專利名稱：高效表達ha蛋白的重組流感病毒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及到疫苗的生產領域，具體地，是涉及到一種高效表達HA蛋白的重組流感病毒及其制備方法和應用。技術領域流感是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的一種急性、高度接觸性傳染病，高致病性禽流感被國際動物衛生組織確定為A類疫病。流感病毒根據基質蛋白(Matrix protein,Μ)的不同可以分為A、B、C三型。根據流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase, NA)抗原性的差異,又可將流感病毒分為不同的亞型，A型流感病毒根據HA劃分為16個亞型，根據NA劃分為9個亞型。流感病毒具有高度傳染性，可通過飛沫傳播，因此它能在短期內突然發生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行。1983-1984年，美國賓州的高致病性禽流感暴發，造成1700萬家禽死亡，損失近6500萬美元。2003年年底，亞洲多個國家和地區暴發了高致病性的禽流感。禽流感的暴發，使I億多只家禽死亡或被撲殺，部分國家禽肉產量和銷售量急劇下降，價格下跌，禽肉及其制品進出口暫時中止；此外，家禽養殖業、飼料行業和旅游業也都受到不利的影響。據糧農組織估計，由此遭受的損失至少為5億美元。此外，許多亞型的禽流感病毒具有跨宿主傳播至人的能力，因而，該病的暴發也同時危害著社會公共安全。二十世紀爆發了三次流感的大流行，分別是1918年西班牙流感(HlNl)、1957年亞洲流感(H2N2)和1968年香港流感(H3N2)，其中最大規模的流行為西班牙流感。該流感疫病造成全球2000萬人的死亡，超過第一次世界大戰死亡人數,列全球所有傳染病死亡的第一位。流感病毒的基因組由單股，負義RNA片段組成.。A型流感病毒分為8個片段，編碼11種功能蛋白，片段1、2、3分別編碼三個聚合酶蛋白PB2、PB1和PA ;片段4編碼血凝素HA ;片段5編碼核衣殼蛋白NP ;片段6編碼神經氨酸酶NA ;片段7編碼基質蛋白Ml和離子通道M2 ;片段8編碼非結構蛋白NSl和NS2。其中HA和NA是流感病毒最主要的兩種表面糖蛋白，HA蛋白是流感病毒最重要的保護性抗原。目前，各國對動物和人流感的預防控制采取了不同的措施，但是疫苗接種仍然是預防流感的最佳選擇，因此研制有效的流感疫苗對于控制流感流行具有極其重要的意義。全病毒滅活疫苗是目前應用最廣泛的疫苗，該疫苗安全性好，不會出現毒力返強和變異的危險，能夠經受同種亞型流感病毒的攻擊。目前已上市的流感疫苗基本都是使用雞胚培養制備，國內外使用雞胚培養疫苗已經有50年歷史。由于雞胚生產流感疫苗需要消耗大量的雞胚，雞胚帶有潛在污染可能，而且培養周期過長，不易于擴大產量，不利于應對大規模的流感爆發。為此，世界衛生組織、美國政府等都鼓勵發展細胞培養技術替代目前的雞胚培養技術來生產流感疫苗。為加快細胞培養流感疫苗技術的開發，美國政府決定投資11億美元資助葛蘭素史克、edlmmune、諾華、DynPort、Solvay和巴斯德6個主要的流感疫苗開發新技術。在2007年，全球最大的生物制藥公司之一諾華宣布其人用流感疫苗Optaflu上市，成為唯一獲批(歐盟批準)的人用細胞培養流感疫苗，是50年流感疫苗生產史最重大的創新
之一 O無論采用雞胚法和大規模細胞制備法獲得病毒，重要的影響因素便是疫苗種毒本身是不是高產量的病毒株。A/Puerto Rico/8/34(PR8)是一株雞胚適應病毒株，是目前在雞胚上高產株之一，疫苗研制中常常將PR8的6個內部基因與流行毒株的HA和NA基因重組(6+2模式)，將重組病毒作為疫苗株來提高病毒滴度。為了進一步提高PR8的病毒滴度，滿足在流感大暴發時，巨大的疫苗需求量，科研人員進行了大量的研究，通過優化病毒基因來提高病毒株產量。研究發現該流感病毒一些蛋白的某個氨基酸位點對該病毒的增殖能力具有重要的影響，如PB2上360位的酪氨酸(Tyr)和NSl上55位的谷氨酸(Glu)也起到一定作用。
發明內容
本發明的目的之一，在于提供一種PR8突變重組流感病毒，該重組流感病毒可高效表達HA蛋白，適用于大規模生產流感疫苗。實現上述目的技術方案如下一種PR8重組流感病毒，其含有Hl亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因(PB1，PB2, PA，NP, M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變，所述Hl亞型流感病毒是除PR8病毒以外的Hl亞型流感病毒(編碼具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H3亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因( 81，？82，？么，冊^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變(編碼具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H4亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因( 81，？82，？么，冊^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變(編碼具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H5亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因( 81，？82，？么，冊^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變(編碼具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H6亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因( 81，？82，？么，冊^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變(編碼具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H7亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病 毒的6個內部基因( 81，？82，？么，冊^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變(編碼具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H9亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因( 81，？82，？么，冊^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變(編碼具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有HlO亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因( 81，？82，？么，冊^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變(編碼具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO 24-27 所示)。本發明的另一目的是提供制備上述PR8重組流感病毒的方法。實現該目的的技術方案如下一種制備上述PR8重組流感病毒的方法，包括以下步驟構建分別包含Hl、H3、H4、H5、H6、H7、H9、HlO亞型流感病毒的HA和NA基因的重
組質粒；構建包含PR8病毒突變基因片段的重組質粒，該PR8病毒突變基因片段選自下述突變的NS或NP基因片段編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段，編碼含有G132A點突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段；將上述各亞型流感病毒的HA基因的重組質粒和NA基因的重組質粒，與上述包含PR8病毒突變基因片段的重組質粒、以及分別包含PR8病毒PA、PB1、PB2、M、NP或NS內部基因的質粒按相應組合一起轉染293T細胞，培養轉染后的細胞；將培養的細胞上清接種于雞胚，在孵化器內培養合適時間后，收獲雞胚尿囊液，檢測該尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且經過序列分析確定沒有非預期突變后，即獲得PR8重組流感病毒。在本發明的具體實施例中，制備上述PR8重組流感病毒的方法，包括以下步驟(一 )、構建重組質粒
八、獲得!11、!13、!14、冊，冊、!17、!19、!110亞型流感病毒的擬和嫩基因； 獲得!11、!13、!14、冊、冊、!17、!19、!110亞型流感病毒的擬和嫩基因的方法為分別抽提HI、H3、H4、H5、H6、H9和HlO亞型流感病毒的總RNA ；分別以總RNA為模板，反轉錄合成Hl、H3、H4、H5、H6、H9、HlO亞型流感病毒的cDNA ；以獲得的cDNA 為模板，分別用 SEQ ID. NO 13 和 SEQ ID. NO 14 以及 SEQ ID. NO 11和SEQ ID. NO 12為上下游引物，分別擴增出HI、H3、H4、H6、H9、HlO亞型流感病毒的HA基因和HI、H3、H4、H5、H6、H9、HlO亞型流感病毒的NA基因；以H5亞型流感病毒的cDNA為模板，用突變H5HA堿性裂解位點的引物SEQ ID. NO 15 和 SEQ ID. NO :13、及引物 SEQ ID. N0:16 和 SEQ ID. NO :14 分別擴增，再用 SEQ ID. NO 13和SEQ ID. NO 14引物進行PCR融合擴增，獲得含有低致病性禽流感毒株堿性裂解位點的H5N1亞型流感病毒的HA基因；所述H7亞型流感病毒的HA和NA基因的制備為人工合成H7亞型流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株堿性裂解位點的HA基因，并用SEQ ID. NO 13和SEQID. NO :14和SEQ ID. NO 11和SEQ ID. NO 12為上下游引物，分別進行擴增，分別擴增出H7亞型流感病毒的HA基因和NA基因。B、分別獲得編碼含有G132A點突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段；優選地，所述分別獲得編碼含有G132A點突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段的制備為以含有PR8病毒NP基因的重組質粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO :7和SEQID. NO 6以及引物SEQ ID. NO 5和SEQ ID. NO 8在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進行PCR擴增；以兩段PCR產物為模板，以SEQ ID. NO :7和SEQ ID. NO 8為引物，進行第二次PCR擴增融合，獲得點突變G132A的PR8病毒NP基因片段；以PBD-PR8NS重組質粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO 9和SEQ ID. NO 2以及引物SEQ ID. NO : I和SEQ ID. NO : 10在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進行PCR擴增；以兩段PCR產物為模板，以SEQ ID. NO 9和SEQ ID. NO 10為引物，進行第二次PCR融合，獲得編碼含有E67S定點突變NS2蛋白的NS基因片段；
以PBD-PR8NS重組質粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 4以及SEQID. NO :3和引物SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進行PCR擴增；以兩段PCR產物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10為引物，進行第二次PCR融合，獲得編碼含有E74S定點突變NS2蛋白的NS基因片段；以上述的編碼含有E67S定點突變NS2蛋白的NS基因片段為模板，分別用引物SEQ ID. NO 9 和 SEQ ID. NO 4 以及引物 SEQ ID. NO 3 和 SEQ ID. NO :10 在 Pfx DNA 聚合酶的作用下分別進行PCR擴增；以兩段PCR產物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 10為引物，進行第二次PCR融合，獲得編碼同時含有E74S和E74S定點突變NS2蛋白的NS基因片段；C、制備重組質粒分別將獲得的編碼含有G132A點突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段和上述獲得的HA和NA基因經過酶切、連接及轉化，獲得相應的重組質粒；所述重組質粒為以下中的一種以上PBD-(HI)HA、PBD-(HI)NA ；PBD-(H3)HA、PBD-(H3)NA ；PBD-(H4)HA、PBD-(H4N2) NA ；PBD-(H5) HA、PBD-(H5) NA ；PBD-(H6)HA、PBD-(H6)NA ；PBD- (H7)HA、PBD- (H7)NA ;PBD-(H9)HA、PBD-(H9) NA ;PBD_ (HlO) HA、PBD-(HlO)NA ;PBD-PR8NS_NS2E67/74S、 PBD-PR8NS-NS2E67S、PBD-PR8NS-NS2E74S、PBD-PR8NP-G132A、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、PBD-PR8PA、PBD-PR8NP、PBD-PR8M、PBD PR8NS(Zejun Li, et al. JVI, 2005, 79 (18)12058-12064)。(二)、制備PR8重組流感病毒將上述獲得的重組質粒按照相應組合，轉染于293T細胞；轉染后的細胞上清用TPCK-Trypsin處理后，接種SPF雞胚，培養；收獲雞胚尿囊液，獲得上述的PR8重組流感病毒。本發明的另一目的是上述PR8重組流感病毒的應用。具體技術方案如下上述任一所述的PR8重組流感病毒在制備流感疫苗中的應用。本發明的發明人發現當PR8病毒株的NS2蛋白第67位氨基酸由E突變為S(E67S點突變)，或NS2蛋白第74位氨基酸由E突變成S (E74S點突變)，或NS2蛋白第64和74位氨基酸同時由E突變成S(E67S/E74S點突變)，病毒突變株在雞胚上的增殖能力明顯提高。此外，NP蛋白的第132位氨基酸由G突變為A時(G132A點突變)，突變體的病毒株在細胞上的增殖能力明顯提高。利用這些高增殖能力突突病毒的內部基因和不同亞型(H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10)流感病毒進行人工重組，獲得本發明所述的高效表達HA抗原的重組病毒，這些重組病毒可用于大規模制備流感疫苗。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖I重組PR8突變病毒及重組PR8病毒在雞胚上的血凝活性。圖2重組PR8突變病毒及重組PR8病毒在細胞上的血凝活性。
具體實施例方式實施例I重組質粒的構建與鑒定I、引物設計
設計流感病毒PR8的NS和NP的突變引物；流感病毒12bp反轉錄引物、A型流感的通用引物、H5和H7HA裂解位點突變引物由本實驗室設計。上述引物具體的序列見表1(本發明中所用到的引物序列，具體見表I)，均由上海Invitrogen公司合成。2、兩點定點突變采用兩步PCR方法對預期突變氨基酸位點的核苷酸進行突變。首先以PBD-PR8NP為模板，分別用 BSPQI-NP-forward 和 PR8-NP-400R 以及 PR8-NP-387F 和 BSPQI-NP-reverse為上下游引物，在Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)的作用下分別進行PCR擴增。PCR獲得的兩個片段，通過膠回收試劑盒回收。以回收的兩段PCR產物為模板，以BSPQI-NP-forward和BSPQI-NP-reverse為引物，進行第二次PCR融合。如此獲得編碼G132A點突變的NP蛋白的NP基因片段。PCR擴增程序為94°C預變性5min，進入以下循環，94°C變性45s，53 °C退火45s，72°C延伸lmin-lmin45s，運行30個循環，最后再72°C延伸lOmin。反應結束后，PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳實驗。用同樣的方法，利用表I中NS2突變引物PR8-NS2-193F、PR8-NS2-204R， PR8-NS2-215F、PR8-NS2-224R和NS基因擴增引物BSPQI_NS-forward和BSPQI-NS-reverse分別獲得含有NS2E67S、E74S和NS2E67/74S點突變的NS基因PCR擴增產物。具體如下以PBD-PR8NS重組質粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 2以及引物SEQ ID.N0:1和SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進行PCR擴增；以兩段PCR產物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10為引物，進行第二次PCR融合，獲得編碼含有E67S定點突變NS2蛋白的NS基因片段；以PBD-PR8NS重組質粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 4以及SEQID. NO :3和引物SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進行PCR擴增；以兩段PCR產物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10為引物，進行第二次PCR融合，獲得編碼含有E74S定點突變NS2蛋白的NS基因片段；以上述的編碼含有E67S定點突變NS2蛋白的NS基因片段模板，分別用引物SEQID. NO 9 和 SEQ ID. NO 4 以及引物 SEQ ID. NO 3 和 SEQ ID. NO :10 在 Pfx DNA 聚合酶的作用下分別進行PCR擴增;以兩段PCR產物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID.N0:10為引物，進行第二次PCR融合，獲得編碼同時含有E74S和E74S定點突變NS2蛋白的NS基因片段。3、HA和NA基因的PCR擴增HA和NA基因來源于不同亞型的流感病毒(HxNy，代表H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2、H10N8亞型流感病毒)。除H7N7亞型流感外，其他病毒用Trizol (Invitrogen)抽提總 RNA。用反轉錄試劑盒(TakaRa),根據其說明書，用12bp引物5' -AGCAAAAGCAGG-3'(表I)為特異性引物，合成cDNA第一鏈。以獲得的cDNA的第一鏈為模板，用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse 和 BSPQI-NA-forward、BSPQI-NA-reverse為上下游引物(含有BspQI酶切位點，如表1)，分別擴增出片段的!1謂1、!13吧、!14吧、冊財、H9N2、H10N8 亞型流感病毒的 HA 和 H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H9N2、H10N8 亞型流感病毒的NA基因。PCR擴增程序為94 V預變性5min，進入以下循環，94°C變性45s，53 V退火45s，72°C延伸lmin45s，運行30個循環，最后再72°C延伸lOmin。反應結束后，PCR產物在I. O %瓊脂糖凝膠上進行電泳驗證。
抽提獲得H5N1亞型流感病毒HA基因后，用突變H5HA堿性裂解位點的下游引物H5_reverse和BSPQI-HA-forward、突變堿性裂解位點的上游引物H5_forward和BSPQI-HA-reverse 分別進行 PCR 擴增，再用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA_reverse 引物進行融合PCR。PCR擴增程序為94°C預變性5min，進入以下循環，94°C變性45s，53 °C退火45s，72°C延伸lmin45s，運行30個循環，最后再72°C延伸lOmin。反應結束后，PCR產物在I. 0%瓊脂糖凝膠上進行電泳驗證。獲得含有低致病性禽流感毒株堿性裂解位點的H5的HA基因。在本研究中人工合成了 H7N7流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株堿性裂解位點的 HA 基因，并用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse 和 BSPQI-NA-forward、BSPQI-NA-reverse為上下游引物(含有BspQI酶切位點，如表I)，分別進行了 PCR擴增。PCR擴增程序為94°C預變性5min，進入以下循環，94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸lmin45s，運行30個循環，最后再72°C延伸lOmin。反應結束后，PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳驗證。4、PCR產物的割膠回收
電泳結束后在紫外光下從凝膠上切下目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，用DNA快速回收試劑盒回收DNA。具體方法如下在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，放入一無菌的L 5ml的EP管中，加入3倍凝膠體積(IOOmg = IOOul體積)的Buffer DE-A(凝膠液)，混合均勻后于75°C加熱，間斷混合(2-3min)，直至凝膠塊完全熔化(約6_8min)。加入O. 5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B (結合液)，混合均勻；當回收的DNA片段小于400bp時,加入I個凝膠體積的異丙醇。將混合液轉移到DNA制備管中，12000Xg離心Imin,倒掉收集管中的廢液。將制備管置回收集管中，加入500ul Buffer Wl (洗滌液)，12000 X g離心30s，棄掉收集管中的廢液。將制備管置回收集管中，加入700ul Buffer W2(去鹽液)，12000Xg離心lmin，棄掉收集管中的廢液，以同樣的方法再洗一次。將制備管置回收集管中，12000\8空離11^11。最后將制備管置于潔凈的I. 5ml EP管中，在制備膜中央加入30ul的去離子水，室溫靜置lmin，12000Xg離心Imin洗脫DNA，置于_20°C保存備用。5、酶切、連接及轉化上述PCR純化產物與PBD載體(ZejunLi，et al. JVI, 2005, 79 (18) :12058-12064)分別用BSPQI限制性內切酶進行消化，用膠回收試劑盒回收目的片段與PBD質粒的酶切產物，然后用T4連接酶將酶切后的PCR產物與酶切處理的PBD載體進行連接。連接產物轉化于感受態細胞JM109(上海索萊生物科技有限公司)，無菌條件下涂布于含Amp的LB固體培養基上，37 °C培養8-20h。6、重組質粒的鑒定挑取LB固體培養基上的單個菌落，放入加有約3ml含Amp的LB液體培養基的試管中，37°C振蕩培養10h。將菌液用堿性抽提法抽提的質粒，用PCR方法進行驗證。鑒定為陽性的質粒進行序列測定，用DNAstar序列分析軟件進行序列分析，確定序列正確無誤。分別如SEQ ID. NO :20-23所示的核酸序列，或其氨基酸序列為SEQ ID. NO :24_27。此外，各個亞型的HA和NA基因的序列經核實也是正確的。表1NS2、NP基因的定點突變引物和A型流感病毒通用引物
權利要求
1.一種PR8重組流感病毒，其特征在于，其含有H3亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因( 81，？82，？么，冊^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變。
2.一種制備權利要求I所述的PR8重組流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟 構建分別包含H3亞型流感病毒的HA和NA基因的重組質粒； 構建包含PR8病毒突變基因片段的重組質粒，該PR8病毒突變基因片段選自下述突變的NS或NP基因片段編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段，編碼含有G132A點突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段； 將上述H3亞型流感病毒的HA基因的重組質粒和NA基因的重組質粒，與上述包含PR8病毒突變基因片段的重組質粒、以及分別包含PR8病毒PA、PBU PB2、M、NP或NS內部基因的質粒按相應組合一起轉染293T細胞，培養轉染后的細胞； 將培養的細胞上清接種于雞胚，在孵化器內培養合適時間后，收獲雞胚尿囊液，檢測該尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且經過序列分析確定沒有非預期突變后，即獲得PR8重組流感病毒。
3.權利要求I所述的PR8重組流感病毒在制備流感疫苗中的應用。
4.一種疫苗，其特征在于，包含權利要求I所述的PR8重組流感病毒。
全文摘要
本發明公開了一種PR8重組流感病毒，該重組流感病毒含有H3亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個內部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點突變、或E74S點突變、或E67S/E74S點突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點突變。本發明還公開了上述PR8重組流感病毒的制備方法和應用。本發明通過構建重組質粒、共轉染細胞和SPF雞胚擴增得到的PR8重組流感病毒，能高效表達HA蛋白和/或NA基因，可用于大規模制備流感疫苗。
文檔編號A61K39/145GK102876638SQ20121034950
公開日2013年1月16日 申請日期2011年9月8日 優先權日2011年9月8日
發明者李澤君, 滕巧泱 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所