人胚肺成纖維細胞株及利用其生產手足口病毒疫苗的方法

專利名稱：人胚肺成纖維細胞株及利用其生產手足口病毒疫苗的方法
人胚肺成纖維細胞株及利用其生產手足口病毒疫苗的方法發明所屬領域本發明屬于細胞和病毒培養技術領域，具體地說，本發明涉及人胚肺二倍體成纖維細胞株，細胞株在制備二價手足口病毒滅活疫苗中的應用，以及用該細胞生產手足口病毒二價滅活疫苗的方法。
背景技術：
病毒性疫苗可有效預防病毒引起的人類各種傳染性疾病。如狂犬、流腦、乙肝、麻風腮、脊髓灰質炎、手足口等流行性傳染病。病毒性疫苗生產的細胞基質主要為人胚肺二倍體細胞(以下簡稱“二倍體細胞”)、傳代細胞和原代細胞三種。而細胞株作為培養基質，其質量的優劣，直接影響疫苗的質量和產量，尤其是疫苗的安全性。人們在實踐中迫切盼望能尋找到一種經過標化的安全的細胞基質來生產病毒性疫苗，人胚肺二倍體成纖維細胞株具有這種潛能。人二倍體細胞是指分離正常人體組織細胞后，在體外培養的細胞。細胞株來源于正常人胚胎或者其他組織的細胞群體，其染色體數目與原供體細胞染色體數目相同，無異種移植致癌性，無外源因子污染，在正常情況下具有有限生命期，故屬有限生命細胞株。如果組織材料取材于人胚肺，這種細胞通常叫人胚肺二倍體成纖維細胞株或人胚肺成纖維細胞株。有代表性的人胚肺二倍體成纖維細胞株包括國外的MRC-5細胞株(ATCCCCL171)，WI-38 細胞株(ATCC CCL75)，HEL299 細胞株(ATCC CCL137)，LBHEL (KCTC0127BP), IMR-90以及國內KMB-17，2BS等。這些細胞株的信息如下I )WI_38細胞株由美國Wistar研究所建立的人二倍體細胞株。WI-38是1962年從Swedish醫院人工流產的一個3月齡女性胎兒(家庭無腫瘤史)的肺組織建立的。I :2分種共傳代 48 次(Hayf lick. L. 1965. EXP. Cell Res, 37 :614)。WI-38 在世界各國廣泛使用，已在許多國家應用于病毒性疫苗生產。WI-38是國際上第一個經過標化的安全的二倍體細胞株。2)MRC_5細胞株由英國國家醫學研究院的Jacobs等于1966年從一個27歲精神異常，而其家庭遺傳史正常的孕婦，人工流產14周胎兒的肺組織建立的細胞株，總壽命共48次群體分裂。MRC-5經反復檢定證明其生物學性狀達到了制備病毒性疫苗細胞株的國際標準(J. P. Jacobs etal,Naturel970(227) : 168-170)。3)LBHEL (KCTC0127BP)細胞株由韓國株式會社LG化學的金政民等從一個20周齡的雌性胚胎的肺組織建立的細胞株，其生長速度比MRC-5快2倍，相同單位表面積上的細胞產量比MRC-5多I. 7倍，對水痘帶狀皰疹減毒易感性是MRC-5細胞的10倍(中國專利97190080. 9)，但水痘帶狀皰疹病毒在該細胞上擴增時，細胞病變快，病毒滴度低。且僅見該細胞對麻疹病毒，風疹病毒，甲型肝炎病毒及水痘帶狀皰疹病毒具有易感性。4)KMB-17細胞株由昆明醫學生物研究所郭仁等建立，1974年建立了 KMB-17人二倍體細胞株。細胞來源于一位20歲健康孕婦第二胎，4月齡的女性胎兒，表型正常。從凍存后細胞的生物學結果看，細胞分裂、傳代壽命、染色體分析都未發現明顯改變。KMB-17至少對100多種病毒敏感。已成功用于甲肝滅活疫苗的生產(郭仁等，中國醫學科學院學報，1981，Vol3, 226-229.)。5) 2BS細胞株該細胞株由北京生物制品研究所建株，來源于3月齡女性胎兒，為第一胎，雙親無腫瘤史和慢性疾病，家族無先天疾病和遺傳性缺陷。細胞培養性狀，穩定性，活力都表現良好。該株細胞應用于小兒麻痹、乙腦、麻疹、痘苗、腮腺炎等疫苗的研究。已用于甲肝滅活疫苗的生產。(藥品與生物制品(內部資料)1977,2(6) :335-342)手足口病(Hand foot and mouth disease HFMD)是一種常見及輕微、但傳染度頗高的傳染病，可由多種的腸道病毒引致，常見于夏天及初秋時分。此病多發生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥。個別重癥患兒如果病情發展快，會導致死亡。引發手足口病的腸道病毒有20多種，其中腸道病毒71型EV71和柯薩奇病毒(CoxAsckie virus) COX. A16是主要流行毒株,交替 或共同出現引起HFMD感染，爆發大規模流行。手足口病毒屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬。腸道病毒無脂質胞膜，故乙醇對其無作用，在PH3、的條件下穩定，不耐強堿，在4°C可存活一年以上，_20°C及外部環境下可長期存活，不耐高溫，溫度大于56°C失去活性，各種氧化劑、甲醛能使其滅活。1958年首次分離出柯薩奇病毒，1959年提出以手足口病命名，1969年美國加利福尼亞首次分離出EV71，1972年被確認，此后兩種病毒交替或共同出現引起HFMD感染。20世紀70年代HFMD主要爆發在美國，保加利亞、匈牙利、日本等，80年代HFMD相繼爆發在東南亞及澳大利亞、加拿大等。90年代后期HFMD的發病轉至亞太地區，新加坡、臺灣、日本、馬來西亞、中國相繼爆發。1981年我國首次報道HFMD之后，HFMD病例報告不斷，在經過低水平散發及局部爆發之后，從2008年起全國各省份HFMD發病呈上升趨勢。2008年5月累計發病超過17萬人，同月衛生部將HFMD列為丙類法定上報傳染病。2011年我國HFMD發病人數達162萬，其中死亡人數509例，相比2010年發病率降低9. 15%，死亡率降低43. 95%。但2011年HFMD的報告發病病例數及發病引起的死亡數在我國丙類傳染病中均居首位。HFMD已成為我國重要的公共衛生問題。中國專利CN101780278A公開了以Vero細胞為細胞基質培養EV71及COX. A16病毒制備雙價手足口病滅活疫苗的方法。中國專利CN101897963A公開了以VeiO細胞或人二倍體細胞(MRC-5、WI-38)為細胞培養基質，培養人腸道病毒71型并制備手足口病病毒疫苗。從已有技術來看，無論是國外建立的細胞株MRC-5，WI_38，還是國內建立的細胞株2BS、KMB-17，在病毒疫苗中已使用多年，安全性不容置疑。但缺點是產量低，細胞代數高，限制了病毒的產量提高和進一步使用。同樣地，目前使用的猴腎Veix)細胞也是代數高，限制了病毒的生產，更重要的是，猴腎Vero殘余異源蛋白對人體有潛在危害，不利于病毒疫苗產品的應用。在手足口病毒病毒完成擴增后，病毒的純化，猴腎Vero殘余異源蛋白去除，環節多，工藝繁雜，不利病毒疫苗產品的質量控制及成本控制。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種可作為生產用細胞基質對手足口病毒敏感的人胚肺二倍體成纖維細胞株，該細胞對手足口病主要流行株--病毒柯薩奇病毒A組16型COX.A16和腸道病毒71型EV71 二株病毒都敏感，且病毒產量高，二價疫苗生產成本低。本發明的另一個目的是提供一種制備二價手足口病毒滅活疫苗的方法。本發明的第三個目的是提供人胚肺二倍體成纖維細胞株在制備手足口病毒滅活疫苗中的應用。本發明公開了一個新的人胚肺二倍體成纖維細胞株，該細胞株為人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，保藏于國家知識產權局指定的保藏機構-中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中國典型培養物保藏中心簡稱CCTCC，位于湖北省武漢市武漢大學校內，郵編430072，電話027_68752319，Email:cctcc@whu. edu. cn。Walvax-2細胞株對手足口病的二株主要病毒源一柯薩奇病毒A組16型COX. A16和腸道病毒71型EV71病毒都敏感，且病毒產量高。將二株病毒分別接種Walvax-2細胞 株,在35 37°C常規培養下,就能生產大量的病毒疫苗原液；病毒原液通過滅活,濃縮,去雜質，再二株病毒按比例混合，并加入佐劑，就形成二價手足口病毒滅活疫苗。本發明還公開了使用新的人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2制備手足口病毒滅活疫苗的方法，該方法包括以下步驟A.在細胞培養容器中培養保藏號為CCTCC C201055的人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，得到的培養狀態的Walvax-2細胞；B.分別接種手足口病毒EV71和手足口病毒COX. A16至Walvax-2細胞，并分別培養EV71和CA16病毒感染的Walvax-2細胞；C.當細胞出現典型病變時分別收獲細胞病毒液；D.用甲醛分別滅活病毒；E.去除細胞碎片，濃縮病毒，并去除雜質；F.將手足口病毒EV71和COX. A16滅活濃縮病毒液按1:0. 5^1:1. 5比例混合，并加氫氧化招佐劑，分裝，成為二價手足口病病毒滅活疫苗。在本發明細胞培養過程中，細胞培養基利用含體積百分比為2% 10%新生牛血清的MEM營養液，培養Walvax-2細胞形成單層。細胞培養接種時以1:2 1:4的分種率接種細胞，細胞生長至對數生長期，覆蓋85、5%培養容器的表面。在本發明病毒擴增過程中，加入到Walvax-2細胞中的手足口病毒EV71和/或手足口病毒COX. A16感染復數為O. 001 O. 1M0I，無論是手足口病毒EV71還是手足口病毒COX. A16病毒都是分別感染Walvax-2細胞并分別在各自培養容器中完成擴增過程；病毒的維持液為無血清的MEM營養液，加量與培養細胞時使用完全培養基量相同。在本發明中，被病毒感染的二倍體細胞置細胞培養箱在35_37°C，5%C02下培養，當細胞出現典型病變達到75°/Γ95%時，分別收獲細胞病毒液。在本發明中對收獲的細胞病毒液分別進行滅活，本發明采用甲醛滅活方式，甲醛加量是1:2000^1:6000，在40°C滅活72小時 120小時。滅活后的病毒在4°C條件下離心，8000 10000rpm，5 IOmin收集上清液；采用超濾膜超濾濃縮病毒液10倍，補加緩沖液超濾濃縮，重復2飛次；最后一次濃縮至原體積的1/50，收集濃縮液，并清洗濾膜，在Sepharose-4FF凝膠過濾柱進一步去除雜質。
在本發明中公開的手足口病毒疫苗是二價疫苗；將提純后的手足口病毒EV71和C0X.A16病毒液按1:0. 5 1:1.5比例混合，每毫升疫苗加氫氧化鋁佐劑I. (Tl. 2mg，最終形成每毫升疫苗含純化的滅活EV71病毒5 80 μ g/ml,含純化的滅活COX. A16病毒5^80 μ g/ml的二價手足口病毒滅活疫苗。在本發明擴大化的細胞培養系統中采用10層細胞工廠，以1:2的分種率，將Walvax-2細胞接入10層細胞工廠中，加入含5%NBS的MEM營養液2L，培養至對數生長期且細胞覆蓋85-95%的培養容器表面時，PBS清洗細胞面，更換無血清MEM培養基，采用直接接種法，以O. 00Γ0. I感染劑量(MOI)分別接種手足口病毒EV71和/或手足口病毒COX. Α16感染培養的Walvax-2細胞，并分別培養受病毒感染的Walvax-2細胞；當Walvax-2細胞出現的典型細胞病變達75-95%時，分別收集細胞病毒液；分別用甲醛滅活病毒、冷凍高速離心除去細胞碎片，并純化病毒；將EV71和COX. A16病毒按1:0. 5 I: I. 5混和混合，每毫升加氫氧化鋁佐劑I. 2mg，每毫升疫苗含純化的滅活EV71或COX. A16病毒5 80 μ g/ml ;分裝，無菌密封成二價手足口病毒滅活疫苗。在本發明中，以MOI為O. OOfO. I的感染劑量將手足口病毒EV71單獨的接種到Walvax-2細胞基質，維持液為不含血清的MEM，在35 37°C常規培養下，培養3天。當Walvax-2細胞出現的典型細胞病變達75-95%時，分別收集細胞病毒液，此時EV71病毒滴度可達 8. 75 10. 751gCCID50/ml。在本發明中，以MOI為O. 001 O. I的感染劑量將手足口病毒COX. A16單獨的接種到Walvax-2細胞基質，維持液為不含血清的MEM，在35 37 °C常規培養下，培養4天。當Walvax-2細胞出現的典型細胞病變達75、5%時，分別收集細胞病毒液，此時COX. A16病毒滴度可達 8. 25-10. 51gCCID50/ml 之間。病毒分別經甲醛滅活后，在低溫條件下高速離心，lOOOOrpm，去除細胞碎片。超濾濃縮后，以凝膠過濾的方法進行病毒液的純化。測定純化后的病毒原液中的抗原含量，調整抗原濃度，以合適的配比關系將EV71和COX. A16混合，最終形成每毫升疫苗含純化的滅活EV71病毒5 80 μ g/ml，含純化的滅活COX. A16病毒5 80 μ g/ml的二價手足口病毒滅活疫苗，加入鋁佐劑制備成疫苗，每毫升疫苗加佐劑I. 2mg。每只分裝I毫升，無菌密封成二價手足口病毒滅活疫苗。在本發明公開的優化使用人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2制備手足口病毒病毒滅活疫苗的方法中，其特征在于，該方法包括如下步驟A.在細胞培養容器中培養保藏號為CCTCC C201055的人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，得到的培養狀態的Walvax-2細胞；B.分別接種感染復數為0. 01M0I手足口病毒EV71和手足口病毒COX. A16至Walvax-2細胞，并分別培養EV71和COX. A16病毒感染的Walvax-2細胞；C.當細胞出現典型病變達75 95%時分別收獲細胞病毒液；D.用1:4000甲醛在40°C，96小時分別滅活病毒；E.去除細胞碎片，濃縮病毒，并去除雜質；F.將手足口病毒EV71和COX. A16滅活濃縮病毒液按1:0. 5 1:1. 5比例混合，每毫升二價滅活疫苗加氫氧化鋁佐劑I. 2mg，成為二價手足口病病毒滅活疫苗。本發明還公開了人胚肺二倍體成纖維細胞株可在制備二價手足口病毒病毒滅活疫苗中應用。在本發明中米用的病毒毒種中，二株手足口病病毒----腸道病毒71型EV71和柯
薩奇病毒(CoxAsckie ￥化118)0 ]16和參比細胞系1 (-5，11-38均為普通微生物樣品，其中手足口病毒EV71 (CCTCC⑶V117)和手足口病毒COX. A16 (CCTCC⑶V119)登載于中國典型培養物保藏中心的目錄中，處于公開狀態，科學工作者可向該菌種保藏中心索取；MRC-5(ATCC CCL171)，WI-38 (ATCCCCL75)登載于美國典型培養物保藏中心的目錄中，處于公開狀態，科學工作者可向該菌種保藏中心索取。安全性評價中使用的對比細胞HeLa，MDCK細胞，Vero 也是普通細胞，HeLa (ATCC CCL-2)，MDCK (CCL-34)，VERO (ATCCCCL-81)登載于美國典型培養物保藏中心的目錄中，處于公開狀態，科學工作者可向該菌種保藏中心索取。本發明公開的人胚肺二倍體成纖維細胞株與現有細胞相比，有下列優點I)采用Walvax-2細胞培養手足口病毒EV71或COX. A16制備疫苗，避免了非人源培養基質帶來外源蛋白殘留的影響，減少了去除原液中殘余DNA及蛋白的純化步驟，更降 低純化過程中的生產成本。2)人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2對手足口病毒的二種主要病原體敏感，且產量高。其中，手足口病毒EV71在Walvax-2細胞上擴增的滴度分別比在MRC-5細胞，WI-38細胞上高6和6. 25 ;手足口病毒COX. A16在Walvax-2細胞上擴增的滴度分別比在MRC-5細胞，WI-38細胞上高7和7. 25 ；3)人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2對手足口病毒的二種主要病原體病變速率提前，生產時間縮短。以病變50%為判斷標準，其中，EV71在Walvax-2細胞病變速度分別比在MRC-5及WI-38細胞上提前4天和5天；C0X. A16在Walvax-2細胞病變速率比在MRC-5細胞，WI-38細胞上提前5天或5天以上。4)ffalvax-2細胞株生長速度優于現有的MRC-5株及WI-38株，在生產過程中可減少培養時間，節省細胞培養時的成本支出。本發明公開的生產手足口病毒滅活疫苗方法與現有技術相比，有下列優點I)采用細胞培養的方法，培養EV71和COX. A16病毒，兩種病毒毒株均可在Walvax-2細胞上良好生長，并高效穩定的增殖，動物試驗證明該方法制備成的疫苗具有良好的免疫原性，二種病毒在同一種細胞上擴增，有效的降低了培養過程中的外源因子污染和縮主細胞殘留蛋白，保證了該疫苗的安全性。2)采用無血清MEM營養液作為維持液，培養EV71和COX. A16病毒，避免了血清帶入外源因子的影響，進一步保證了疫苗的安全性，并有效提高病毒滴度。3)米用10層的細胞工廠,培養EV71和COX. A16病毒,增加了同一批號病毒液的收獲量，與轉瓶或方瓶的培養方式相比，產品的一致性提高。4) 二價手足口病毒聯合疫苗，可預防由EV71或C0X.A16分別引起的手足口疾病，保證了該疫苗對不同病原體的保護性。


圖I是Walvax-2細胞株形態圖。圖2是Walvax-2細胞株三級種子庫細胞的生長曲線圖。圖3是Walvax-2細胞株染色體核型分析圖
A表示第48代Walvax-2細胞染色體G顯帶B表示第48代Walvax-2細胞染色體排列圖4是Walvax-2細胞株不同代次的生長情況5是Walvax-2細胞20代在添加2%、5%、8%及10%不同血清含量的MEM培液中的生長情況6是Walvax-2細胞株與MRC-5，WI-38細胞的生長曲線對比圖。圖7是在5%和10%NBS濃度下的MEM培養基中培養Walvax-2細胞株與MRC-5，WI-38細胞后的細胞數量比較圖。圖8是Walvax-2細胞株中手足口病毒EV71及CA16的滴度隨MOI的變化圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不能限制本發明的保護范圍。實施例I試劑和培養基的配制I. I細胞基礎培養液IOOOml含下列液體
ΜΠ V!960ml
7.5%NaHC0320ml
3%L-.ff^ 酰胺20ml
PH7.0-7.2I. 2細胞完全培養液(也叫含10%血清的培養基):1000ml含下列液體
MIM860ml
牛血清IOOnil
7J%NaHC0320ml
1%L-谷氨20ml
PH7.0-7.2各種血清含量的細胞培養液牛血清的體積和MEM體積變化，其它保持不變，如含5%NBS的培養基，IOOOml含下列液體
MEM910ml
4:血清5§ml
7.5%NaHC0320ml
3%L-ft MflIR20ml
PH7.0-7.2I. 3細胞凍存液1000ml含下列液體MEM760ml
牛血清100ml
7.5%NaHC0320ml
3%L-谷氨 _R20ml
DMSO100mlI. 4細胞/病毒維持液1000ml含下列液體MEM970ml7. 5%NaHC0320ml3%L-谷氨酰胺IOmlI. 5 0. OlM PBS 溶液1000ml 含下列液體
NaClSinl
KCI0.2ml
Na2HPO4JlH2O2.87 ml
KH2PO40.2nil實施例2Walvax_2細胞株的制備2. I實驗材料的獲得在獲得國家衛生管理部門和倫理委員會的批準后，對捐贈孕婦的夫婦年齡、職業及健康狀況，胎兒父母系三代進行調查，選擇無腫瘤疾病歷史，無先天性異常和遺傳缺陷家族史的胎兒。征得胎兒父母及其親屬同意后，簽訂《捐贈者同意書》。2. 2初代培養胚胎水囊引產后及時送往實驗室，無菌條件下取出肺組織，撕去肺組織表面的膜，剪切成I 2mm3的組織塊，PBS清洗3 4次；將組織塊移入三角瓶；加胰蛋白酶消化30min,加血清中和，IOOOrpm離心5min棄胰蛋白酶,用細胞完全培養基懸浮細胞，于37°C，5%C02條件下培養。培養基成分MEM+10%胎牛血清，繼續培養5天。2. 3傳代培養棄除培 養瓶內的培養液，PBS洗細胞面，用胰蛋白酶消化后加入完全培養液終止消化；以1:2或I :4的分種比例進行傳代；待細胞長成致密單層后繼續傳代，直至生命線。2. 4細胞凍存細胞生命線傳代過程中，在第6代，第8代，第10代，第14代，第20代分別大量凍存細胞做種子細胞庫或工作細胞庫。其中第6代為原始細胞細胞庫，第14代為主細胞庫，第20代為工作細胞庫.凍存細胞后進行復蘇，檢測其活性繼續傳代至生命線，傳代58次。2. 5細胞傳代消化細胞培養3-4天后，PBS洗細胞面后胰蛋白酶消化5-10min，去胰蛋白酶，加入20 30ml培養液終止消化；分瓶繼續在37°C，5%C02條件下培養。2. 6細胞特性研究傳代過程中，對細胞生物學特性進行研究。本發明從所建系且符合國家藥典要求的細胞中篩選到一株人胚肺二倍體成纖維細胞株，命名為Walvax-2，保藏于國家知識產權局指定的保藏機構-中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCC201055，保藏日期是2010年7月13日。中國典型培養物保藏中心簡稱CCTCC，位于湖北省武漢市武漢大學校內，郵編430072，電話:027-68752319, Email: cctcciwhu. edu. cn。Walvax-2細胞株對手足口病的二株主要病毒源一柯薩奇病毒A組16型COX. A16和腸道病毒71型EV71病毒都敏感,且病毒產量聞。將二株病毒分別接種Walvax-2細胞株,在35-37°C常規培養下,就能生產大量的病毒疫苗原液；病毒原液通過滅活,濃縮,去雜質,再二株病毒按比例混合，并加入佐劑，就形成二價手足口病毒滅活疫苗。實施例3 :二價手足口病毒滅活疫苗的制備3. I細胞培養瓶小樣制備二價手足口病毒滅活疫苗A)復蘇工作庫Walvax-2細胞于I個T75細胞培養瓶，加入含有10%牛血清的細胞完全培養液，pH在6. 8 7.4間，置37°C密閉培養。待細胞長成單層后，用PBS洗滌，胰酶消化，棄胰酶，加入上述營養液，以1:2分種率，每3天傳代I次，獲得4個T225瓶細胞至對數生長期。B)去舊的培養液，加PBS洗細胞，按O. 01M0I分別加入EV71或COX. A16病毒感染液，靜止吸附I小時，加病毒維持液150ml覆蓋細胞表面，分別培養受病毒感染細胞3 5 天。C)至Walvax-2細胞病變率在75-95%時收獲。D)加入1:4000的甲醛滅活，40°C滅活96小時。E)分別收集滅活病毒液，4°C離心，10000rpm，5min，收集上清液，采用超濾膜超濾濃縮病毒液10倍，補加緩沖液超濾濃縮，重復3次。最后一次濃縮至原體積的1/50，收集濃縮液，并清洗濾膜。S印harose-4FF凝膠過濾柱(GE XK26/100)純化，上樣量為10ml，流速為3ml/min。純化后的樣品通過47型MILLIP0RE濾器，Pall的O. 2um濾膜進行過濾除菌，收獲過濾后溶液。F)將過濾后獲得的EV71及COX. A16病毒原液以I: I. 25的配比方式進行混合，每毫升疫苗加氫氧化鋁佐劑I. 2mg，制成半成品，分裝成Iml/支，即為二價手足口病毒滅活疫苗。3.2 10層細胞工廠大量制備二價手足口病毒滅活疫苗A.自液氮容器內取出Walvax-2細胞凍存管，于37°C水浴中復蘇，加入含有10%NBS的細胞完全培養液，pH在6. 8 7. 4間，置37°C培養。待細胞長成單層后，用PBS洗滌，胰酶消化，棄胰酶，加入含有5%NBS的細胞完全培養液，以1:2分種率，每4天傳代I次，直至獲得批量生產需要的足夠細胞。將上述細胞轉入由corning/nunc公司生產的10層細胞工廠中培養，加入含5%NBS的細胞完全培養液2L/10層細胞工廠，培養至細胞覆蓋容器表面，PBS清洗細胞表面，更換維持液，維持液中不含NBS，pH在7. O 7. 6。B.按O. 01M0I分別加入EV71和COX. A16病毒，并分別靜止吸附培養3 5天C.至Walvax-2細胞病變率在75%以上時收獲病毒。D.加入1:6000的甲醛滅活，40°C滅活120小時。滅活病毒在4°C條件下離心，lOOOOrpm, IOmin,收集上清液。E.采用超濾膜超濾濃縮病毒液10倍，補加緩沖液超濾濃縮，重復5次。最后一次濃縮至原體積的1/50，收集濃縮液，并清洗濾膜。S印harose-4FF凝膠過濾柱(GE XK50/100)純化。純化后采用O. 2 μ m濾膜過濾除菌,收集過濾后溶液。F.將過濾后獲得的EV71及COX. A16病毒原液以I: I. 25之間的配比方式進行混合，每毫升疫苗加氫氧化鋁佐劑I. 2mg。制成半成品，分裝成Iml/支，即為二價手足口病毒滅活疫苗。實施例4 ffalvax-2細胞株的生物學特性4. I細胞形態復蘇第20代Walvax-2細胞，37°C密閉培養，傳代至40代，薄單層時于倒置顯微鏡下拍攝。結果見圖I。Walvax-2細胞株40代時細胞形態飽滿，長梭狀，符合人胚肺二倍體細胞形態，漩渦狀貼壁生長，細胞增殖旺盛。
4. 2細胞生長曲線分別從原始種子、主種子和工作種子三級細胞庫復蘇Walvax-2細胞株，細胞活率都在95%以上，進行生命線傳代，每次傳代對細胞進行計數，結果見圖2。Walvax-2細胞株三級種子庫間細胞生長活率無明顯差異。說明細胞生物學特性穩定。4.3細胞染色體核型分析復蘇Walvax-2細胞株三級種子庫，傳代過程中，每隔10代對細胞進行染色體分析，各代次待檢細胞在油鏡(1000 X )下觀察1000個中期細胞，詳細記錄所觀察染色體數目和結構形態，其中工作種子庫傳至48代染色體檢查結果見表1，第48代細胞染色體G顯帶見圖3A，染色體排列見圖3B。本發明的Walvax-2細胞株染色體檢測中二倍體占細胞總數的86%以上，說明所建人胚肺成纖維細胞株符合二倍體細胞標準，細胞遺傳性狀穩定。如圖3所示，48代Walvax-2細胞株染色體組型結果為46 / XX，即符合正常人體細胞染色體組型，未見異常。檢測結果均符合《中華人民共和國藥典三部》2010年版要求。表I細胞染色體檢查結果
結構異常
_胞代次檢查數染色單體
多倍體亞二倍體趙二信傳結構異常
和染色體斷裂
w ωοβ ηοοο
M1 β W§ I O
301_01788I §
4β1_21 30I
511IO(M)221133O34. 4無菌及支原體檢查復蘇Walvax-2細胞株三級種子庫，傳代過程中，每隔10代對細胞進行無菌及支原體檢查。檢查方法按《中華人民共和國藥典三部》2010年版規定的檢查項目進行。4. 4. I無菌檢查WalvaX-2細胞樣品分別接種硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基、選擇性培養基、營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、改良馬丁瓊脂培養基，6種不同營養成分的培養基，同時設定陰性對照與陽性對照，分別在有氧和厭氧條件，25°C和37°C培養溫度下培養檢測，實驗結果均為陰性，表示無微生物污染。4. 4. 2支原體檢查Walvax_2細胞傳代過程中每10代進行支原體檢查，采用培養法和DNA熒光染色技術檢查，同時設定陰性對照與陽性對照。培養法結果顯示培養基均澄清，無支原體生長；DNA熒光染色技術檢查Walvax-2細胞，發現整個視野內可見的細胞表面均為光滑樣，細胞核呈圓狀或橢圓狀，細胞核中的DNA發出藍色熒光，且細胞周圍無熒光著色顆粒。證明本細胞沒有支原體污染。兩項結果均為陰性。4. 5內、外源因子檢測復蘇Walvax-2細胞株三級種子庫，傳代過程中，每隔10代對細胞進行外源因子檢查，檢查方法按《中華人民共和國藥典三部》2010年版規定的檢查項目進行。采用細胞形態觀察及血吸附試驗，不同細胞傳代培養法檢測病毒因子，接種動物和雞胚法檢測病毒因子，逆轉錄病毒及其他內源性病毒或病毒核酸的檢測，特殊外源病毒因子檢測5種方法。4. 5. I細胞形態觀察對Walvax-2進行傳代，共傳出10瓶T25細胞，同時設待檢Walvax-2細胞接種手足口病毒EV71為陽性對照。于37°C條件下密閉培養，細胞長成單層后更換維持液，每5天更換I次細胞維持液，持續培養14天，Walvax-2待檢細胞各代次均保持正常形態，未觀察到脫落、病變等異常情況。
4. 5. 2血吸附試驗取4. 5. I中培養到期細胞4瓶，同時設MDCK細胞接種流感病毒為陽性對照，加入豚鼠紅細胞和雞紅細胞混合液，置2 8°C作用30min，然后置20 25°C作用30min,顯微鏡下觀察,紅細胞懸浮于成纖維細胞上方,未出現凝集現象，Walvax-2細胞各代次檢測結果均為陰性。4. 5. 3不同細胞傳代培養法檢測病毒因子待檢活細胞以106/ml分別接種單層的Vero細胞、MRC-5細胞及與待檢細胞不同代次的Walvax-2細胞，每種細胞接種2個T75瓶，每瓶接種15ml，接種量約占維持液的1/3，培養7天后盲傳I代，按上述4. 5. I及4. 5. 2中方法觀察細胞形態及進行血吸附試驗，結果細胞形態正常，血吸附試驗結果為陰性。4. 5. 4接種動物和雞胚法檢測病毒因子WalvaX-2待檢各代次細胞按《中華人民共和國藥典三部》2010年版要求接種乳鼠、成鼠、5日齡雞胚、10日齡雞胚、豚鼠及家兔。并分別飼養5天、21天及42天后觀察，各代次細胞接種動物均未發生死亡，5日齡雞胚存活，10日齡雞胚其血凝試驗為陰性，判定本發明的Walvax-2各代次細胞檢測結果均合格。4. 5. 5逆轉錄病毒及其他內源性病毒或病毒核酸的檢測待檢細胞采用PERT法、感染性試驗及透射電鏡檢查3種方法檢測，同時以MRC-5為陰性對照。經檢查，Walvax-2各代次細胞的逆轉錄酶活性及感染性試驗檢測結果均為陰性，電鏡下觀察均未發現類似病毒顆粒。4. 5. 6特殊外源病毒因子檢測采用ELISA方法進行，按乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒、人丙肝抗原酶聯免疫法分析試劑盒、人EB病毒早期抗原酶聯免疫分析試劑盒、人巨細胞病毒抗原酶聯免疫分析試劑盒、HIV抗原抗體診斷試劑盒的使用說明，將Walvax-2各代次的待檢細胞上清液加入試劑盒，加終止液后，用波長450nm的酶標儀讀數，結果顯示本發明的Walvax-2各代次細胞檢測均為陰性。4. 6致腫瘤性復蘇Walvax-2細胞株三級種子庫，傳代過程中，每隔10代對細胞進行致腫瘤性檢查。待檢細胞用胰酶消化后，用無血清培養基制備成濃度為5X IOVml細胞待檢懸液。裸鼠皮下接種O. 2ml/只。陽性對照Hela細胞皮下接種O. 2ml，細胞濃度為106/0. 2ml,陰性對照MRC-5皮下接種O. 2ml，細胞濃度為107/0. 2ml。飼養并觀察，陰性對照未發生異常，陽性對照出現腫瘤結節，本發明的Walvax-2細胞株接種裸鼠后，21天內均未發現結瘤，半數處死解剖后未發現異常，另半數觀察84天，未發現結瘤，處死解剖后未發現異常。21天和84天取小鼠的接種部位、淋巴結、心、脾肺及腦做病理切片檢查，異型增生細胞。說明本發明的Walvax-2細胞株無潛在的致瘤性。4. 7同功酶檢測復蘇Walvax-2細胞20代，細胞傳代至48代進行同功酶檢測，方法依據INNOVATIVE CHEMISTRY公司的The Authentikit System的方法對細胞株的乳酸脫氫酶(LD)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)兩種酶進行檢測，檢測結果見表2。如表2所示，本發明的Walvax-2細胞株的同功酶圖譜均與ATCC保藏的人二倍體細胞株(MRC-5)及人宮頸癌細胞系(HeLa)完全相同，而與小鼠成纖維細胞系(L929)的同功酶圖譜有顯著差別。因此，Walvax-2細胞株與MRC-5及HeLa細胞系同種，屬于人源細胞株，且無交叉污染。表2Walvax_2細胞株同功酶分析結果
^^14^漏臟_ CLD) 6—巧 臟嶋人;須ft_ll系(HeLa)++、成纖維細胞系(L929) — —
人…倍體細胞株(MRC-5)++
Walvax-2 細胞株++注表格中“一”表示同功酶圖譜與對照細胞有較大差別；“ + ”表示兩種細胞同功酶圖譜相同。4. 8ffalvax-2對手足口病病毒的敏感性復蘇Walvax-2細胞20代，37°C密閉培養至薄單層，以1:2的分種率進行傳代，至細胞26代，12個T25培養瓶，分別接種手足口 EV71及COX. A16病毒，每個病毒接種4個T25瓶細胞，4個T25瓶細胞為陰性對照，接毒后細胞于35°C繼續培養，同時在MRC-5細胞上每個病毒以相同的MOI接種4個T25瓶細胞作對比試驗，結果見表3。如表3所示，本發明的Walvax-2細胞對手足口 EV71及COX. A16病毒有良好的敏感性，2種病毒在該細胞上的增值速度及病毒滴度均明顯高于MRC-5細胞。表35種病毒在Walvax-2及MRC-5細胞上的敏感性
Walvax-2MRC-5EV7110.75 IgCCID50/mI 4.75 lgCClD50/ml COXJU 6 10,5 IgCCI D50/ml 3.5 lgCCID50/ml實驗例5Walvax_2細胞株的培養5. lffalvax-2細胞株不同代次細胞生長情況比較在T75培養瓶中培養Walvax-2細胞，以1:2的分種率傳代。在10代、20代、30代、40代、50代時，以500萬/T75瓶的細胞量接種，37°C密閉培養。接種后的Walvax-2細胞分別進行Γ5天的細胞觀察及細胞計數，細胞計數結果見圖4如圖4所示，細胞在10代、20代、30代時均保持旺盛的生長活力，細胞增殖快，40代時，細胞增殖速度變慢，高峰期時細胞量相較前3個代次減少。50代時細胞的生長速度明顯慢于前30代，細胞高峰期時細胞量明顯少于其他4個代次，但仍良好生長至薄單層。5. 2ffalvax-2細胞株在不同血清含量的培養液中生長情況比較培養Walvax-2細胞20代，以500萬/T75瓶的細胞量分別接種含有2%NBS，5%NBS，8%NBS, 10%NBS的培養液中，37°C密閉培養。對接種后的Walvax-2細胞20代分別進行f 5天的細胞觀察及細胞計數，細胞計數結果見圖5。如圖5所示，細胞在5%、8%或10%NBS含量的培養液中均保持旺盛的活力，細胞增殖快，兩者無明顯區別。細胞在2%NBS含量的培養液中，生長速度減慢，且高峰期的細胞量 少于在含有5%、8%或10%NBS培養液中的Walvax-2細胞20代細胞量。實施例6 ffalvax-2細胞株與MRC-5，WI-38的比較6. I細胞生長速度比較測定30代Walvax-2細胞株的生長曲線，和30代MRC-5 (ATCC CCL171)和WI-38 (ATCC CCL75)細胞株生長曲線做比較。6. I. I在T75培養瓶中培養三種細胞株已形成致密單層，PBS洗細胞面I 3次，用胰蛋白酶消化后加入培養液終止消化，收集細胞液，IOOOrpm離心3分鐘。6. I. 2將離心細胞的沉淀懸浮于培養基中，以5X IO5細胞/瓶的細胞量加入T25培養瓶中，37 °C密閉培養。6. I. 3每24小時，按步驟I收集細胞，用Cedex XS細胞計數儀對細胞進行計數，見圖6。如圖6所示，本發明的Walvax-2細胞對數期早于與MRC-5和WI-38細胞，且細胞數比MRC-5和WI-38細胞大約多2倍。6. 2不同血清濃度下的生長狀況比較在T75培養瓶中培養Walvax-2、MRC-5、WI-38細胞以形成單層，消化細胞制備細胞懸液，并進行細胞計數。以5X IO5個細胞量接入每個T25培養瓶，在37°C條件下培養細胞。每24小時收集細胞進行計數，細胞計數采用Cedex XS細胞計數儀進行測定。結果見圖7。圖7記載了在含有5%或10%的NBS的MEM培養基中細胞培養5天后計數情況，Walvax-2細胞株、MRC-5細胞株、WI-38細胞株的細胞數對比。如圖7所示，培養在含有5%NBS的MEM培養基中Walvax-2細胞數接近于在含有10%NBS的培養基中得到的細胞數。而在含有5%NBS的MEM中MRC-5與WI-38均生長緩慢，這表明本發明的Walvax-2細胞株對血清要求低，更具有經濟優勢。6. 3手足口病毒在細胞中的增殖研究比較復蘇Walvax-2、MRC-5、WI_38三種人胚肺細胞，37°C，細胞生長至覆蓋95%培養容器的表面，以1:2的分種率傳代細胞至單層。手足口病毒EV71以感染劑量(MOI)為O. 01接種到上述細胞中，更換無血清維持液，培養7天，觀察記錄，結果見表4。手足口病毒C0X.A16以感染劑量(MOI)為O. 01接種到上述細胞中，更換無血清維持液，培養7天，觀察記錄；同時設陰性對照。分別收獲Walvax-2細胞、MRC-5細胞及WI-38細胞中培養的手足口病毒液，測定收獲病毒液的滴度，結果見表5。
如表4、表5所示本發明中Walvax-2細胞株中培養手足口病毒EV71及CA16毒株的活性明顯高于其他常規細胞株中的活性。表4不同人胚肺二倍體細胞接種手足口病毒后病變速率
權利要求
1.一株人胚肺二倍體成纖維細胞株，其特征在于，該細胞株為人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC C201055。
2.—種生產二價手足口病毒滅活疫苗的制備方法，該方法包括如下步驟 A.在細胞培養容器中培養保藏號為CCTCCC201055的人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，得到的培養狀態的Walvax-2細胞； B.分別接種手足口病毒EV71和手足口病毒COX.A16至Walvax-2細胞，并分別培養EV71和COX. A16病毒感染的Walvax-2細胞； C.當細胞出現典型病變時分別收獲細胞病毒液； D.用甲醛分別滅活病毒； E.去除細胞碎片，濃縮病毒，并去除雜質； F.將手足口病毒EV71和COX.A16滅活濃縮病毒液按1:0. 5 I: I. 5比例混合，并加氫氧化招佐劑，分裝，成為二價手足口病毒滅活疫苗。
3.根據權利要求2中所述方法，其中利用含體積百分比為2% 10%新生牛血清的MEM營養液在步驟A中培養Walvax-2細胞形成單層。
4.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟A中以1:2 1:4的分種率接種細胞，細胞生長至對數生長期，覆蓋85 95%培養容器的表面。
5.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟B中加入到Walvax-2細胞中的手足口病毒EV71或手足口病毒COX. A16感染復數為O. 001 O. I MOI。
6.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟B中培養手足口病毒EV71或手足口病毒COX. A16的維持液為無血清的MEM營養液。
7.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟C中細胞出現典型病變達到75%-95%時，收獲細胞病毒液。
8.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟D中加入1:2000 1:6000的甲醛滅活，40°C滅活72小時 120小時。
9.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟E中滅活后的病毒在4°C條件下離心，8000 10000rpm，5 IOmin收集上清液；采用超濾膜超濾濃縮病毒液10倍，補加緩沖液超濾濃縮，重復2 5次；最后一次濃縮至原體積的1/50，收集濃縮液，并清洗濾膜，在Sepharose-4FF凝膠過濾柱進一步去除雜質。
10.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟F中每毫升二價滅活疫苗加氫氧化鋁佐劑I.O I. 2mg0
11.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟F中每毫升二價滅活疫苗含純化的滅活EV71 病毒 5 80 μ g。
12.根據權利要求2中所述方法，其中在步驟F中每毫升二價滅活疫苗含純化的滅活COX. A16 病毒 5 80yg。
13.根據權利要求2中所述方法，該方法包括如下步驟 A.在細胞培養容器中培養保藏號為CCTCCC201055的人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，得到的培養狀態的Walvax-2細胞； B.分別接種感染復數為O.01 MOI手足口病毒EV71和手足口病毒COX. A16至Walvax-2細胞，并分別培養EV71和COX. A16病毒感染的Walvax-2細胞；C.當細胞出現典型病變達75 95%時分別收獲細胞病毒液； D.用1:4OOO甲醛在40°C，96小時分別滅活病毒； E.去除細胞碎片，濃縮病毒，并去除雜質； F.將手足口病毒EV71和COX.A16滅活濃縮病毒液按1:0. 5 I: I. 5比例混合，每毫升二價滅活疫苗加氫氧化鋁佐劑I. 2mg，分裝，成為二價手足口病病毒滅活疫苗。
14.權利要求I中所述Walvax-2細胞株在制備二價手足口病毒滅活疫苗中的應用。
全文摘要
本發明提供了一株新的人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，CCTCCC201055，該細胞株對手足口病主要流行病毒株---柯薩奇病毒A組16型COX.A16和腸道病毒71型EV71二株病毒敏感，且病毒產量高。本發明還提供了制備二價手足口病毒滅活疫苗的方法，以及人胚肺二倍體成纖維細胞株在制備手足口病毒滅活疫苗中的應用。用本發明提供人胚肺二倍體成纖維細胞株生產的二價滅活疫苗可有效預防手足口病。
文檔編號A61K39/125GK102911910SQ20121037178
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者黃鎮, 何麗芳, 張翊, 馬波, 王麗麗, 趙瓊英, 張楊, 武雯俊, 陳敏, 王馨, 唐業峰 申請人:云南沃森生物技術股份有限公司