4, Nanog, S0X2等在蛋白水平有不同程度的下降。見圖6。
[0068]2.Real-time PCR法檢測本發明干預后胰腺癌干細胞相關標志物mRNA水平的變化總RNA的提取:參照GENERAY公司總RNA抽提試劑盒(Trizol-離心柱型)使用說明進行RNA抽提后，取I μ I RNA溶液，用雙蒸水稀釋至100 μ 1，經紫外分光光度儀檢測其0D260及0D280并計算其RNA濃度(C = 0D260X40X稀釋倍數X 10 — 3，單位:μ g/μ I);用DEPC水調整RNA濃度至I μ g/ μ 1，置一 70°C冰箱保存。逆轉錄合成cDNA (RT):具體操作參照Fermentas^RevertAidTM^irst strand cDNA synthesis Kit，，，_20oC保存。SYBR GREEN法實時半定量 RT-PCR:realtime PCR 反應體系:SYBR premix (2x) 12.5ul，上游引物(IOumol/L) 0.5ul，下游引物(10umol/L) 0.5ul，模板 cDNA2.0ul，DEPC 水 9.5ul,總體積 25ul。PCR反應條件:95°C熱啟動15分鐘之后，94°C變性30秒，53°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共40個循環，至4°C結束。
[0069]P0U5F1 (0CT4)引物 F:5，-GAGCAACTCCGATGGGGCCT-3，
[0070]R:5’-TGTCCTGGGACTCCTCCGGGT-3’
[0071 ] Nanog 引物 F: 5，-GCAATGGTGTGACGCAGAAGGC-3，
[0072]R:5’-TGGGTCTGGTTGCTCCAGGTTG-3’
[0073]S0X2 引物 F: 5，-GGGGGAAAGTAGTTTGCTGCCTCT-3’[0074]R:5’-TGCCGCCGCCGATGATTGTT-3’
[0075]GLII 引物 F: 5，-AGGGAGTGCAGCCAATACAG-3’
[0076]R:5’-ATTGGCCGGAGTTGATGTAG-3’
[0077]結果表明本發明干預胰腺癌干細胞后腫瘤干細胞相關標志物0CT4, Nanog, S0X2, GLIl等在mRNA有不同程度的下降(如圖7所示)。
【權利要求】
1.一種調控胰腺癌干細胞的中藥復方制劑，其特征在于:由下述重量比的中藥材或所述中藥材的提取物及藥物輔料組成:半枝蓮15~300g、蛇六谷10~200g、白花蛇舌草10~.300g、絞股藍30~300g、白豆蘧5~100g、生(炒)米仁30~300g、靈芝10~300g。
2.權利要求1所述的調控胰腺癌干細胞的中藥復方制劑的制備方法，其特征在于:所述中藥組分按重量比用量置于鍋中，第一次按中藥組分總重8倍加水，加熱煎煮2小時，得一煎液；第二次按中藥組分總重6倍加水，加熱煎煮I小時，得二煎液，然后將一煎液和二煎液合并，采用文火蒸發濃縮至稠厚狀，再加入95%的等量乙醇，充分混勻，放置過夜，使其沉淀，次日取其上清液，蒸餾回收乙醇，濃縮后靜置24小時，使沉淀完全過濾，濾液再濃縮至稠厚狀，比重為1.32/25°C，取濃縮膏1份，干燥蔗糖粉3份，糊精1.25份，用70%乙醇調整干濕度，然后用顆粒機12目篩制成顆粒，將濕顆粒置低溫干燥處，使其干燥，包裝后即得。
3.權利要求1所述的調控胰腺癌干細胞的中藥復方制劑的制備方法，其特征在于:將所述中藥組分中的7味藥材飲片，先分別單獨分兩次煎煮，經濾過、濃縮、噴霧干燥、加適量麥芽糊精、粉碎混勻后制成顆粒中間體，最后將等量7味中藥材的所述的中間體混合均勻，制粒，得成品； 其中，分別制備組分中的7味藥材飲片的顆粒中間體， 半枝蓮15000g，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為.1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體； 白花蛇舌草15000g，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加入麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體； 蛇六谷lOOOOg，加水煎煮二次，第一次I小時，第二次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.10~1.12 (60°C)的清膏，噴霧干燥，加入麥芽糊精適量，混勻，制粒，干燥，制成顆粒1000g，得所述的中間體； 取生(炒)米仁20000g，加水煎煮二次，一煎I小時，二煎0.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒1000g，得所述的中間體； 絞股藍lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為.1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體； 靈芝12000g，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為.1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒lOOOg，得所述的中間體； 豆蘧配方顆粒制備工藝:取豆蘧lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1.10-1.12 (600C )的清膏，噴霧干燥，粉碎，加麥芽糊精適量，混勻，制成1000g顆粒，得所述的中間體； 最后將等量7味中藥材的所述的中間體混合均勻，制粒，得本發明的復方制劑。
【文檔編號】A61K9/16GK103800731SQ201210437189
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月5日 優先權日:2012年11月5日
【發明者】劉魯明 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫院