專利名稱：Crisp3蛋白在前列腺癌診斷和治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及臨床應用領域，具體地說，是CRISP3蛋白在前列腺癌診斷和治療中的應用。
背景技術：
前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤，95%發生于60歲以上老年人。隨著人口老齡化，我國每年有7-8萬名前列腺癌新增病例，發病率以每年25%-30%的速度增長，成為發病率增加最快的惡性腫瘤。有關研究提示，如果沒有辦法控制，10年后前列腺癌患者有可能達到10萬人里有60到70個。無疑，前列腺癌已日益成為危害老年男性健康的重大疾病。
前列腺癌早期多無任何癥狀，當腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增生相混淆。故而，約80%的病人首先發現遠處轉移病灶，然后才發現前列腺癌。此時，病變已經屬晚期，預后不良，生存期短。顯然，前列腺癌療效的保證高度依賴于腫瘤的早期準確診斷。自從1987年以來，血清前列腺特異性抗原(PSA)—直是前列腺癌臨床診斷的腫瘤標志物，PSA聯合病理診斷有助于前列腺癌臨床分期和評估。但是，幾十年來時臨床診斷實踐表明該技術的性能具有明顯的局限性，尤其無法做到早期診斷。除了前列腺腫瘤外，前列腺炎和良性前列腺增生也可導致血清PSA升高。另一方面，大約有15% -20 %的前列腺癌患者可顯示一個正常的血清PSA值。另一方面，目前臨床上對前列腺癌采用的三種經典治療方法(根治性前列腺切除術、抗雄性激素治療和放療)盡管在疾病初期非常有效，但是不能殺死腫瘤組織的所有腫瘤細胞。病人在接受這些經典療法后，隨著時間的推移，殘留的、對經典療法不敏感的腫瘤細胞日后成瘤、遷移、增殖，從而引起前列腺癌的復發、轉移及惡化，最終導致病人死亡。目前國內對前列腺癌的研究較少，往往局限于某些特異基因的表達水平。國外的研究已經多年，但前列腺癌抗經典療法及惡化轉移的機制目前尚不清楚。臨床上的藥物治療，除了抗雄性激素療法外，尚無其它有效藥物。大多基礎研究注重于原癌基因的激活和抑癌基因的失活、生長因子及受體、及調控細胞凋亡的研究。但是到目前為止，尚未開發出特別有效的治療前列腺癌的藥物。前列腺癌個體化診治也面臨能否開發比PSA更可靠的早期檢測方法和抗雄性激素療法之外新的治療藥物等重大課題。CRISP3,富含半胱氨酸分泌蛋白 3 (Cysteine-rich secretory protein 3),屬于富含半胱氨酸分泌蛋白CRISP家族。CRISPl和CRISP2與精子發育及精子和卵子融合相關。哺乳動物人類、小鼠、馬中CRISP3基本上是唾液腺產物，但在人類中分布相比之下更廣泛一些，CRISP3轉錄物也在其他外分泌腺體和器官中被發現，如胰腺、附睪、卵巢、結腸和骨髓。已經從外周血中性粒細胞中分離純化CRISP3，其亞細胞定位也被確定，是位于分泌顆粒中。CRISP3也存在于精漿、唾液和血漿中。在精漿中CRISP3和beta微精蛋白(MSMB)結合，MSMB是alphalB糖蛋白(AlBG)的配體，AlBG屬于免疫球蛋白超家族。CRISP3在外分泌途徑中包括粘液膜和吞噬細胞分泌顆粒上的定位，以及CRISP3在唾液腺和胰腺慢性炎癥中上調，提不其可能在免疫系統中起作用。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供CRISP3蛋白在制備診斷前列腺癌的產品中的應用。本發明的第二個目的是，提供CRISP3蛋白在制備治療前列腺癌的藥品中的應用。
本發明的第三個目的是，提供CRISP3中和抗體在制備診斷前列腺癌的產品中的應用。本發明的第四個目的是，提供CRISP3中和抗體在制備治療前列腺癌的藥品中的應用
為實現上述目的，本發明采取的技術方案是CRISP3蛋白在制備診斷前列腺癌的產品中的應用。所述的診斷前列腺癌的產品以CRISP3蛋白作為診斷標記物。所述的診斷前列腺癌的產品是診斷試紙或試劑盒。所述的診斷前列腺癌的產品的診斷樣品是前列腺分泌液或前列腺組織。為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是CRISP3蛋白在制備治療前列腺癌的藥品中的應用。所述的治療如列腺癌的藥品以CRISP3蛋白作為治療革巴標。為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是CRISP3中和抗體在制備診斷前列腺癌的產品中的應用，所述的診斷前列腺癌的產品以CRISP3蛋白作為診斷標記物。所述的診斷前列腺癌的產品是診斷試紙或試劑盒，所述的診斷前列腺癌的產品的診斷樣品是前列腺分泌液或前列腺組織。為實現上述第四個目的，本發明采取的技術方案是CRISP3中和抗體在制備治療前列腺癌的藥品中的應用。本發明優點在于
1、本發明發現了診斷前列腺癌的新的診斷標記物，CRISP3在前列腺癌細胞中特異表達，它可作為前列腺液的臨床診斷生物標記物，將比目前應用的血液PSA更準確地診斷前列腺癌；
2、本發明發現了前列腺癌的新的治療靶標，CRISP3直接參與了前列腺癌細胞的分裂、生長，可作為一個新的治療前列腺癌的靶標。
圖I.人前列腺癌樣品中CRISP-3的表達水平。圖2.人前列腺組織芯片免疫組化。圖3.CRISP3分泌蛋白在臨床患者前列腺液中的含量。圖4.人CRISP3蛋白促進LNCaP細胞的生長。圖5.hCRISP3抗體能抑制被CRISP3促進生長的1025細胞的擴增。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例實驗一、TaqMan實時定量 RT-PCR 實驗材料正常前列腺、前列腺癌樣本；
CRISP3 探針 /CRISP3 引物序列Hs00195988_ml (Invitrogen 貨號4331182)；
內參(GAPDH)探針序列5’ -TTCCTACCCCCAATGTGTCCGTCGT-3’ (SEQ ID NO. I)；
內參(GAPDH)引物序列5’ -ACTGGCATGGCCTTCCG -3’ (SEQ ID NO. 2),5’ -CAGGCGGCACGTCAGATC -3’ (SEQ ID NO. 3)。實驗方法
1.采用RNeasy試劑盒(Qianen,Valencia，CA),從前列腺組織中提取總RNA。運用 TaqMan實時定量RT-PCR技術，檢測CRISP3基因的表達水平。選用管家基因GAPDH作為內參。TaqMan實時定量RT-PCR在ABI 7900實時定量PCR儀上進行。另外，采用電泳凝膠方法確定擴增的的PCR產物的特異性(結果未顯示)。2.用ACt方法以內參GAPDH的表達水平標準化CRISP3基因的表達水平。每個數據重復三次，計算標準誤差。Normal Prostate為正常前列腺；T1-T9為前列腺癌樣本。實驗結果見圖1，圖I是CRISP3分泌蛋白在9個前列腺癌樣本(Τ1-Τ9)的6個中高表達。與正常前列腺(Normal Prostate)相比，CRISP3表達在前列腺癌樣本中可升高5至57倍。實驗二、免疫組化
實驗材料正常前列腺組織、前列腺癌組織；一抗為羊抗人CRISP3抗體(R&D貨號AF2397)，二抗驢抗羊 Dylight594 抗體(Jackson lab 貨號705-515_147)。實驗方法
組織芯片就是將大量組織樣品有序地組合在一個微小基片表面，借助免疫組織化學的方法進行檢測。I、將組織用PFA固定液固定5分鐘，PBS洗10分鐘
2、抗原修復用0.OlM檸檬酸鹽溶液暴露抗原決定族。微波爐高火3分鐘加熱修復液至沸騰(4分鐘)，再連續低火微波I分鐘、兩次。冷卻至室溫，PBS洗10分鐘。用0.5%的Triton破膜10分鐘。3、封閉非特異性蛋白
1)PBS浸泡3分鐘X3次
2)3% H2O2-甲醇(30% H2O2IOml+甲醇90ml)室溫浸泡30分鐘
3)自來水沖洗10分鐘，PBS浸泡3分鐘X3次，甩干或紙巾吸去多余液體(勿碰到組織)，用組化筆在組織周圍畫上圈(蒸餾水沖洗時間內配好10%封閉血清)
4)在圓圈內組織內迅速滴入5%BSA (用PBS配制)，封閉非特異性抗原(勿讓組織干燥，應在紙巾吸掉水后立即加入)，室溫30分鐘(配好一抗)，扣掉封閉液，不洗。4、一抗孵育
甩去切片上的BSA，用濾紙擦干組織周圍殘留BSA，直接加入已稀釋的羊抗人CRISP3抗體(約60μ 1)，放入濕盒中4°C過夜。第二天從冰箱中取出需37 °C復溫30 min。5、二抗孵育I)將一抗洗掉，將玻片插入塑料玻片架，然后整個放入塑料盒中，加PBS浸泡放于微型振蕩器上洗10分鐘。2) 用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入二抗驢抗羊Dylight594抗體，室溫30分鐘。3)加PBS浸泡放于微型振蕩器上洗10分鐘。6、封片
紙巾吸除多余液體，在玻片上滴管滴加DAPI封片液一滴,然后蓋上蓋玻片，用鑷子輕輕擠壓，并趕走氣泡，(組織部位切勿殘留小氣泡)，室溫放置I小時。觀察。實驗結果見圖2，組織芯片免疫組化染色顯示CRISP3分泌蛋白在49個前列腺癌組織的31個中呈明顯陽性，而在正常組織中為陰性。實驗三、酶聯免疫吸附實驗(Elisa)
實驗材料CRISP3標準液(R&D貨號2397-CR)、CRISP3羊抗體(R&D貨號AF2397)、抗羊抗體(R&D貨號HAF017)、底物(包括A和B) (R&D貨號DY999)
實驗方法
I. 制作標準曲線準備濃度為200ng/ml的CRISP3蛋白標準液，依次稀釋成20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2. 5ng/ml>I. 25ng/ml、0. 625ng/ml、0. 312ng/ml 的溶液。2. 抗原包被取潔凈的聚苯乙烯微量酶標板，于每孔內加標準品或待測樣品抗原100 μ L，放置室溫2小時。用PBST洗2次。3. 封閉加200μ L封閉液(1%BSA/PBS)于4°C封閉過夜。每孔，用200 μ LPBST洗2次。4. 一抗按1:200稀釋加入一抗100 μ L，放置室溫孵育2小時。用200 μ LPBST洗4次。5. 二抗按1:500稀釋加入酶標二抗100 μ L，放置室溫孵育I小時。用200μ LPBST 洗 4 次。6.加底物顯色加現配的底物液(由A和B以I: I比例配制)100 μ L，置暗處在室溫下15分鐘。加2Ν硫酸50 μ L終止反應。觀察結果在酶標儀450nm下測OD值,參照標準曲線計算,確定樣品中CRISP3蛋
白的含量。實驗結果見圖3，圖3是CRISP3分泌蛋白在臨床患者前列腺液中的含量。與正常、前列腺炎、PSA升高但不是惡性腫瘤患者相比，前列腺癌病人前列腺液中的CRISP3含量成明顯升高趨勢。實驗四、細胞增殖抑制實驗
實驗材料293細胞系(非前列腺癌細胞系)、LNCaP細胞系(前列腺癌細胞系)、CRISP3蛋白(R&D 貨號2397-CR)。實驗方法
I.使用96孔板，每個孔中4000個LNCaP細胞，同時加入不同濃度的CRISP3蛋白液；用293細胞做對照。2. 24小時后加入3H標記的胸腺嘧啶。繼續培養21小時。用胰蛋白酶在37°C下消化f 3分鐘，收獲細胞。
3.采用TOPO Count微板液閃計數儀測量3H標記。每數據從5至24個培養孔測量值平均得到，計算標準誤差，雙尾T檢驗結果。實驗結果見圖4，不同濃度的CRISP3添加于LNCaP前列腺癌細胞系培養基中，均可促進前列腺癌細胞生長。前列腺癌細胞生長與3H胸腺嘧啶的參入量呈正比。293上皮細胞作為陰性對照，其生長不受CRISP3影響。實驗五腫瘤細胞增殖實驗 實驗材料
1025前列腺癌細胞系；
Abl:鼠抗人CRISP3單克隆抗體(R&D貨號=295203)；
Ab2:羊抗人CRISP3單克隆抗體(R&D貨號AF2397)；
Ab3:鼠抗人CRISP3單克隆抗體(R&D貨號295220)；
Ab4:鼠抗人CRISP3單克隆抗體(R&D貨號295208)；
實驗方法
1.使用96孔板，每個孔中4000個1025細胞，培養24小時
2.設計四組實驗
1)空白對照組
2)僅添加不同來源的CRISP3抗體細胞增殖情況與對照組相比沒有顯著變化。3)加入人CRISP3蛋白液組細胞增殖明顯，且與對照組有顯著差異；
4)加入人CRISP3蛋白液和不同來源CRISP3抗體細胞的增殖與對照組相比明顯抑制。3. 24小時后加入3H標記的胸腺嘧啶。繼續培養21小時。用胰蛋白酶在37°C下消化f 3分鐘，收獲細胞。4.采用TOPO Count微板液閃計數儀測量3H標記。每數據從5至24個培養孔測量值平均得到，計算標準誤差，雙尾T檢驗結果。實驗結果見圖5，不同來源的CRISP3抗體添加于1025前列腺癌細胞系，阻斷CRISP3，可不同程度地抑制由外源CRISP3引起的前列腺癌細胞生長。本發明的研究結果顯示CRISP3在前列腺癌組織中比正常前列腺表達高出63倍(圖I);組織芯片免疫組化分析表明CRISP3在多數前列腺癌中明顯陽性(圖2)，而在正常實體組織中，只在唾液腺和乳腺中表達；CRISP3在多數前列腺癌臨床樣本中高表達(圖3)；CRISP3在多數LuCaP移植瘤中高表達。這些實驗結果證明CRISP3可作為診斷和治療新靶點的一個候選生物標記物。采用基因芯片及生物統計學，對前列腺癌組織與其相鄰非癌正常組織分析比較，CRISP3基因在前列腺癌細胞中特異高表達(圖1，3)。更重要的是，本發明進一步的實驗顯示CRISP3可促進前列腺癌細胞生長(圖4)，阻斷CRISP3可抑制前列腺癌細胞生長(圖5);這是目前文獻中尚無報道的。在本發明中CRISP3除了和前列腺癌之間具備相關性之外，與腫瘤的發展發生也是相關的。CRISP3不僅是診斷靶標，而且還可以作為治療的靶點。本發明采用純化的CRISP3蛋白和CRISP3過表達質粒，在前列腺癌細胞系上觀察細胞分裂、細胞遷移和細胞侵潤，并采用抗體，在CRISP3過表達的前列腺癌細胞系和已成功傳代、高表達CRISP3的臨床前列腺癌標本LuCAP35 (圖5)上，體外觀察細胞分裂、遷移和侵潤；移植瘤后體內觀察成瘤、遷移和侵潤。CRISP3中和抗體除用于本研究項目外，該抗體對前列腺癌診斷及治療的效果將可以造福廣大患者，并且產生巨大的社會經濟效益。總結本發明，CRISP3在前列腺癌細胞中特異表達，它可作為前列腺液的臨床診斷生物標記物，將比目前應用的血液PSA更準確地診斷前列腺癌。同時，CRISP3直接參與了 前列腺癌細胞的分裂、生長，可作為一個新的治療前列腺癌的靶標。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.CRISP3蛋白在制備診斷前列腺癌的產品中的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的診斷前列腺癌的產品以CRISP3蛋白作為診斷標記物。
3.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的診斷前列腺癌的產品是診斷試紙或試劑盒。
4.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的診斷前列腺癌的產品的診斷樣品是前列腺分泌液或前列腺組織。
5.CRISP3蛋白在制備治療前列腺癌的藥品中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的治療前列腺癌的藥品以CRISP3蛋白作為治療靶標。
7.CRISP3中和抗體在制備診斷如列腺癌的廣品中的應用，所述的診斷如列腺癌的廣品以CRISP3蛋白作為診斷標記物。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的診斷前列腺癌的產品是診斷試紙或試劑盒，所述的診斷前列腺癌的產品的診斷樣品是前列腺分泌液或前列腺組織。
9.CRISP3中和抗體在制備治療前列腺癌的藥品中的應用。
全文摘要
本發明涉及CRISP3蛋白在制備診斷和治療前列腺癌的產品中的應用。本發明還提供CRISP3中和抗體在制備診斷和治療前列腺癌的產品中的應用。本發明優點在于本發明發現了診斷前列腺癌的新的診斷標記物，CRISP3在前列腺癌細胞中特異表達，它可作為前列腺液的臨床診斷生物標記物，將比目前應用的血液PSA更準確地診斷前列腺癌；本發明發現了前列腺癌的新的治療靶標，CRISP3直接參與了前列腺癌細胞的分裂、生長，可作為一個新的治療前列腺癌的靶標。
文檔編號A61P35/00GK102914658SQ20121040958
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月24日 優先權日2012年10月24日
發明者高維強 申請人:高維強