專利名稱：一種用于靶向藥物載體的核酸適體的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于靶向藥物載體的核酸適體。
背景技術：
癌癥是一類引起人類死亡的主要疾病，每年全球因癌癥死亡人數大約為700萬。隨著細胞生物學的發展以及對癌癥發病機制的了解，癌癥的化學藥物治療得到了很好的發展。目前大約有90多種化學藥物發展用于殺死腫瘤細胞和癌癥治療。但是這些藥物缺乏靶向特異性，在臨床上通常給患者帶來致命的副作用。同時，小分子核酸藥物在體外抗腫瘤實驗中都取得了比較好的結果，但是一旦應用于體內，就會被人體內的酶所分解；而體外對小分子核酸藥物進行修飾后，雖然可以抵御酶的切割，但是又改變了作用機理。因此需要發展既能靶向攜帶藥物攻擊腫瘤細胞，又能抵御核酸酶降解的靶向載體。
核酸適體是通過指數富集的配體系統進化法從DNA/RNA文庫中篩選出來的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。它通過分子內堿基堆積、疏水、氫鍵和靜電等作用力折疊成獨特的空間結構，從而高特異性和高親和力識別其靶標分子。核酸適體與靶標分子結合的特異性和親和力與抗體相似，甚至更強。核酸適體具有較低的分子量、無免疫原性、快速的組織通透性和良好的代謝動力學。核酸適體一旦證實，就可以通過自動化的固相合成的方法制備，從而保證了不同批次之間產品不會存在差異。核酸適體化學性質穩定和容易通過化學修飾賦予其其它功能。更重要的是，與抗體相比，核酸適體的靶標范圍更廣。一些與疾病緊密相關的生長因子、酶、受體以及腫瘤標志物等物質都能成為核酸適體的靶標。目前針對血管表皮生長因子受體的核酸適體作為治療老年濕性黃斑疾病藥物已經被FDA批準上市；同時還有八種核酸適體藥物處于不同臨床考察階段。因此針對與疾病相關分子的核酸適體作為一種潛在的靶向載體攜帶藥物吸引著研究者的注意。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種核酸適體。本發明提供的核酸適體，其為序列表中序列I所示的單鏈DNA分子。上述的核酸適體作為藥物載體的應用也是本發明保護的范圍。本發明的另一個目的是提供一種藥物載體。本發明提供的藥物載體，其活性成分為上述的核酸適體。上述應用或藥物載體中，所述藥物為如下I)或2):I)預防和/或治療腫瘤的藥物；所述腫瘤具體為肺腺癌；2)殺傷和/或抑制腫瘤細胞的藥物；所述腫瘤細胞具體為肺腺癌細胞；所述肺腺癌細胞進一步具體為A549細胞系。本發明的第三個目的是提供一種產品。本發明提供的產品，為由上述的核酸適體和靶藥物連接得到的產物；所述產品為如下I)或2):I)預防和/或治療腫瘤的產品；2)殺傷和/或抑制腫瘤細胞的產品。上述產品中，所述靶藥物為C70三加成丙二酸二乙酸(TF70);該化合物通過如下方法合成I)向IOmg C70中加入25ml甲苯溶液,攪拌分散均勻,得到C7tl甲苯溶液；向恒壓漏斗中加入21ml甲苯溶液；2)向C7tl甲苯溶液中通入氮氣十分鐘，再向C7tl甲苯溶液中加入8. 1μ I溴代丙二酸二乙酯；向恒壓漏斗中的甲苯溶液中加入7. 1μ I DBU溶液，輕搖漏斗，使分散均勻，得到含DBU的甲苯溶液(溴代丙二酸二乙酯DBU=1:1，DBU :C7(I=6:1，物質的摩爾比)；
3)繼續通入氮氣十分鐘，打開恒壓漏斗，開始滴加含DBU的甲苯溶液，控制溶液一小時內加完，繼續反應兩小時，停止反應，以一次性濾器過濾，收集清液于50ml單口瓶中，放置過夜后過高效液相色譜柱，流動相為甲苯，流速為6ml/min。先進樣2ml，觀察保留時間為40分鐘的峰形，確定需要收取的的樣品組分以及每次的進樣間隔；4)收集純化后的C7tl衍生物，取樣進行質譜檢測。其余部分旋轉蒸發去除樣品中的甲苯，加入40ml乙醇。超聲分散貼在瓶壁的C7tl衍生物，攪拌使C7tl衍生物盡量分散在乙醇溶液中。以氫氧化鈉的乙醇溶液(20mg NaOH, Iml H20,9ml乙醇)水解C7tl衍生物得到相應的富勒酸衍生物，以O. 2μπι濾器過濾，將溶液收集于無菌容器中封口備用，4°C保存備用，得到TF70。上述產品中，上述的核酸適體和上述C70三加成丙二酸二乙酸通過酰胺鍵連接。上述產品為藥物，其中，所述腫瘤為肺腺癌；所述腫瘤細胞為肺腺癌細胞；所述肺腺癌細胞具體為A549細胞系。上述的核酸適體在制備預防和/或治療腫瘤的產品中的應用也是本發明保護的范圍。上述的核酸適體在制備殺傷和/或抑制腫瘤細胞的產品中的應用也是本發明保護的范圍。上述應用中，所述腫瘤為肺腺癌；所述腫瘤細胞為肺腺癌細胞；所述肺腺癌細胞具體為A549細胞系，上述產品為藥物。本發明的實驗證明，本發明提供了一條核酸適體R13，它是從人肺癌細胞A549細胞中利用細胞篩選法得到的一段單鏈DNA分子。它對A549細胞具有很高的親和力，而且，還可以進入A549細胞。在體外實驗中，R13作為藥物載體攜帶光治療劑TF70，大大提高TF70對A549的殺傷作用，靶向性強。
圖I為共聚焦檢測核酸適體R13特異性表征圖2為流式細胞術法對R13與A549細胞的結合特異性表征圖3為TF70-R13 (酰胺鍵連接產物)連接示意4為藥物殺傷細胞的細胞存活率結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中部分實驗材料和試劑如下肺腺癌A549細胞系購自ATCC，編號為CCL-185 ；肺腺癌A549細胞穩定轉染EGFR-GFP (來自重組質粒pEGFP_EGFR，由中科院廣州生物醫藥與健康研究院提供。質粒PEGFP購自英駿公司Invitrogen)，命名為EGFR-A549細胞；用于培養肺腺癌A549的細胞培養液為DMEM+10%胎牛血清。
PBS緩沖液pH為7. 4，由水和溶質組成；溶質及其濃度為39mM NaH2PO4,
6ImMNa2HPO4,150mM NaCl ；結合緩沖液pH為7. 4，由PBS緩沖液和溶質組成；溶質及其濃度為lmM MgCl2,O. 05%BSA，0. 2mg/ml 酵母轉移 RNA (Invitrogen 公司及產品目錄號 15401-011)；洗滌緩沖液pH為7. 4，由PBS和溶質組成；溶質及其濃度為ImM MgCl2 ；FBS :胎牛血清，購自GIBCO (美國)；實施例I、核酸適體R13的獲得一、核酸適體R13的獲得I、核酸適體R13的篩選I), DNA文庫的預處理5nmol DNA 文庫(5，-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG(40N) CTC ATG GAC GTG CTGGTG AC-3’ )溶解后，經94°C加熱和冰上冷卻處理，置于37°C待用。2)、反向篩選取3 X IO5個A549細胞，加入已預處理的DNA文庫，加入FBS,于37°C搖床中(轉速IOOrpm)孵育I小時，吸取上清。3)、正向篩選取3X 105EGFR-A549細胞珠，加入反篩后的溶液，于37°C搖床中(轉速IOOrpm)孵育I小時。吸棄上清液；用PBS洗滌細胞2次，再用細胞刮把細胞刮下來，離心洗滌3次(轉速lOOOrpm)，每次5分鐘。將EGFR-A549細胞中加入500ulPBS，95°C加熱洗脫DNA后，告訴離心(12000rpm)收集上清液用于PCR擴增的模板。2、篩選優化為了獲得高親和性和特異性的核酸適體，在篩選的過程中逐步改變篩選時間、正篩洗滌次數增加篩選壓力；同時用共聚焦熒光顯微鏡對每輪的篩選結果進行了初步考察。3、PCR 及 ssDNA 分離PCR 反應體系組成10 μ L 10XPCR 緩沖溶液(IOOmM Tri s_HCl，pH 8. 3 ；15mMMgC12)、3μ L ImM dNTPs, 3 μ L25 μ M FITC標記的上游引物(5’_ACG CTC GGA TGC CACTAC AG-3’)和生物素標記的下游引物(5，-GTC ACCAGC ACG TCC ATG AG_3，)、0. 25 μ LTaq熱啟動聚合酶，5-15 μ L篩選產物、和69-79 μ L滅菌蒸餾水。熱循環條件94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s。在擴增之前用瓊脂凝膠電泳考察不同循環擴增產物，選取適當的循環次數。
4、ssDNA 分離利用親和素包被的葡聚糖微珠親和吸附，O. 2M的氫氧化鈉分離雙鏈，使FITC標記的ssDNA與生物素標記的ssDNA分離。再將FITC標記的ssDNA過NAP-5柱子進行脫鹽，并收集O. 5-1. 5mL之間的濾液。用UV-vis光譜測定收集溶液中的DNA濃度。DNA經凍存低溫干燥后于_20°C保存或用于下輪篩選。5、克隆測序經過23輪篩選后，觀察隨實驗的即時表征，當熒光強度不再增強時，取最后一次篩選產物為模板和無標記的上下游引物按照上述PCR反應條件和步驟進行PCR擴增，將獲得的無標記DNA雙鏈產物按照pMDlS-T Vector試劑盒手冊操作，然后隨機測序。6、序列分析通過分析ssDNA的一級結構，然后根據隨機序列中是否存在共同保守序列將所得 序列進行分類。結果通過克隆，選取160個樣本進行測序，并按照DNA —級結構進行分類，得到高度富集的適體序列，其中一條序列對A549細胞具有高度的特異性并且能進入A549細胞。經過序列優化，最終的序列裁減為5 ‘-TTTATGGGTGGGTGGGGGGTTTTT-3’(序列I);序列保護時，與其相似度為75%-90%的序列都為類似序列，該序列所示單鏈DAN分子即為核酸適體R13。上述核酸適體R13可以人工合成序列I。上述核酸適體R13可分別用Cy3和Cy5標記(Cy3和Cy5均標記核酸適體R13的5’端)，得到Cy3標記核酸適體R13和Cy5標記核酸適體R13。二、核酸適體R13特異性表征I、共聚焦檢測R13特異性將Cy3標記核酸適體R13加入肺腺癌A549細胞培養液(將A549細胞在DMEM+10%胎牛血清中培養得到)，使Cy3標記核酸適體R13在總體系中的終濃度為2uM ;共同孵育18小時(37度，5% 二氧化碳)。共孵育后做共聚焦檢測(559nm激發)，激光器型號FV1000-IX81, Olympus, Japan)，收集顯微鏡型號NA O. 40，UPLASPO, Olympus，結果如圖 I所示，可以看出，發現核酸適體R13可以進入A549細胞，甚至可以進入細胞核內。2、流式細胞術法檢測R13與A549細胞的結合特異性取肺腺癌A549細胞10萬左右，用O. 02%EDTA消化，PBS洗滌二次；收集細胞，分別加入200nM的Cy5標記核酸適體Rl3和200nM Cy5標記的對照DNA序列(5，-AATTTTTTAATTATTTATATTA-3’，Cy5 標記在對照 DNA 序列的 5’ 端)，37 度孵育 40 分鐘；PBS洗滌一次，用流式細胞儀檢測核酸適體R13與A549細胞的結合情況。以A549細胞不加入任何DNA片段為對照(A549細胞)。結果如圖2所示，I為A549細胞，2為A549細胞與Cy5標記的對照序列的結合，3為A549細胞與Cy5標記的R13的結合，可以看出，與對照序列相比，R13與A549細胞具有很高的親合力。從上述實驗可以看出，核酸適體R13可進入A549細胞且與其特異結合。實施例2、核酸適體R13作為靶向藥物載體的應用一、TF70-R13 (酰胺鍵連接產物)的制備
1、TF70 的制備TF70為一種光治療劑，為C7tl三加成丙二酸二乙酸，其合成步驟如下I)向IOmg C70中加入25ml甲苯溶液,攪拌分散均勻,得到C7tl甲苯溶液；向恒壓漏斗中加入21ml甲苯溶液；2)向C7tl甲苯溶液中通入氮氣十分鐘,再向C7tl甲苯溶液中加入8. I μ I溴代丙二酸二乙酯；向恒壓漏斗中的甲苯溶液中加入7. 1μ I DBU (1,8-二氮雜二環[5. 4. O]十一碳-7-烯)溶液，輕搖漏斗，使分散均勻，得到含DBU的甲苯溶液(溴代丙二酸二乙酯DBU=I: I, DBU :C7Q=6:1，物質的摩爾比)；3)繼續通入氮氣十分鐘，打開恒壓漏斗，開始滴加含DBU的甲苯溶液，控制溶液一小時內加完，繼續反應兩小時，停止反應，以一次性濾器過濾，收集清液于50ml單口瓶中，放置過夜后過高效液相色譜柱，流動相為甲苯，流速為6ml/min。先進樣2ml，觀察保留時間 為40分鐘的峰形，確定需要收取的的樣品組分以及每次的進樣間隔；4)收集純化后的C7tl衍生物，取樣進行質譜檢測。其余部分旋轉蒸發去除樣品中的甲苯，加入40ml乙醇。超聲分散貼在瓶壁的C7tl衍生物，攪拌使C7tl衍生物盡量分散在乙醇溶液中。以氫氧化鈉的乙醇溶液(20mg NaOH, Iml H20,9ml乙醇)水解C7tl衍生物得到相應的富勒酸衍生物，以O. 2μπι濾器過濾，將溶液收集于無菌容器中封口備用，4°C保存備用，得到TF70。2、TF70_R13 (酰胺鍵連接產物)的制備將上述I得到的TF70與由實施例I得到的核酸適體Rl3酰胺鍵連接得到TF70-R13 ;連接示意圖如圖3所示,具體過程如下所示將O. Iml上述I得到的TF70 (O. 5mg/ml)與2. Oml純水混合，超聲分散十分鐘，加入O. 5ml MES緩沖液(pH 5. 8，O. 5M)，備用，得到TF70溶液；再將新鮮制備的EDC水溶液(7mg/ml)和Sulfo-NHS水溶液(13mg/ml)加入TF70溶液中，室溫(25°C )下攪拌活化30分鐘后加入50D由實施例I得到的核酸適體R13，繼續反應3. O小時后對產物進行超濾和透析(超濾管分子量10KD，透析袋MW cut off 3500)以除去多余的反應物，得到TF70-R13。二、R13作為靶向藥物載體的靶向性功能驗證將A549細胞分為如下三組處理對照組(control):將IO6的A549細胞在細胞培養液中培養(37度，5% 二氧化碳)3小時；TF70組將IO6的A549細胞在含有IOuM TF70的細胞培養液中培養(37度，5% 二氧化碳)3小時；TF70-R13組將IO6的A549細胞在含有IOuM TF70-R13的細胞培養液中培養(37度，5% 二氧化碳)3小時；然后將上述3組細胞均用強度為20mW/cm2的光照，照射時間為5分鐘、15分鐘、30分鐘；照射30分鐘后用細胞計數板進行計數各組細胞數量，利用CCK-8方法通過450nm波長下的吸收值來反應細胞存活率，實驗重復三次，結果取平均值。結果如圖4所示，可以看出對照組(control)的細胞存活率為100% ；
TF70組的細胞存活率為85% ；TF70-R13組的細胞存活率為8% ；從上述結果可以看出，與單獨加入TF70相比，加入TF70-R13后光照培養，A549細胞大量死亡；說明核酸適體R13作為靶向性藥物載體，大大提高了 TF70 對A549細胞的殺傷作用。
權利要求
1.一種核酸適體，其為序列表中序列I所示的單鏈DNA分子。
2.權利要求I所述的核酸適體作為藥物載體的應用。
3.—種藥物載體，其活性成分為權利要求I所述的核酸適體。
4.根據權利要求2所述的應用或權利要求3所述的藥物載體，其特征在于 所述藥物為如下I)或2): O預防和/或治療腫瘤的藥物；所述腫瘤具體為肺腺癌； 2)殺傷和/或抑制腫瘤細胞的藥物；所述腫瘤細胞具體為肺腺癌細胞；所述肺腺癌細胞進一步具體為A549細胞系。
5.一種產品，為將權利要求I所述的核酸適體和靶藥物連接得到的產物；所述產品為如下I)或2): 1)預防和/或治療腫瘤的產品； 2)殺傷和/或抑制腫瘤細胞的產品。
6.根據權利要求5所述的產品，其特征在于所述靶藥物為C70三加成丙二酸二乙酸； 權利要求I所述的核酸適體和所述C70三加成丙二酸二乙酸通過酰胺鍵連接。
7.根據權利要求5或6所述的產品，其特征在于所述產品為藥物；所述腫瘤為肺腺癌；所述腫瘤細胞為肺腺癌細胞；所述肺腺癌細胞具體為A549細胞系。
8.權利要求I所述的核酸適體在制備預防和/或治療腫瘤的產品中的應用。
9.權利要求I所述的核酸適體在制備殺傷和/或抑制腫瘤細胞的產品中的應用。
10.根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于所述腫瘤為肺腺癌；所述腫瘤細胞為肺腺癌細胞；所述肺腺癌細胞具體為A549細胞系。
全文摘要
本發明公開了一種用于靶向藥物載體的核酸適體。本發明提供的核酸適體，其為序列表中序列1所示的單鏈DNA分子。本發明的實驗證明，本發明提供了一條核酸適體R13，它是從人肺癌細胞A549細胞中利用細胞篩選法得到的一段DNA序列。它對A549細胞具有很高的親和力，而且，還可以進入A549細胞。在體外實驗中，R13作為藥物載體攜帶光治療劑TF70，大大提高TF70對A549的殺傷作用，靶向性強。
文檔編號A61K47/48GK102876681SQ20121034810
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者方曉紅, 徐麗, 劉巧玲, 張振, 鄭俊鵬, 王春儒 申請人:中國科學院化學研究所