一種鵝絨藤提取物及其制備方法

專利名稱：一種鵝絨藤提取物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種鵝絨藤提取物，本發明同時涉及該提取物的制備方法及其在治療炎癥相關疾病方面的應用，屬生物醫藥領域。
背景技術：
鵝絨藤(Cynanchum chinense R. Br.)為蘿摩科鵝絨藤屬植物，生于灌木叢，路邊，河畔或田埂上，民間藥用其根及新鮮莖的乳汁，根可祛風解毒、健胃止痛，莖乳外敷治療疣贅，二者具有不同的用途。有文獻報道鵝絨藤全草水提物對試驗動物具有抗驚厥、中樞抑制作用和鎮靜催眠等作用，其中含有蛋白酶、黃酮等成分(馬艷，周鳳琴.民間藥鵝絨藤化學成分、藥理及臨床應用研究概況.中華中醫藥學刊，2010,28 :289-291.),但總體研究報道較少。發明人在前期研究中首次發現鵝絨藤提取物具有一定的抗炎活性，作為一種可再生利用的植物資源，具有進一步研究和開發利用潛力，因而對其提取物中化學成分和含量進 行研究，從而完成了本發明。

發明內容
本發明的目的是提供一種工藝和質量可控的鵝絨藤提取物。本發明提供的鵝絨藤提取物制備方法包括以下工藝步驟(I)選取鵝絨藤屬植物藥材地上部分，采用水或乙醇-水混合溶媒進行提取，濃縮為濃縮液，加適量水稀釋，過濾，得鵝絨藤提取液；(2)由(I)所得鵝絨藤提取液，采用預處理好的大孔樹脂或聚酰胺進行吸附，先用水或0-20%乙醇洗脫，再用40-95%乙醇洗脫，收集40-95%乙醇洗脫液，合并后經濃縮，干燥，即得。所述工藝步驟⑴中鵝絨藤藥材選自鵝絨藤屬植物(參見茍占平，楊永建，趙汝能.甘肅鵝絨藤屬藥用植物資源調查.中草藥，2001,32:69-71)。所述鵝絨藤藥材采用本發明所述分析方法檢測，應含有小麥黃素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷，優選鵝絨藤藥材還含有山奈酹-3-0-β -D-卩比喃葡萄糖苷、小麥黃素,更優選鵝絨藤(Cynanchum chinense R. Br.)。所述提取溶媒可采用常規的水或乙醇-水混合溶媒提取，其中優選50-80%乙醇混合溶媒提取。所述工藝步驟⑵中，所述吸附劑可選用大孔樹脂或聚酰胺，其中優選非極性或弱極性大孔樹脂。洗脫時先用水洗或0-20%乙醇洗脫除去雜質，再用40-95%乙醇洗脫，其中優選采用50-80%乙醇進行洗脫。所述鵝絨藤提取物中，主要含有小麥黃素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷，其含量大于30mg/g ;此外還含有小麥黃素、山奈酚-3-0- β -D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、山奈酚中至少兩種成份。本發明同時對所述鵝絨藤提取物的抗炎作用進行了考察。采用二甲苯致小鼠急性耳腫脹模型試驗，結果表明鵝絨藤乙醇提取物(500mg/kg)、大孔樹脂精制提取物(150mg/kg)、聚酰胺精制提取物(150mg/kg)三種樣品灌藥給藥均具有一定的抗炎作用。因而所述鵝絨藤提取物具有一定抗炎活性，可以作為藥物或藥物組合物應用于相關抗炎藥品中。本發明內容通過大量實驗研究和工藝優化分析完成，并對提取物中活性成分進行了分離鑒定，其中化合物小麥黃素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素為首次從鵝絨藤屬植物中分離得到，并首次對該屬植物中小麥黃素-7-0- β -D-葡萄糖 醛酸苷、山奈酚-3-0- β -D-吡喃葡萄糖苷、小麥黃素進行了定性定量分析，研究結果具有獨創性，并可應用于鵝絨藤藥材及其提取物和相關產品的質量控制。以下述具體實施例進行說明。


附圖為實施例2中鵝絨藤大孔樹脂提取物的液相色譜圖(檢測波長310nm)。圖中，色譜峰1-3依次為I山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷，2小麥黃素-7-0-β -D-葡萄糖
醛酸苷，3小麥黃素。
具體實施例方式本發明所述的鵝絨藤提取物是按以下實施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本領域的技術人員能夠掌握和運用的技術手段。但以下實施例不得理解為任何意義上的對本領域發明權利要求的限制。實施例I :鵝絨藤的提取鵝絨藤地上部分于2010年采自新疆自治區石河子市郊(批次CC20100901)，經鑒定為鵝絨藤(Cynanchum chinense R. Br.)地上部分莖葉。取鵝絨藤地上部分粉末3kg,用8倍量70%乙醇溶液回流提取(2hX3次)，提取液合并，減壓濃縮為流浸膏提取物A(3L)，備用。經HPLC分析，其中小麥黃素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量依次為3. 12,0. 061mg/g。實施例2 :鵝絨藤提取物的制備取實施例I中提取物2L，用水6L分散，調pH7_9，過濾，濾液上AB_8大孔樹脂柱(1000X 100mm i. d.，柱體積2. 0L/BV)，依次用水和10 %、95 %乙醇(各8L)洗脫，95 %乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得鵝絨藤提取物B，共106g。經HPLC分析，其中小麥黃素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量依次為50. 32、I.161mg/g。含量測定采用Agilent 1260 Infinity Series高效液相色譜儀；DAD檢測器,檢測波長 360nm ;色譜柱為 Cosmosil AR-II-C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m);流速 ImL · min S 柱溫35。。。流動相為O. 6%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(O 12min, 18% B ; 12 15min，18% B — 20% B ;15 30min，20% B)。對照品小麥黃素_7_0-β-D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷的回歸方程分別為Y = 601. 36Χ+22. 659 (r = O. 9999)、Y =976. 16X+27. 976 (r = O. 9997)，線性范圍分別為 I. 188-9. 504 μ g, O. 08712-0. 8712 μ g。鵝絨藤提取物B的HPLC色譜圖參見附圖。實施例3 :鵝絨藤提取物的制備取實施例I中提取物O. 8L，用水2. 2L分散，調pH7_9，過濾，濾液上聚酰胺柱(600X40mm i. d.，柱體積400mL/BV)，依次用水和20%、95%乙醇(各8L)洗脫，95%乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得鵝絨藤提取物C，共32g。經HPLC分析，其中小麥黃素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量依次為67. 36、I. 32mg/g。 實施例4 :鵝絨藤提取物中有效成分分離鑒定取實施例I中鵝絨藤提取物B(30g)，經減壓硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯(50 1-1 1)，氯仿-甲醇(10 1-1 I)系統梯度洗脫，依次獲得Fr. I-Fr. 18、Fr. 19-Fr. 30流分。Fr. 6經氯仿重結晶得到十六燒酸化合物I (32mg) ；Fr. 9經甲醇重結晶得到化合物2(32mg) ；Fr. 11中結晶得到化合物3 (80mg) ；Fr. 12重結晶得化合物4 (25mg)；Fr. 15流分經LX2000樹脂柱甲醇-水(3 7-7 3)梯度洗脫，S^hadex LH-20甲醇洗脫，得到化合物5 (15mg)，化合物6 (12mg) ；Fr. 16通過LX2000樹脂柱甲醇-水(3 7-7 3)梯度洗脫，50%甲醇洗脫部位，經甲醇重結晶得到化合物7 (30mg) ；Fr. 18流分經LX2000樹脂柱甲醇-水(3 7-7 3)梯度洗脫，Sephadex LH-20甲醇洗脫，得到化合物8 (15mg)。Fr. 22-26合并，經LX2000樹脂甲醇-水(2 8-7 3)梯度洗脫，得到化合物9 (50mg)。化合物結構鑒定采用NMR、HRESIMS等波譜學技術，和已知物數據對照，鑒定各化合物依次為十六烷酸(1)，水楊酸(2)、β-谷甾醇(3)、β-胡蘿下苷(4)、芹菜素(5)、山奈酌· (6)、小麥黃素(7)、山奈酌·-3-0-β-D-卩比喃匍萄糖昔(8)、小麥黃素-7-0-β-D-匍萄糖醛酸苷(9)。其中化合物5、8、9首次從本屬植物中分離得到；1、2、5 9為首次從本植物中分離得到。化合物7-9測試數據如下。化合物7:化合物 VIII 黃色針晶(甲醇),1H-Nmr(Dmso^oomHz) δ 2.97(ih, s’5-0H)，7· 31 (2H, s, H_2'，6' )，6· 97 (1H, s’ H_3)，6· 55 (1H, d, J = 2. OHz, H_8)，6· 20 (1H,d, J = 2. 0Hz, H-6) ,3. 88 (6H, s，2X_0CH3)。13C-匪 R (DMSO，100MHz) δ :181. 8(C_4)，164. 2 (C-7)，163. 7 (C_2), 161. 4 (C_9)，157. 4 (C_5)，148. 2 (C_3 '，5 ' )，139. 8 (C_4 ')，120. 4(C-1 ' )，104.3(C-2 '，6 ' )，103. 7 (C—10)，103. 6 (C_3)，98. 9 (C_6)，94. 2 (C_8)，56. 4 (-OCH3) 0以上數據與文獻基本一致(吳海峰，宋志軍，朱華結，等.藏藥紅花綠絨蒿的化學成分.天然產物研究與開發，2011，23 :202)，鑒定為小麥黃素。化合物8 :黃色結晶(甲醇)，Molish反應陽性，薄層酸水解檢出葡萄糖，IH-匪R(DMS0，400MHz) δ 12. 62(1H, s，5-0Η)，10. 88(1Η，br s，7-0Η)，10. 20(1Η，br s,4' -OH), 8. 03 (2H, d, J = 8. 8Hz, H-2 ;，6' ) ,6. 87 (2H, d, J = 8. 8Hz, H-3 ;，5')，
6.43 (1H, d, J = I. 9Hz, H_8)，6. 20 (1H, d, J = I. 9Hz, H-6)，5. 46 (1H, d, J = 7. 2Hz,H-l" )。13C-NMR(DMS0，100MHz) δ 177. 4 (C-4), 164. 2 (C-7) ,161.1 (C-5), 159. 8 (C-4;)，156. 3 (C-9), 156. 2 (C-2), 133. 2 (C-3), 130. 7 (C-2 ;，6' ),120.4(01' ),115.0(03'，5' )，103. 9(C-10)，100. 9(C-1" )，98. 6 (C_6)，93. 5 (s，C_8)，74. 2 (C_2" ), 76. 4 (C-3;/ )，77. 3 (C-5 " ), 69. 9 (C-4 " )，60.8(C_6")。以上數據與文獻基本一致(翁裕馨，劉占厚，陳湘宏.達烏里胡枝子化學成分研究.安徽農業科學，2011，39 :15281)，鑒定為山奈酚-3-0- β -D-吡喃葡萄糖苷。化合物9 :黃色粉末(甲醇)，IH-NMR (DMS0,400ΜΗζ) δ :12. 95 (1H, s，5_0H)，
7.36 (2H, s，H-2'，6' ),7. 04 (1H, s’ H_3)，6. 91 (1H，d, J = 2. IHz, H_8)，6. 49 (1H，t, J=2. IHz, H-6), 5. 25 (1H, d, J = 7. 2Hz, H_l" )，3. 89 (6H, s，2X_0CH3)。13C_NMR(DMS0，100MHz) δ :181. 9(C-4)，169. 9 (C-6 " ),164. I(C-2),162.5 (C-7), 161. I(C-5),156. 8 (C-9), 148. 2 (C-3 '，5 ' )，140.2(C_4 ' )，120.2(C_1 ' ), 105. 4 (C-IO),104. 7 (C-2 ' ,6 ' ), 103. 8 (C-3), 99. 4 (C-6), 99. 3 (C-l " )，95. 0 (C_8)，75. 7 (C_5 ")，75. 2 (C-3 ;/ ),72.8 (C-2 ;/ ),71. 2 (C-4 ;/ )，56. 4 (-OCH3)。以上數據與文獻基本一致(Jun-Gang Yin, Cheng-Shan Yuan, Zhong-Jian Jia. A new iridoid and other chemicalconstituents from Pedicularis kansuensis forma albifIora Li. Arch Pharm Res,2007，30 :431-435)，鑒定為小麥黃素_7_0- β -D-葡萄糖醛酸苷。實驗例I :鵝絨藤提取物的抗炎作用考察取20_25g小鼠50只，雌雄各半，分為鵝絨藤提取物A組(500mg/kg)、鵝絨藤提取物B組(150mg/kg)、鵝絨藤提取物C組(150mg/kg)、吲哚美辛對照組(20mg/kg)和模型組五組，預灌藥一周。最后一次灌藥2小時后，用二甲苯25微升均勻涂于小鼠右耳，半小時后處死小鼠，用直徑6_打孔器，取小鼠的左右耳相同部位，用分析天平稱重。取下的右耳減 去左耳重量為腫脹度，計算對照組和給藥組的均值與標準差，t檢驗比較組間差異顯著性。按下式求出腫脹抑制率腫脹抑制率(％ ) = [I-給藥組平均腫脹度/模型組平均腫脹度]X 100%結果鵝絨藤提取物A組(500mg/kg)、鵝絨藤提取物B組(150mg/kg)、鵝絨藤提取物C組(150mg/kg)對二甲苯所致小鼠耳廓急性炎癥有一定的抑制作用，腫脹抑制率依次為17. 6,24. 1,26. 3(% )。
權利要求
1.一種鵝絨藤提取物，特征在于所述鵝絨藤提取物由以下步驟制備獲得 (1)選取鵝絨藤屬植物藥材地上部分，采用水或乙醇-水混合溶媒進行提取，濃縮為濃縮液，加適量水稀釋，過濾，得鵝絨藤提取液； (2)由(I)所得鵝絨藤提取液，采用預處理好的大孔樹脂或聚酰胺進行吸附，先用水或0-20%乙醇洗脫，再用40-95%乙醇洗脫，收集40-95%乙醇洗脫液，合并后經濃縮，干燥，即得。
2.根據權利要求I的鵝絨藤提取物，特征在于所述鵝絨藤提取物中含有小麥黃素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷中至少一種成份。
3.根據權利要求2的鵝絨藤提取物，特征在于所述鵝絨藤提取物中還含有小麥黃素、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、山奈酚中至少兩種成份。
4.根據權利要求2的鵝絨藤提取物，特征在于所述鵝絨藤提取物中小麥黃素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷含量大于30mg/g提取物。
5.根據權利要求I的鵝絨藤提取物，特征在于所述步驟(I)中采用50-80%乙醇進行提取。
6.根據權利要求I的鵝絨藤提取物，特征在于所述步驟(2)中采用大孔樹脂進行吸附。
7.根據權利要求I的鵝絨藤提取物，特征在于所述步驟(2)中采用聚酰胺進行吸附。
8.根據權利要求I的化合物，特征在于所述步驟(2)中優選采用50-80%乙醇進行洗脫。
9.根據權利要求I的鵝絨藤提取物及其組合物在藥品中的應用，特征在于所述鵝絨藤提取物具有抗炎作用。
全文摘要
本發明公開了一種鵝絨藤提取物及其制備方法，所述制備方法包括以下步驟(1)選取鵝絨藤屬植物藥材地上部分莖葉，采用水或乙醇-水混合溶劑進行提取，提取液濃縮，過濾；(2)提取液采用大孔樹脂或聚酰胺進行吸附，用乙醇-水混合溶媒進行梯度洗脫，收集相應目標產品洗脫部位，濃縮，干燥，即得。所述鵝絨藤提取物中含有小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，含量大于30mg/g；并含有小麥黃素、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、山奈酚中至少兩種成份。本發明所述植物資源可再生利用，工藝路線經濟合理、效率高、能耗低，溶劑便于回收和循環利用，容易實現工業化生產。所述鵝絨藤提取物具有抗炎作用，可應用于相關抗炎藥品中。
文檔編號A61P29/00GK102846689SQ20121038471
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月12日 優先權日2012年10月12日
發明者劉江云, 陳虹, 馮建勇, 楊世林 申請人:蘇州世林醫藥技術發展有限公司