專利名稱：用于基因傳遞的具有增強內吞作用的表面的全氟化碳納米乳液的制作方法
技術領域：
本發明在于提供穩定的適合用于基因傳遞的全氟化碳納米乳液、其制備和應用。
背景技術：
常規的寡核苷酸和近年來的短干擾RNA是有希望用于基因傳遞的并被廣泛使用的物質。至今，將該遺傳物質應用于活體動物的可能性是非常有限的。對于遺傳物質的遞送，全氟化碳(PFC)乳液成功地用作氧轉運體，因此這些乳液是一種有前途的工具(Daugherty, W. P.,等，Neurosurgery54:1223-1230 (2004) ; Ries s, J. G. , Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 33:47-63 (2005))。在氣管內應用后，常規的全氟化碳乳液可以將藥物運輸至肺(Dickson, E. W.等，Acad. Emerg.Med. 10:1019-1023(2003)) ο此外，PFC乳液具有通過呼氣安全清除的優勢(Putyatina，T.K.等，Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 22:1281-1285(1994))。因此，全氟化碳可以作為用于將遺傳物質遞送至活體動物的有效和安全的工具而發揮作用。由于其作為氧轉運體的功能，常規的PFC-乳液具有的尺寸阻止其離開血管床并且因此上述乳液將不能夠將物質轉運至活生物體的細胞中。過去幾年中，已經提出了幾種不太有效的轉運系統，例如，結合膽固醇或由載脂蛋白 A 介導至肝內的轉運體(Kim, S. I.等，A-I. Mol. Ther. 15:1145-1152(2007))。EP-B-0788347公開了平均直徑為至多IOnm的含有水滴的油包水氟碳化合物乳液的制備。將氟化的表面活性劑或含有至少一種氟化的表面活性劑的表面活性劑混合物用作乳化劑。EP-A-1844772公開了一種用于以寡核苷酸轉染細胞的組合物，其中乳化劑是具有C10-C36烴或氟碳鏈的咪唑鎗衍生物。EP-B-00831770公開了含有攜帶藥物活性化合物的不連續相的氟化化合物的連續微分散體。US 2004/0115159公開了一種水包油納米乳液，其由表面活性物質的三元體系組成，適合作為用于化妝品和藥劑的轉運劑。此三元體系含有陰離子、陽離子和兩親性表面活性劑。US 7211248公開了用DNA轉染肝細胞的方法，其中超聲造影劑補充以帶有質粒DNA的蛋白穩定微粒。轉染通過肝細胞的超聲作用來實現。US 2007/0184076公開了一種納米液滴混合物，其由氟碳化合物和例如抗癌劑的治療活性物質的生物學可接受的油混合物組成。US 2006/0013820公開了一種組合物，其含有多種氟碳化合物、適合作為治療劑的抗原和任選地含有其他的藥物載體。該組合物據說適合作為疫苗，尤其用于治療HIV。
WO 96/40057、WO 96/40053和EP-A-1306083公開了作為治療活性物質的載體的
穩定的全氟化碳(納米)乳液。US 6071890公開了在體內負載DNA和RNA的轉運體和還負載生物學活性化合物的兩親性陽離子物質。這些物質與類固醇結合。WO 01/722812公開了一種作為轉染劑的微粒，其含有聚合物質、生物學活性治療因子和脂蛋白。仍然需要用于在生物體中基因傳遞的可靠的轉運載體。發明的概述·目前發現具有增強內吞作用的表面的全氟化碳納米乳液、特別是含有作為乳化劑的磷脂的具有增強內吞作用的表面的全氟化碳納米乳液，適合于在體內施用遺傳物質。添加為納米乳液提供增強內吞作用的表面的分子，顯著地增加細胞對全氟化碳納米乳液的攝取。因此，本發明在于提供(I) 一種穩定的具有增強內吞作用的表面的全氟化碳納米乳液；(2)上述(I)的優選實施方式，其中上述納米乳液具有連續的全氟化碳相和緩沖的不連續水相，并且含有(a)全氟化碳組分，其含有至少一種全氟化碳化合物；(b)乳化組分；和(C)增強內吞作用的組分，其含有至少一種通過內吞作用誘導細胞攝取上述納米乳液的化合物；(3) 一種含有上述⑴或(2)中所定義的納米乳液的基因傳遞劑或藥物組合物，(4) 一種制備上述(I)或(2)上述的納米乳液或上述(3)上述的基因傳遞劑或藥物組合物的方法,上述方法包括如下步驟(a)制備含有上述乳化組分的緩沖的水溶液，(b)加入上述全氟化碳組分，和(c)隨后通過高壓勻化機混合和勻化步驟(b)的反應產物；(5)上述(I)或(2)中所定義的納米乳液在制備用于將遺傳物質傳遞至患者的藥物中的應用；(6) 一種將遺傳物質傳遞至患者的方法，該方法包括向上述患者施用上述(I)或
(2)中所定義的納米乳液或上述(3)中所定義的基因傳遞劑或藥物組合物；以及(7) 一種用于在體外將親水化合物傳遞至細胞的方法，該方法包括將上述細胞與上述(I)或(2)中所定義的納米乳液接觸或與上述(3)中所定義的基因傳遞劑接觸。
圖I表示加熱裝置的溫度廓線和以5只麻醉小鼠的標準差作出的平均體溫。圖2表示在冷卻過程(對照)中的以5只麻醉小鼠的標準差作出的平均動脈血壓。圖3表示在施用ACE抑制劑卡托普利(n=5，10mg/kg卡托普利)后6 7小時的平均動脈血壓(土SD)(灰點=對照值，黑點=實際值)。圖4表示在施用帶有血管緊張素原siRNA的納米載體(n=5, 300 μ I納米載體，60 μ g Agt siRNA,表面由Fortecortin保護的轉鐵蛋白)后24小時的平均動脈血壓(土SD)，灰點=對照值，黑點=實際值。圖5表示在2秒“流體動力學轉染”內注射施用不含納米載體血管緊張素原siRNA(n=5,60y g Agt siRNA)后24小時的平均動脈血壓(土SD)，灰點=對照值，黑點=實際值。圖6表示使用不完全納米載體施用血管緊張素原siRNA后24小時的平均動脈血壓(土SD)，上述納米載體的表面不含增強內吞作用的蛋白轉鐵蛋白(η=5，300μ1納米載體，60yg Agt siRNA,表面無轉鐵蛋白，加入Fortecortin),灰點=對照值,黑點=實際值。圖7表示使用納米載體施用非編碼siRNA后24小時的平均動脈血壓(土SD) (n=5,300 μ I納米載體,60 μ gAgt siRNA,表面由Fortecortin保護的轉鐵蛋白)，灰點=對照
值，黑點=實際值。圖8表示在僅施用納米載體后24小時的平均動脈血壓(土 SD) (n=5, 300 μ I納米載體，60 μ gAgt siRNA,表面由Fortecortin保護的轉鐵蛋白)，灰點=對照值，黑點=實際值。圖9表示納米載體的粒子的電子顯微鏡圖像。該粒子具有約50納米的大小。圖10顯示處于46. 000倍放大下的肝細胞。在靜脈內注射含有siRNA的納米載體后30分鐘將肝臟切除。箭頭標記了在受體介導的內吞作用后含有負載有siRNA的納米載體的粒子的內涵體。膜和細胞表面旁粒子周圍的自由空間表明攝取通過受體介導的內吞作用發生。圖11顯示處于50. 000倍放大下的肝細胞的電子顯微鏡圖像。在靜脈內施用納米載體和siRNA后2小時，將肝臟切除。可以看到含有深色結構的納米載體的圓形囊泡，其周圍沒有膜。不像圖10的圖像中的納米載體囊泡，這些粒子沒有被膜覆蓋。很顯然，所有可看見的納米載體均釋放至細胞液中。圖12表示圖10中顯示的電子顯微鏡切片的放大細節。在175. 000倍放大倍數下，顯示釋放至細胞質中的負載有siRNA的納米載體的粒子。在圖10和11中也可以看到的粒子內的深色結構對應于含有的siRNA。圖13顯示處于50. 000倍放大下的肝細胞的電子顯微鏡圖像。在靜脈內注射后4小時，將動物處死并提取肝臟。在此時間點，納米載體不再含有圖10 12中可見到的深色結構。非常有可能由上述納米載體遞送的siRNA釋放至細胞質中。
具體實施例方式本發明的方面⑴或⑵的穩定的全氟化碳納米乳液(此后簡稱為“本發明的納米乳液”)具有連續的全氟化碳相和緩沖的不連續的水相。優選緩沖的水相占納米乳液的25 60重量％。用于水相的適當的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液,例如磷酸二氫鈉。本發明的納米乳液是指其具有低于IOOnm的粒度的納米乳液。優選本發明的納米乳液由具有約50nm的平均粒度的粒子組成。本發明的納米乳液包括含有至少一種全氟化碳化合物的全氟化碳組分(a)、優選地含有磷脂作為基本乳化化合物并且還含有輔助脂質的乳化組分(b)、和含有至少一種誘導細胞攝取納米乳液的化合物的增強內吞作用的組分(C)。組分(a)的至少一種全氟化碳化合物優選選自具有結構CmF2m+1X、XCmF2mX,XCnF2n0CoF2oX> N(C0F20X) 3和N(C0F2o+i) 3的化合物(其中m是3 10的整數，η和ο是I 5的整數，并且X每次出現獨立地選自Cl、Br和I)。組分(a)可以含有上述全氟化碳化合物的混合物。特別優選全氟化碳化合物是全氟溴辛烷、全氟三丁胺和它們的混合物。乳化組分(b )可以包括本領域中已知的多種乳化化合物，特別是在介紹中引用的參考文獻中公開的乳化化合物。優選的乳化化合物是磷脂，甚至如上面所給出的，特別優選磷脂是乳化組分(b)的基本乳化化合物。因此，乳化組分(b)優選包括至少一種通式I所示的磷脂化合物或其藥理學可接受的鹽
權利要求
1.一種穩定的具有增強內吞作用的表面的全氟化碳納米乳液，含有 (i)全氟化碳組分，其含有至少一種全氟化碳化合物； (ii)乳化組分；和 (iii)轉鐵蛋白或其片段或衍生物作為增強內吞作用的組分，其誘導細胞通過內吞作用攝取所述納米乳液， 并且所述全氟化碳納米乳液通過包括以下步驟的方法獲得 (a)制備含有乳化組分的緩沖的水溶液， (b)加入所述全氟化碳組分， (C)隨后混合、高壓勻化步驟(b)的反應產物，和 (d)向步驟(C)的反應產物中加入增強內吞作用的組分，并勻化所得的混合物。
2.如權利要求I所述的納米乳液，其特征在于 具有小于IOOnm的粒度,優選所述納米乳液由具有約50nm的平均粒度的粒子組成。
3.如權利要求I或2所述的納米乳液，其特征在于 所述緩沖的水相占所述納米乳液的25 60重量％。
4.如權利要求I 3中任一項所述的納米乳液，其特征在于 所述增強內吞作用的組分為轉鐵蛋白。
5.如權利要求I 4中任一項所述的納米乳液，其特征在于 所述至少一種全氟化碳化合物選自CmF2m+1X、XCmF2mX, XCnF2nOC0F20X, N (C0F20X) 3和N(CtjF2M)3，其中，m是3 10的整數，11和O是I 5的整數，并且X每次出現獨立地選自CUBr和I，優選所述全氟化碳選自全氟溴辛烷、全氟三丁胺和它們的混合物。
6.如權利要求I 5中任一項所述的納米乳液，其特征在于 所述乳化組分含有作為基本乳化組分的至少一種磷脂和一種或多種輔助脂質。
7.如權利要求6所述的納米乳液，其特征在于 所述至少一種磷脂選自通式I所示的化合物或其藥理學可接受的鹽，
8.如權利要求7所述的納米乳液，其特征在于 所述磷脂組分選自磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺及其混合物。
9.如權利要求6 8中任一項所述的納米乳液，其特征在于所述輔助脂質選自脂肪酸、類固醇、維生素及其混合物。
10.如權利要求I 9中任一項所述的納米乳液，其特征在于 含有作為全氟化碳組分(a)的全氟溴辛烷、包括磷脂酰膽堿、鞘磷脂、膽固醇和溶血磷脂酰膽堿作為磷脂的乳化組分(b)和作為所述增強內吞作用的組分(C)的轉鐵蛋白。
11.如權利要求I 10中任一項所述的納米乳液，其特征在于 適合于在體內和體外將包括藥物和遺傳物質的親水化合物傳遞至細胞，優選所述納米乳液適合于傳遞選自RNAjP DNA序列以及它們的組合和衍生物的遺傳物質，最優選傳遞miRNA、siRNA 或 dsRNA。
12.—種基因傳遞劑或藥物組合物，其特征在干 含有權利要求I 11中任一項所述的納米乳液。
13.如權利要求12所述的基因傳遞劑或藥物組合物，其特征在于 還含有在體內和體外傳遞至細胞的藥物和遺傳物質，優選所述基因傳遞劑或藥物組合物包括選自RNAdP DNA序列以及它們的組合和衍生物的遺傳物質，最優選包括miRNA、siRNA 或 dsRNA。
14.ー種制備權利要求I 11所述的納米乳液或權利要求12或13所述的基因傳遞劑或藥物組合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟 (a)制備含有乳化組分的緩沖的水溶液， (b)加入所述全氟化碳組分，和 (c)隨后混合、高壓勻化步驟(b)的反應產物。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，還包括 (d)向步驟(C)的反應產物中加入用于傳遞的增強內吞作用的組分和/或親水化合物，并勻化所得的混合物。
16.一種用于在體外將親水化合物傳遞至細胞的方法，其特征在于包括將所述細胞與權利要求I 11所述的納米乳液接觸或與權利要求12或13所述的基因傳遞劑接觸。
17.權利要求I 11所述的納米乳液在制備用于將藥物和遺傳物質傳遞至患者的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供穩定的適合用于基因傳遞的全氟化碳納米乳液、其制備和應用，該全氟化碳納米乳液具有增強內吞作用的表面。
文檔編號A61K48/00GK102847170SQ201210345209
公開日2013年1月2日 申請日期2009年5月13日 優先權日2008年5月19日
發明者S.施賴伯 申請人:塞爾聞緹斯集團