專利名稱：特拉唑嗪或其鹽在制備用于治療敗血癥/腦卒中的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及特拉唑嗪或其鹽或其溶劑化合物在制備用于治療人敗血癥/腦卒中引起細胞凋亡癥狀的藥物制劑。
背景技術：
特拉唑嗪是一種化學合成物質，該化合物最初公開于美國專利申請US19850805905 ;US4734418A，1987年美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于治療高血壓(NDA#019057)，1994年美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于治療前列腺疾病(NDA#020347)。特拉唑嗪，英文名稱Terazosin、Terazosinhydrochloride^Hytrine0 鹽酸特拉唑嗪，其化學名為I-(4-氨基-6，7-二甲氧基-2喹唑啉基)-4-(四氫呋喃-2-甲酰基)哌嗪，單鹽酸鹽二水合物。分子式C19H25N504 .HCl ·2Η20分子量459. 93。美國專利4251532
公開了鹽酸特拉唑嗪在高血壓治療中的作用。
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H3CON NN一C~C >>本品為選擇性α I受體阻滯劑，能降低外周血管阻力，對收縮壓和舒張壓都有降低作用；具有松弛膀胱和前列腺平滑肌的作用，可緩解良性前列腺肥大而引起的排尿困難癥狀，常用于治療良性前列腺增生和高血壓。但是在敗血癥/腦卒中病癥中的治療作用未見報道。特拉唑嗪國內外專利背景說明細胞凋亡(apoptosis)又稱編程性死亡，是生物界重要的生命現象之一。從線蟲至高等哺乳類動物，從胚胎至成人，從生理到病理，從生到死整個過程，體內不同的細胞多具有此種死亡形式。早在100多年前Carl Vogt已發現這種死亡形式。1972年Kerr等人重新提出研究，并命名為凋亡(apoptosis)。其后在凋亡的形態學和生物化學等領域取得新的認識。近期的研究在3方面有明確的進展。首先，從研究小線蟲(C. elegans)凋亡調節基因，證實凋亡的發展是由遺傳基因控制，其中以Ced-9，Ced-3和Ced_4基因的作用最先確定，哺乳動物也有相應的同源基因。其次，闡明凋亡信號傳遞途徑，特殊的死亡信號分子激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族(稱為caspases)，誘導細胞凋亡。第三，研究了凋亡和一些疾病的關系，了解疾病發病機制及應用凋亡理論和實踐來防治疾病。一、細胞凋亡的形態學和生物化學改變細胞凋亡的形態改變是多階段的，首先是細胞縮小，胞質凝縮，內質網疏松并和胞膜融合，核糖體、線粒體等聚集，但結構無明顯改變。染色質逐漸凝集成新月狀，附在核膜周邊，嗜堿性增強。以后細胞核固縮成均一的致密物，進而核碎裂，胞膜完整。繼之核膜出芽，固縮染色質脫落，形成膜包凋亡小體(apoptotic bodies)。最終凋亡小體被周圍吞曬細胞吞嗤降解。隨著細胞凋亡形態的研究，細胞生化的改變也逐步被闡明。(I)鈣離子和蛋白激酶改變細胞內Ca2+的堆積和重新分布，細胞核內Ca2+的增多，激活核酸內切酶的活性，蛋白激酶C在不同細胞類別和不同周期活性表現不一。(2)核酸內切酶激活把DNA內切成180堿基對倍數的核苷酸片段，呈梯狀電泳現象。(3)組織谷氨酰胺轉移酶的積累并激活。(4)細胞骨架如肌動蛋白的變化。(5)細胞表面糖鏈、植物血凝素與玻連蛋白受體增加，磷脂酰絲氨酸的外露改變細胞表面的生化特性。二、凋亡產生的3步驟凋亡的發生和發展概括為3個階段信號傳遞階段、中央調控階段和結構改變階段。 I.信號傳遞誘導凋亡的細胞外因素(包括環境因素和體內因素)眾多，進入細胞內是經信號傳遞階段。各種誘導凋亡因子進入細胞內的途徑是多種多樣的，其中主要的是通過受體介導。接受凋亡信號的受體位于細胞表面,稱為死亡受體(death receptors,DR),當死亡配體(death ligands)和它結合激活死亡蛋白酶系統(death caspase)可以在幾小時內誘導細胞凋亡。死亡受體有腫瘤壞死因子受體基因家族，CD95 (Fas或Apol)和DR(或ΑΡ0)系列。死亡受體分為細胞膜外和胞質兩區域，前者傳導死亡信號，后者稱死亡區域(death domain),參與激發蛋白酶系列和細胞產生凋亡調節機制。2.中央調控凋亡激發因子作用在線粒體，使線粒體內死亡基因ced-3/白細胞介素1β轉化酶(ICE)和ced-4(ced為線蟲基因，ICE為哺乳類基因)及死亡抑制基因ced-9/bcl-2 (ced-9在線蟲體內，哺乳類動物相應基因為bcl_2)激活，兩者何居優勢，決定細胞存活或凋亡。當ced_9/bcl_2和ced_4(連接蛋白)和ced-3/ICE相結合，ced-3不能活化，防止一連串caspases級聯反應,細胞存活；當ced-9/bcl_2被促凋亡因子EGL-I結合，bcl-2失活,ced-4使ced-3/ICE活化引起細胞凋亡。線粒體釋放細胞色素c (Cyto c)亦可使caspases活化,產生蛋白溶解,引起細胞凋亡。3.細胞結構改變在前兩階段基礎上，凋亡細胞出現特異的形態變化如細胞皺縮，核致密，微絨毛消失。生化特點是多種酶活化。細胞核的改變，認為是caspases活化的DNA酶(CAD)進入細胞核內使染色體的DNA斷裂引起細胞死亡。CAD的抑制因子ICAD拮抗CAD。最近國內外研究表明，特拉唑嗪在前列腺癌細胞凋亡中具有誘導作用(例如可參見《海南醫學》，2009年12期)；特拉唑嗪和其他藥物如多沙唑嗪或托特羅定等聯合用藥具有治療原發性高血壓和前列腺疾病的作用(可參見《中國新藥雜志》，2001年9期；《廣東醫學》2008年10期)；特拉唑嗪在其他疾病相關的細胞凋亡中作用機理研究多數集中于研究特拉唑嗪對細胞凋亡的誘導作用(例如鹽酸特拉唑嗪誘導PC-3細胞凋亡，《臨床泌尿外科雜志》，2004年11期)，而顯著抑制敗血病和腦卒中等病癥細胞凋亡的作用機制未見報道。
發明內容
本發明人現在已出人意料發現特拉唑嗪具有顯著抑制細胞凋亡的作用。因此，本發明涉及特拉唑嗪或其鹽或其溶劑化合物在制備用于治療細胞凋亡的藥物制劑。具體地說，本發明涉及特拉唑嗪或其鹽可以有效治療和/或預防敗血病和腦卒中及其并發癥引起的人體細胞凋亡。在本發明中，術語細胞凋亡特指細胞凋亡癥狀是由腦卒中和敗血癥引起的細胞凋亡。本發明中所用的特拉唑嗪鹽指特拉唑嗪與許多種有機和無機酸和堿形成藥學上可接受的酸和堿加成鹽，并包括制藥工業上常用的生理上可接受的鹽.這類鹽也是本發明的一部分.這類藥物可接受的鹽包括鹽酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、甲磺酸鹽、苯基乙酸鹽、三氯乙酸鹽、丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲 氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、氯化物、肉桂酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、羥基乙酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、乳酸盆、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲用酸鹽、煙酸盆、異煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、三鄰苯二甲酸鹽(tera的thalate)，磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫盆、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯基丙酸鹽、水楊酸鹽、癸二酸鹽、統由酸鹽、辛二酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、焦硫酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、硫酸鹽、苯破酸鹽、氯苯硝酸鹽、酒石酸鹽等，優選的鹽為特拉唑嗪鹽酸鹽。本發明的化合物-特拉唑嗪用普通的賦形劑、稀釋劑或載體配制，并壓制成片，或配制成便于口服或肌肉或靜脈內給藥的藥劑或溶液劑。還可經皮施用，并可以配成緩釋劑型等，如口服給藥劑型、注射給藥劑型、粘膜給藥劑型或經皮給藥劑型，更具體講，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、注射液、貼劑或凝膠劑形式.可以通過本領城已知的方法制備藥物制劑。例如，本發明化合物可用普通賦形劑、稀釋劑或載體配制，并制成片劑、膠囊劑、懸液劑、粉劑等。適于這些配方的賦形劑、稀釋劑和載體包括下列物質填充劑和增量劑如乳糖、微晶纖維素、淀粉、蔗糖、甘露醇以及硅衍生物；粘合劑如羧甲基纖維素和其它纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如羧甲基淀粉鈉、聚乙烯聚吡咯烷酮、低取代羥丙基纖維素等；溶解抑制劑如石蠟；助溶促進劑如季胺化合物；表面活性劑如十六烷醇、單硬脂酸甘油醋、吸附載體如高嶺土和膨潤土 ；以及潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和微粉硅膠。本發明的化合物也可配制成便于口服的醒劑或溶液劑或者配成適于胸外施用的溶液劑，例如適于肌肉、皮下或靜脈內途徑施用的溶液劑。此外，本發明的化合物非常適于作為緩釋劑型.這些制劑可以適當組成，以使它們能在一段時間內只釋放活性成分或者優選在腸道特定部分釋放活性成分，緩釋制劑包括各種可生物降解但不易溶于水的高分子材料，包括但不限于聚丙交酷一乙交酷，聚乳酸、聚乙醇酸、聚3-經基丁酸醋，聚內酷，聚酸配、聚輕基丁酸酷一經基戊酸酷聚丙烯萄聚糖、聚乳酸一聚乙二醇、聚經乙酸一聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物等。其分子量2，000-1, 000, 000道爾頓之間。根據本發明，治療臨床細胞凋亡疾病所需特拉唑嗪的具體劑量，將根據病情、的嚴重程度，施藥途徑和相關因素決定，這由主治醫生確定。一般可接受的和有效的每日劑量從約O. 5至500mg/d，且更常見的是從約I至200mg/d。將上述劑量給需要治療的患者每天施用一次至三次或者按照需要采用緩控釋制劑以有效地治療臨床細胞凋亡疾病，
圖I是特拉唑嗪鹽類衍生物合成實施例I中特拉唑嗪磷酸鹽的核磁共振譜圖。圖2是特拉唑嗪鹽類衍生物合成實施例2中特拉唑嗪硫酸鹽的核磁共振譜圖。圖3是特拉唑嗪鹽類衍生物合成實施例3中特拉唑嗪甲磺酸鹽的核磁共振譜圖。圖4是藥效實施例I中特拉唑嗪衍生物(Tx)對敗血癥小鼠存活率的影響。圖5是藥效實施例3中特拉唑嗪衍生物(Tx)對凋亡細胞細胞活性的影響
具體實施例方式特拉唑嗪鹽類衍生物合成實施例I :特拉唑嗪磷酸鹽制備取特拉唑嗪(30克，O. 0775mol)，甲醇2000ml，磷酸2ml，投入反應瓶，加熱至75°C，保持lh，減壓蒸去溶液，可得固體。用甲醇重結晶，得白色結晶。特拉唑嗪磷酸鹽見附圖1，熔點為250_254°C。
IH NMR (400MHz, DMS0_d6) δ (ppm) 2· 014 (m，2Η) ；1. 850(m,2H) ；3. 57(m,2H)；3. 526(m，2H) ；3. 538 (m,2H) ；3. 726 (m,2H) ；3. 746 (m, 3H) ；3. 783 (m,3H) ；4. 716 (q, 1H)；6. 816 (s, 1H) ；7. 46 (s, 1H) ；7. 376 (s, 1H).特拉唑嗪鹽類衍生物合成實施例2 :特拉唑嗪硫酸鹽制備取特拉唑嗪(30克，O. 0775mol)，甲醇2000ml，硫酸3ml，投入反應瓶，加熱至75°C，保持30min，減壓蒸去溶液，可得固體。用甲醇重結晶，得白色固體。特拉唑嗪硫酸鹽核磁見附圖2，熔點為219-227°C。IH NMR (400MHz, DMS0_d6) δ (ppm) I. 845 (m, 2H) ；1. 874 (m, 2H) ；3. 756 (m, 2H)；
3.773(m，2H) ；3. 784(m,2H) ；3. 789 (m, 2H) ；3. 812(m,2H) ；3. 821 (m,3H) ；3. 913(m,3H)；
4.762 (q, 1H) ；7. 165 (s, 1H) ；7. 686 (s, 1H) ；11. 638(s, 1H).特拉唑嗪鹽類衍生物合成實施例3 :特拉唑嗪甲磺酸鹽制備取特拉唑嗪(30克，0.0775mol)，甲醇2000ml，甲磺酸6ml，投入反應瓶，加熱至75°C，保持30min，減壓蒸去溶液，可得固體。用甲醇重結晶，得白色固體。特拉唑嗪甲磺酸鹽核磁見附圖3，熔點> 270°C。IHNMR(400MHz, DMS0_d6) δ (ppm) I. 808 (m, 2Η) ；1. 840 (m, 2Η) ；3. 727 (m, 2Η)；
3.756(m，2H) ;3.767 (m，2H) ；3. 773(m，2H) ；3. 784(m，2H) ；3. 853(m,3H) ；3. 914(m,3H)；
4.763(q,1H) ；7. 213 (s, 1H) ；7. 689 (s,1H) ；8. 730 (s,1H) ；8. 834 (s, 1H) ；11. 697 (s, 1H).制劑實施例I :治療敗血癥引起的細胞凋亡特拉唑嗪注射劑的制備。取特拉唑嗪鹽酸鹽IOOOmg,溶于IOOml無菌生理鹽水中，混合均勻后，分裝成10mg/ml/支濃度的注射液于藥瓶中，密封，滅菌制成產品。其他項目應符合中華人民共和國藥典2010年版注射液項下要求。制劑實施例2 :治療敗血癥引起的細胞凋亡特拉唑嗪口服片的制備。取特拉唑嗪IOOg,微晶纖維素510g,無水乳糖380g,硬脂酸鎂IOg,按公知的制片技術和設備制成片劑，特拉唑嗪IOmg/片.其他項目應符合中華人民共和國藥典2010年版片劑項下要求。
制劑實施例3 :治療腦卒中引起的細胞凋亡特拉唑嗪緩釋片的制備。取特拉唑嗪磷酸鹽200g，羥丙甲基纖維素K4M 250g，無水乳糖540g，硬脂酸鎂10g，按公知的制片技術和設備制成片劑，特拉唑嗪磷酸鹽20mg/片.其他項目應符合中華人民共和國藥典2010年版片劑項下要求。制劑實施例4 :治療腦卒中引起的細胞凋亡特拉唑嗪口服液制備。取特拉唑嗪甲磺酸鹽適量，中華人民共和國藥典2010年口服液項下要求，按公知的制片技術和設備制口服液藥效實施例I :實施例I特拉唑嗪衍生物(Tx)對敗血癥小鼠的作用 動物及分組SPF級雌性Balb/c小鼠，隨機分為3組，即空白組⑷，模型組⑶、特拉唑嗪衍生物組(C)，每組10只。模型建立及給藥各組小鼠腹腔注射3. 5%水合氯醛O. lmL/10g麻醉后，無菌條件下，模型組、Tx組行盲腸結扎穿孔術，空白組只找到盲腸但不結扎穿孔，術后lh，Tx組腹腔注射O. lmg/kg Tx，空白組和模型組分別腹腔注射等容生理鹽水。術后開始觀察記錄小鼠行為表現、體重及存活期，計算存活率，并對重要臟器做病理切片。數據統計數據用MeaniSD表示，兩組間比較采用t檢驗，P < O. 05表明差異有統計學意義。實驗結果I.手術對敗血癥小鼠行為學的影響術后小鼠出現精神萎靡、嗜睡、反應遲鈍、活動差、怕冷、聚居、豎毛、厭食、眼角分泌物增多等癥狀，表明敗血癥模型建造成功。2.對胸腺和腸系膜淋巴細胞的影響流式細胞術檢測表明模型組小鼠的胸腺及腸系膜的CD4+淋巴細胞出現了大量凋亡，Tx組的凋亡細胞數則明顯少于模型組，但要高于空白組。3.對臟器的影響病理切片顯示，術后20h，模型組小鼠的胸腺、脾、肝、肺組織即發生了明顯的病理損傷。而術后Ih給藥的Tx組臟器損傷程度則明顯低于空白組。4.對體重的影響模型組的動物體重要明顯降低空白組和Tx組。5.對敗血癥小鼠存活率的影響在I周的觀察時間內，只有20%左右動物生存。模型組小鼠24小時存活率為80. 25%，而72h存活率為48. 60%, Tx顯著提高了敗血癥小鼠72h存活率，達到69. 5%。結果見圖4對敗血癥小鼠存活率的影響。實施例2特拉唑嗪衍生物(Tx)對缺血性腦卒中大鼠的作用動物及分組SPF級SD大鼠，雌雄各半，隨機分為3組，即空白組(A)、模型組(B)、特拉唑嗪衍生物(C)組，每組10只，雌雄各5只，分籠飼養。模型建立及給藥各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛O. 3mL/100g麻醉后，無菌條件下，模型組和Tx組行腦中動脈結扎(middle cerebral artery occlusion, MCAO)術，空白組只分出腦中動脈但不結扎，術后lh，Tx組腹腔注射0. lmg/kg特拉唑嗪衍生物，空白組和模型組分別腹腔注射等容生理鹽水。術后觀察并記錄大鼠行為表現及存活期，7天后，集中處死取腦做腦片，用Image Tool軟件統計腦缺血面積。數據統計數據用MeaniSD表示，兩組間比較采用t檢驗，P < 0. 05表明差異有統計學意義。
實驗結果I.對缺血性腦卒中大鼠行為學的影響造模后，各組大鼠體重無明顯差異。在觀察期間，模型組與空白組的行為表現評分差異有統計學意義((P < O. 05)，表明缺血性腦卒中模型建造成功。Tx組在給藥后的第3天與給藥前的行為表現的差異有統計學意義((P< O. 05)。2.對缺血性腦卒中大鼠腦缺血面積的影響在觀察期間，空白組未見明顯的腦缺血癥狀，模型組與空白組腦缺血面積比的差異有統計學意義((P <0.01);腦缺血面積比Tx組明顯小于模型組((P < O. 05)。3. Tx對大鼠腦卒中模型有明顯的保護作用，顯著改善大鼠的行為表現，明顯減小腦梗塞面積。表I.各組腦梗死體積比較(η = 10)·
權利要求
1.特拉唑嗪或其鹽或其溶劑化物作為細胞凋亡抑制劑的用途。
2.特拉唑嗪或其鹽在制備用于抑制細胞凋亡的藥物中的應用。
3.權利要求2的用途，其中所述細胞凋亡為惡性疾病引起。
4.權利要求2或3的用途，其中所述細胞凋亡為敗血癥及其并發癥引起的細胞凋亡。
5.權利要求2或3用途，其中所述細胞凋亡為腦卒中及其并發癥引起的細胞凋亡。
6.權利要求2的用途，所述藥物適用于包括人在內的哺 乳類動物。
7.權利要求2的用途，所述特拉唑嗪鹽為磷酸鹽形式，硫酸鹽形式，或甲磺酸鹽形式。
8.如權利要求7所述的特拉唑嗪鹽酸鹽在制備用于治療和/或預防敗血病及其并發癥弓I起的細胞凋亡藥物中的應用。
9.如權利要求7所述的特拉唑嗪鹽酸鹽在制備用于治療和/或預防腦卒中及其并發癥弓I起的細胞凋亡藥物中的應用。
10.特拉唑嗪或其鹽或其溶劑化物與其他抑制細胞凋亡的化合物的組合物，在用于治療人敗血癥/腦卒中或其它疾病引起的細胞凋亡癥狀的藥物中的用途。
11.權利要求I或2的用途，其中特拉唑嗪鹽指特拉唑嗪與許多種有機和無機酸和堿形成藥學上可接受的酸和堿加成鹽，并包括制藥工業上常用的生理上可接受的鹽。
12.權利要求I或2的用途，其中藥物為口服給藥劑型、注射給藥劑型、粘膜給藥劑型或經皮給藥劑型。
13.權利要求I或2的用途，其中所述藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、注射劑、貼劑或凝膠劑形式。
全文摘要
本發明涉及特拉唑嗪或其鹽或其溶劑化合物在制備用于治療人敗血癥/腦卒中引起細胞凋亡癥狀的藥物制劑。本發明人現在已出人意料發現特拉唑嗪及其相關鹽類衍生物具有顯著抑制細胞凋亡的作用。在敗血癥小鼠模型、缺血性腦卒中大鼠模型及體外對巨噬細胞的藥效試驗中表明其具有明顯抑制細胞凋亡的藥理活性。
文檔編號A61K31/517GK102908352SQ20121033478
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者袁利佳, 邢媛媛, 佟潔瓊, 黃少林, 趙鴻蓮, 許曉椿 申請人:北京英科博雅科技有限公司