專利名稱：基因在腦膠質瘤細胞的抑制與凋亡中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及了一種人源而/7的新用途。特別是人源而/7基因在腦膠質瘤細胞的抑制與凋亡中的應用。
背景技術：
腦膠質瘤(glioma)是由神經外胚層分化而來的膠質細胞(星形膠質細胞、少突膠質細胞和室管膜等)發生的腫瘤。膠質瘤在顱內腫瘤中發病率位于第一位，約占45%左右。膠質瘤的治療問題是神經外科中較為棘手的一個問題，由于其死亡率高，預后較差，無法控制的細胞增殖、細胞凋亡減慢，腫瘤細胞侵襲性強等使腫瘤的治療面臨巨大的困難，患病后手術加放化療的平均生存期僅為8 11個月。目前腫瘤治療主要有以下幾種方法手術治·療、化學藥物、治療放射治療、光動力治療。但這四種治療方法對大腦損傷性大，易復發，對患者機體消耗大，也無法起到根治目的。樹突狀細胞因子(dendritic cell factor I, dcfl)又名跨膜蛋白59(transmembrane protein 59,是單次跨膜蛋白。根據基因芯片GDS2853分析顯示，隨著膠質瘤級別的升高，dcfl基因表達量呈現下調狀態。同時，dcfl基因敲除小鼠基因芯片和蛋白芯片表明，敲除而/7后，貧/每7 (膠質細胞標記物)表達量上調。2008年Wang，L; et al研究證明，在神經干細胞中，過量表達而/7，可維持神經干細胞未分化狀態，而沉默ofc/7則能促進神經干細胞的分化。2012年Li, X; et al通過小分子microRNA-351,下調而/7的表達后，神經干細胞系C17. 2向膠質方向分化。以上結果都表明，而/2表達量下調可能促進膠質細胞發生。
發明內容
本發明的目的之一在于提供一種人源而/2基因在誘導U251膠質瘤細胞系凋亡中的應用。本發明的目的之二在于提供人源i/c/7基因在抑制U251膠質瘤細胞系增值中的應用。本發明的目的之三在于提供人源而/2基因在抑制腫瘤生長中的應用。技術方案本發明通過培養U251膠質瘤細胞系，運用Lipofectamine 2000Transfection Reagent陽離子脂質體轉染法，在U251細胞中分別轉染pEGFP_N2和PEGFP-N2-DCF1，使其分別表達EGFP綠色熒光蛋白和EGFP-DCF1融合蛋白，前者作為對照。發綠色突光的融合蛋白可指示ofc/V在細胞中的分布，進一步運用ofc/V —抗和膠體金二抗，可在電鏡下觀察膠體金顆粒，從而確定其亞細胞定位。通過CCK8試劑盒，檢測細胞增殖能力。JC-I染料檢測細胞線粒體膜電位。電鏡和原子力顯微鏡觀察線粒體外觀，判斷線粒體是否發生病變。Western檢測過表達而/7后凋亡相關蛋白表達量是否發生變化，從而在凋亡機制上做初步探索。運用裸鼠腫瘤異位移植技術，在體內層面判斷而/7基因對膠質瘤的治療作用。
本發明通過免疫電鏡、原子力顯微鏡、CCK8增殖檢測、JC-I染色、裸鼠腫瘤異位移植等方法對而/7誘導U251細胞系凋亡做出判斷，結果表明dcfl通過定位于線粒體引起線粒體結構病變，膜電位下降，從而引起凋亡相關基因表達量發生改變，最終導致凋亡。裸鼠實驗表明，而/7能顯著減小膠質瘤的腫瘤體積，抑制腫瘤生長。
圖I為-.dcfl基因擴增及重組質粒PEGFP-N2-DCF1酶切鑒定。A圖為以Hela細胞cDNA為模板，通過PCR法擴增獲得人源dcfl基因片段，全長972bp。圖中最左邊泳道為DNAMarkerCSM#0311),泳道I為dcfl基因PCR后擴增產物。B圖為重組質粒pEGFP_N2_DCFl酶切鑒定圖。泳道I為空載PEGFP-N2經EcoRI單酶切，2_5為陽性克隆經EcoRI和BamHI雙酶切后釋放出目的條帶ifc/i(972bp)及空載片段(4700bp)。表明重組質粒pEGFP_N2_DCFl構建成功，經測序驗證正確后用于后續實驗方案。圖2為U251細胞系中轉染重組質粒PEGFP-N2-DCF1。EGFP-DCFI融合蛋白(圖A, C)呈現核外點狀分布，B圖為DAPI細胞核染色，E圖DCFl蛋白免疫熒光，C圖為A圖與B圖疊加。F圖為D圖與E圖疊加。(放大倍數200倍；標尺50um)
圖3為EGFP-DCF1融合蛋白與線粒體染料MitoTracker-Red共定位。EGFP-DCF1融合蛋白(圖A)與線粒體(圖B)存在共定位，C圖為A圖與B圖的疊加。圖4為'dcfl基因可定位于線粒體。Western檢測轉染重組質粒pEGFP_N2_DCFl的U251細胞系線粒體中有DCFl蛋白的存在(圖A)。DCFl免疫電鏡觀察發現在轉染重組質粒pEGFP-N2-DCFl的U251細胞系線粒體處有少量膠體金被標記(圖B)。(放大倍數20000倍；標尺500nm)
圖5為在膠質瘤細胞系中過量表達可抑制細胞增殖能力。U251細胞系過量表'lkdcfl引起細胞增殖能力下降，細胞皺縮(圖A)，從左至右依次為對照組，轉染空載質粒PEGFP-N2組，轉染重組質粒pEGFP-N2-DCFl。CCK8檢測表明dcfl能極顯著降低U251細胞增殖能力(圖B)，同時也表明dcfl能顯著降低U87MG細胞系增殖能力，但其抑制效果比U251稍差(圖C)。但i/c/7基因過量表達對K562，H1299，Hek293T細胞系增殖能力未有影響。*，Ρ〈0· 1;**，Ρ〈0·05，***，Ρ〈0·001。(放大倍數100 倍；標尺 200um)
圖6為過量表達可引起U251細胞系線粒體膜電位下降。U251細胞系經線粒體電子傳遞鏈抑制劑CCCP處理后，線粒體膜電位下降，JC-I無法聚集，呈現綠色(圖A)。對照組線粒體膜電位正常，JC-I聚集體呈紅色(圖B)。轉染空載質粒pEGFP-N2組，JC-I也呈現紅色，大塊綠色為EGFP發光(圖C)。轉染重組質粒PEGFP-N2-DCF1 48小時候，JC-I主要呈現綠色，與藥物處理組相似(圖D)，說明過表達而/7后，U251細胞線粒體膜電位發生下降。(放大倍數100倍；標尺200um)
圖7為過表達而/7引起U251細胞線粒體腫脹，最終引起細胞凋亡。(A，D，G)圖為對照，(B，E，H)圖為U251細胞轉染空載對照pEGFP-N2，(C，F，I)圖為U251細胞轉染重組質粒PEGFP-N2-DCF1。(A-C)圖為透射電鏡觀察U251細胞結構。對照與空載組細胞結構完整，核仁清晰可見(圖A，B);實驗組細胞核裂解，胞質中出現大量空泡狀結構，并包含數個自噬體存在，呈現典型凋亡特征(圖C)。(D-F)圖為透射電鏡觀察細胞線粒體結構形態。對照與空載組線粒體結構完整，可見嵴結構存在(圖D，E);實驗組中多個線粒體發生嚴重腫脹，嵴發生破裂，存在嚴重病變(圖F)。(G-I)圖為原子力顯微鏡觀察抽提的U251細胞線粒體。對照與空載組線粒體尺寸在600nm左右，表面光滑(圖G，H);實驗組線粒體發生腫脹，尺寸在1600nm左右，且線粒體外膜呈現多孔狀結構，這與線粒體通透性孔開放有關，表明線粒體功能發生異常(圖I)。圖8為調亡相關重要蛋白Western檢測。結果表明，過表達t/c/7后,調亡關鍵蛋白procaspase-3酶被剪切成有活性的形式(17kD，19 kD)，抑凋亡基因Bcl_2表達發生下調，促凋亡基因Bax表達上調。從機制上對而/2引起U251細胞凋亡做出初步解釋。圖9為裸鼠成瘤實驗結果表明dcfl能顯著減小膠質瘤的體積，抑制腫瘤生長。A圖為接種U251細胞裸鼠成瘤結果，B圖為A圖中腫瘤鼠解剖后所得腫瘤體積比較。從左至右分別為注射U251細胞，注射轉染空載對照pEGFP-N2 U251細胞，注射轉染重組質粒PEGFP-N2-DCF1 U251細胞。圖中明顯可見實驗組腫瘤體積小于對照組，且在成瘤時間及腫瘤生長速度上也有明顯差異。
具體實施例方式實施例一 'dcfl基因擴增及重組質粒PEGFP-N2-DCF1酶切鑒定
I、以HeLa細胞的cDNA為模版進行PCR擴增，在dcfl弓丨物兩端分別弓I入EcoRI和BamHI酶切位點。上游引物為(5’ -CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGGAG-3’)，
下游引物為(5，-CGGGATCCGTAAAATTTCAGAATGAGCA-3’)，Tm 為 53 攝氏度，30 個循環后獲得大小為972bp的目的片段(圖1A)。2、獲得陽性重組質粒pEGFP-N2-DCFl后，對重組子進行雙酶切鑒定。酶切體系中同時添加EcoRI和BamHI兩種酶，對照采用pEGFP_N2 EcoRI單酶切，37攝氏度反應2小時，電泳鑒定酶切結果，在972bp處有條帶釋放，說明而/2片段已插入到陽性重組質粒中(圖1B)。實施例二 質粒pEGFP-N2-DCFl轉染
U251 細胞系鋪 24 孔板 24 小時后，米用 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent陽離子脂質體轉染法轉染質粒pEGFP -N2-DCF1。每孔Iul lipo2000，Iug質粒pEGFP-N2-DCF1分別溶于50ul無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘后，將兩者混勻，室溫靜置20分鐘。將孔板中培養基更換成400ul無血清DMEMJPA IOOul上述混合產物。37攝氏度培養6小時后，將培養基換成含10%胎牛血清DMEM。轉染后48小時檢測熒光發光情況(圖2A-C)。實施例三細胞免疫熒光
U251細胞轉染后48小時，棄培養基，PBS洗三次。4%PFA固定10分鐘，PBS洗三次。1% Triton-XlOO通透10分鐘，PBS洗三次。2%BSA_PBS室溫封閉I小時。1%BSA_PBS稀釋DCFl兔源多抗(I: 700)，37攝氏度孵育I小時，PBS洗三次。1%BSA_PBS稀釋TRITC熒光二抗(I: 300)，避光37攝氏度孵育40分鐘，PBS洗三次，熒光顯微鏡觀察(圖2D-F)。實施例四線粒體染料Mitotracker-Red染色
含10%胎牛血清DMEM培養基配制Mitotracker-Red工作液(1:1500), 37攝氏度預熱。棄培養基，PBS洗一次。加入預熱Mitotracker-Red工作液，37攝氏度孵育30分鐘。棄去染色液，加入預熱的含10%胎牛血清DMEM，熒光顯微鏡觀察(圖3)。
實施例五Western
細胞培養于60mm培養皿，棄培養基，4攝氏度保存的PBS洗三次。置于冰上，加入IOOul細胞蛋白裂解液。每隔15分鐘槍頭吹打混勻，反應I小時后將裂解液收集于I. 5ml EP管中。4°C，12000rpm離心10分鐘。上清即為細胞全蛋白，BCA法測定濃度。每孔蛋白上樣量為25ug。電泳條件濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，90分鐘。轉膜條件20V，90分鐘。一抗稀釋比例1:3000，二抗稀釋比例1:10000 (圖4A)。實施例六免疫電鏡
取置于鎳網上電鏡切片，1%雙氧水室溫處理10分鐘，PBS (pH7. 4)洗三次。鎳網浮于1%BSA - PBS (pH7. 4)液滴上，室溫孵育I小時，阻斷非特異性吸附。鎳網轉移至1%BSA —PBS (pH7. 4)稀釋的一抗(1:700)液滴上，4°C孵育過夜。PBS (pH7. 4)洗三次，PBS (ρΗ8· 2)洗三次。I % BSA-PBS (pH8. 2) 37°C孵育 I 小時。膠體金二抗用 I % BSA-PBS (ρΗ8· 2)稀釋(I :50)，淡紅色為適宜稀釋液，載網浮于該液滴上，室溫孵育30分鐘。PBS (ρΗ8.2)洗三 次，PBS (ρΗ7. 4)洗三次。吸干PBS后送樣觀察(圖4Β)。實施例七CCK8細胞增殖能力檢測
于轉染開始O小時，每隔12小時對細胞增殖能力進行檢測。96孔板中，反應液為4ulCCK8+96ul無血清DMEM，37攝氏度避光反應30分鐘。酶標儀測0D450nm處吸光值，繪制增殖曲線(圖5)。實施例八JC-I檢測線粒體膜電位
U251細胞轉染48小時后，棄培養基，PBS洗一次。加入配制好的JC-I染色液(每Iml染色液=5ul JC-l+800ul ddH20+200ul 5X染色緩沖液)，37攝氏度避光反應20分鐘。棄染色液，JC-I染色緩沖液(IX)洗兩次。熒光顯微鏡下拍照觀察(圖6)。實施例九裸鼠腫瘤移植
胰酶消化后分別收集轉染PEGFP-N2、pEGFP-N2-DCFl 48小時后的U251細胞及只添加Lipo2000的U251細胞，數量為2*107。注射于雄性6周BALB/c裸鼠右側腋下，留針30秒，共三組，每組4只。觀察裸鼠成瘤情況(圖9)。
權利要求
1.人源dcfl基因在誘導U251膠質瘤細胞系凋亡中的應用。
2.人源dcfl基因在抑制U251膠質瘤細胞系增值中的應用。
3.人源而/2基因在抑制腫瘤生長中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種人源dcf1基因在抑制U251膠質瘤細胞系增值和誘導U251膠質瘤細胞系凋亡中的應用。本發明通過免疫電鏡、原子力顯微鏡、CCK8增殖檢測、JC-1染色、裸鼠腫瘤異位移植等方法對dcf1誘導U251細胞系凋亡做出判斷，結果表明dcf1通過定位于線粒體引起線粒體結構病變，膜電位下降，從而引起凋亡相關基因表達量發生改變，最終導致凋亡。裸鼠實驗表明，dcf1能顯著減小膠質瘤的腫瘤體積，抑制腫瘤生長。
文檔編號A61P35/00GK102940890SQ20121038245
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者文鐵橋, 謝雨瓊, 楊眉, 楊清波 申請人:上海大學