專利名稱：Peg化的重組人生長激素化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物組合物，該藥物組合物包含適合的藥物賦形劑并且還包含臨床有效量的重組人生長激素(rhGH)PEG化的前藥，其比可獲得的人生長激素產品可以更少頻率地施用，并且可能不引起注射副作用脂肪萎縮。本發明還涉及此類前藥。
背景技術：
生長激素(GH)是在人和其它動物中刺激生長和細胞繁殖的激素。其是191個氨基酸、單鏈多肽激素，其是前葉垂體側翼中促生長素細胞合成、貯存并且分泌的。當涉及重組DNA技術生產的生長激素時，該激素也稱為促生長素并且縮寫為“rhGh”。生長激素在體內具有多種功能，最顯著的功能是增加兒童期的身高，并且數種疾病可以通過GH的治療應用來治療。生長激素缺乏的作用取決于他們發生的年齡而不同。在兒童期，生長不足和身材矮小癥是GH缺乏的主要現象。其還可能引起性不成熟。在成年期，缺乏的作用更加明顯，并且可能包括力量、精力和骨量的不足，以及心血管風險的增加。GH缺乏存在很多原因，包括特定基因的突變、涉及下丘腦和/或垂體的先天畸形，以及損傷、手術或疾病引起的垂體損害。缺乏是通過補充外源GH來治療的。在目前應用中的所有GH是生物合成的人GH，通過重組DNA技術制備。在兒童期發作(在完成生長期后)或成人發作(通常是后天垂體腫瘤的結果)的GH缺乏的兒童和成年人中，GH用作替代治療。在這些患者中，優勢包括減少脂肪量、增加瘦肉量、增加骨密度、改善脂質分布、減少心血管風險因素和改善心理社會健康。Genentech Inc (US)第一個克隆了 rhGH，并且其描述于專利 EP-B22242中。2006年，在美國和歐洲(以及它們的生產商)可獲得的合成的生長激素包括Nutropin (Genentech)、Humatrope (Eli Lilly)、Genotropin (Pfizer)、Norditropin (NovoNordisk)、Saizen(Merck Serono)和 Omnitrope(Sandoz)。盡管分子生物學技術已經顯著地增加了很多蛋白質和/或多肽(下文稱為蛋白質)的利用度，但是所述蛋白質的治療用途時常受到其它因素的阻礙，例如由于腎和受體介導的清除引起的短的血漿半衰期、聚集、蛋白質降解、較差的生物利用度和物理性質(預先排除有效的制劑)。增加蛋白質利用度的原理是通過將蛋白質與衍生化的化合物的綴合，所述的衍生的化合物包括但不限于聚乙二醇和聚丙二醇。公認的某些優點包括降低免疫原性和抗原性，增加作用持續時間和改變藥物動力學性質。[Veronese, F. M. “Enzymes for HumanTherapy Surface Structure Modif ications (用于人類治療的酶表面結構修飾)”，Chimica Oggi，7 :53-56 (1989)](本文參考文獻 5)。 對于醫學用途，通過PEG化的rhGH可能通過增加其體內半衰期(從而實現劑量減少或給藥頻率降低)、改善其穩定性和降低其抗原性或它們的組合來改善分子特性。通常，對分子進行該類型的修飾是本領域眾所周知的并且專利文獻中可獲得很多專利，這些專利描述了這種概念。例如EP-B 1196443中描述了 Hofmann La Roche的PEG化的促紅細胞生成素(EPO)，其要求包含與EPO共價鍵合的PEG的特別的連接體，在Nektar/La Roche公司的EP-B975369中描述了 PEG化的干擾素a ,并且在Hofmann La Roche公司的EP-B 1562634中描述了另一種PEG化的干擾素a。rhGH的體內清除被認為是通過下面兩種機理發生的。第一種是腎清除，其中rhGH是從循環中通過腎小球過濾清除的。rhGH的腎清除已被很好地證明，并且因此合成的rhGH 的PEG化是解決該問題的一個明顯的選擇。腎清除占rhGH總清除的約25-53% (Girard,J. Mehls, 0. J. Clin.1nvest. 1994 年 3 月；93(3) :1163_1171，本文參考文獻 3)。第二種機理是肝清除(肝臟)。GH的肝攝取是通過溶酶體降解后的受體介導的胞吞作用而發生的。第三種機理是在其它組織(例如軟骨的軟骨細胞)中的受體介導的清除。通過PEG化降低GH對GH受體的結合親和力，從而減少受體介導的清除。但是，對于施用rhGH存在特有的問題。皮下施用rhGH的一個主要缺點是在接受治療的患者中發生脂肪萎縮。脂肪萎縮是用于脂肪組織局部丟失的醫學術語。皮下施用rhGH制劑已經出現脂肪萎縮問題，其被認為是由注射部位局部高濃度的生長激素復合物引起的。Biiyiikgebiz A.等人在 J. Pediatr. Endoerinol. Metab, 1999 年 1-2 月；12 (I)95-7中描述了此類醫學記錄(本文參考文獻I)。這是一個由于6. 7kb基因缺失引起單獨GH缺乏的患者的記錄，該患者接受高劑量rhGH治療并且在治療6年后在注射部位發生了局部脂肪萎縮，而沒有任何抗體檢測。人們懷疑脂肪萎縮的病因學是高劑量rhGH的直接脂解作用。與施用rhGh相關的脂肪萎縮被認為是由于rhGH活性本身、更高濃度和延長的暴露引起的。這些更高濃度發生在注射部位附近。在rhGH被PEG化的情況中，由于增加停留時間，高生長激素活性在注射部位附近聚集的機會甚至更高。在PEG化的rhGH制劑的情況中，組織將經歷持續并且增加暴露于生長激素活性，這是由于這樣一個事實PEG化的綴合物具有藥理學活性所需的活性，并且綴合物由于綴合物的大小而擴散有限。結果是增加了注射部位的脂解作用。WO-A 2005/079838描述了 PEG化的hGH，其中hGH部分通過氨基官能團連接至聚乙二醇聚合物上，由于氨基的穩定性，其可以認為是永久的結合。此類PEG化的hGH化合物的實例(其出現脂肪萎縮)是化合物PHA-794428。化合物PHA-794428是PEG化的rhGH，并且還在Pharmacia公司(被Pfizer獲得)的WO-A 2005/079838中描述，并且進一步在 Horm. Res. 2006 ;65(增刊 4) :1-213，CF1-98GH/IGF Treatment with title “Firstin-human study of PEGylated recombinant human growth hormone，，(題為“PEG 化的重組人生長激素的首次在人類中的研究”的CF1-98GH/IGF治療)，Philip Harris等人(本文參考文獻4)中描述。根據www. clinicaltrials. gov上公開的臨床試驗信息,該試驗于2007年12月10日結束。Pfizer決定終止該計劃是由于在2期臨床研究中在單獨注射PHA 794428后報道注射部位脂肪萎縮的病例。WO-A 2006/102659 (Nektar)也描述并且提出了通過酰胺鍵形成的rhGH_PEG綴合物(線性和分支類型)。在WO-A 2006/102659中所解決的問題描述于第2頁第
段。根據該申請人，所解決的問題是減少給藥頻率。因為rhGH治療典型地需要每天注射，患者特別是兒科患者不喜歡這種不便和與該治療有關的不適。Nektar的WO-A中描述的方案是提供新的PEG-rhGH綴合物。在W0-A
的表6中，可以看出與沒有PEG的天然生長激素相比，PEG-rhGH綴合物具有相對低的體外活性。盡管低的體外活性，PEG化的rhGH綴合物在體內被活化。與閱讀部分
相關“盡管初步的體外結果表明增加與hGH連接的PEG的量降低其刺激hGH受體的能力，基于初步的體內結果，其表明生物活性的降低超出增加半衰期和/或血漿利用度的平衡，因此得到一個結論當在相同的給藥方案中與未修飾的rhGH相比，本文提供的綴合物具有優良的藥效學作用”。WO-A 2006/102659 (Nektar)沒有描述可自動裂解的連接體-即簡單觀察到PEG-rhGH綴合物在體內被活化，盡管它們的體外活性顯著降低。脂肪萎縮的問題沒有解決。為了實現將所需的性質(降低脂肪萎縮和減少注射頻率)設計到hGH的PEG化的綴合物中，一種解決方法是應用前藥方法。前藥是在表現其藥理學作用前經受生物轉化的任何化合物。因此，前藥可以被視為是包含特別的無毒保護基的藥物，這些保護基是以暫時(transient)的方式用于改變或消除母體分子中不希望的性質。在這種情況下,聚合物載體將暫時降低生長激素的活性，從而減少組織脂解作用的可能性。同時暫時綴合至聚合物載體上將延長綴合物的半衰期，從而提供長效遞送的hGH。文獻中描述了很多大分子前藥，其中大分子載體是通過不穩定的酯基連接至藥物上的(例如 Y. Luo, MR Ziebell, GD Prestwich, uK Hyaluronic Acid-Taxol AntitumorBioconjugate Targeted to Cancer Cells (祀向癌細胞的透明質酸-紫杉醇抗腫瘤生物綴合物)”，Biomacromolecules 2000,1, 208-218 ;J Cheng 等人，Synthesis of Linear,beta-Cyclodextrin Based Polymers and Their Camptothecin Conjugates (基于線性@ -環糊精的聚合物和它們的喜樹堿綴合物的合成)，Bioconjugate Chem. 2003,14,1007-1017；R. Bhatt 等人，Synthesis and in Vivo Antitumor Activity ofPoly (L-glutamic acid) Conjugates of 20 (S)-Campththecin (20 (S)-喜樹喊的聚(L_ 谷氨酸)綴合物的合成與體內抗腫瘤活性)Med. Chem. 2003,46,190-193 ；R. B. Greenwald,A. Pendri, C. D. Conover, H. Zhao, Y. H. Choe, A. Martinez, K. Shum, S. Guan, J. Med.Chem. ,1999,42,3657-3667 ；B. Testa, J. M Mayer, Hydrolysis in Drug and ProdrugMetabo Ii sm (藥物和前藥代謝中的水解)，Wiley-VCH，2003，第8章)。在這些情況中，生物活性實體的綴合的官能團是羥基或羧酸。特別是對于生物大分子但也對于小分子聚合物前藥，希望將大分子載體連接至生 物活性實體的氨基(即N-末端或蛋白質的賴氨酸氨基)上。這將是一種情況，如果掩蔽藥物生物活性需要綴合生物活性實體的某個氨基，例如位于受體結合中涉及的活性中心或區域或表位的氨基。同時，在制備前藥的過程中，氨基可能是更具有化學選擇性并且用作綴合載體和藥物的更好的柄，因為它們比羥基或酚基具有更大的親核性。對于可能包含大量不同反應官能度的蛋白質而言，這特別正確。在這種情況中，無選擇性的綴合反應引起不希望的產物混合物，其需要廣泛的表征或純化并且可能降低反應產率和產品的治療功效。前藥活化可以通過酶或非酶裂解載體和藥物分子間的不穩定橋來實現，或兩者的連續組合，即酶解步驟之后進行非酶重排。在WO-A 2005/099768中描述了含有自動裂解的連接體的PEG化的連接體分子，用于大量的生物分子，包括促生長素(權利要求6)。在W0-A2005/099768中，所解決的問題是患者間的變異性，以及當涉及酶解機理時，前藥活化的不可預知的作用(第12頁，第17-30行)。該申請描述了作為一種解決方法的芳族連接體，其可以基于PEG。該連接體-PEG以顯著降低藥物活性的方式與藥物結合。只有在釋放藥物時它才被活化，其是通過水解開始的。水解速率可以以化學方法來控制。對于GH和相關問題、例如脂肪萎縮沒有具體強調。綜上所述，以上提及的引文均沒有描述基于前藥綴合物來開發長效rhGH的方法， 所述的綴合物可以更少頻率地施用而不增加脂肪萎縮的頻率。因此，本發明的目的是提供前藥或包含所述前藥的藥物組合物，應用與rhGH綴合的PEG減少施用頻率而不顯著誘導脂肪萎縮。
發明內容
發明概述因此，本發明提供了藥物組合物，該藥物組合物包含適合的藥物賦形劑并且還包含人體內臨床有效量的重組人生長激素rhGH PEG化的前藥綴合物，其中PEG通過自身可水解的(自動裂解的)暫時連接體與rhGH連接；所述的前藥綴合物的特征在于(I):綴合物的GH活性小于不含PEG的天然生長激素的5% ;和(2):連接體自動水解速率是體內半衰期為10小時至600小時的速率。性質(I)確保前藥具有低的脂肪萎縮發病率，盡管具有顯著延長的體內作用時間。不受理論限制，本發明人認為如果前藥具有更高的GH活性，該產品將仍會以比目前市售的rhGH產品更高的頻率誘導脂肪萎縮。性質⑵確保rhGH (不含PEG)隨時間逐漸釋放，從而可以施用比人生長激素更少頻率的rhGH藥物產品,例如僅每周一次或每月一次代替每天施用，而與rhGH相比仍能保持全部功效。優選的是，體內半衰期比相應的hGH PEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多5倍，例如2、3、4或5倍。更優選的是，體內半衰期比相應的hGH PEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多3倍。最優選的是，體內半衰期比相應的hGH PEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多2倍或幾乎相同。本發明應用于rhGH PEG化的前藥，特別是rhGH PEG化的載體前藥，包括級聯載體前藥。前藥可以定義為本身沒有活性但是可預計轉化為活性代謝物的治療藥物(參見B. Testa, J. M Mayer Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism(藥物和前藥代謝中的水解)，Wiley-VCH，2003，第4頁)。在載體前藥系統中，當聚合物共價綴合至藥物分子時，很多藥物是沒有活性的或表現出降低的生物活性。在這些情況中，應用藥物和載體間暫時的連接 ，在這種方式中，藥物在體內從聚合物載體上釋放以恢復其生物活性。如果需要緩慢或可控釋放藥物，與釋放的藥物相比，降低生物活性的前藥具有優勢。在該情況中，可以施用相對大量的前藥而沒有伴隨的副作用和過量給藥的風險。藥物釋放是隨時間發生的，從而減少重復且頻繁施用藥物的需要。在聚合物載體的前藥中，生物活性部分通常是通過載體部分和藥物分子的官能團之間形成的不穩定的橋連接到聚合物載體部分的。載體前藥的裂解產生增加生物活性的分子實體(藥物)和至少一種副產物，載體。該副產物可以是生物惰性的(例如PEG)。裂解后，生物活性實體將露出至少一個之前綴合而掩蔽或保護的官能團，并且該基團的存在典型地有助于生物活性。GH活性可以應用本領域已知的方法來測量。在這個方面，強調實施例1。基于這樣一個事實可用于本發明的某些暫時連接體可以具有小于3000小時的體外半衰期，各自GH活性測量是通過測量包含替代暫時連接體的永久連接體的各自PEG綴合物的GH活性來間接進行的。其可以如WO 2006102659第74頁第0240段描述的那樣進行，本文描述的rhGH和綴合物的生物活性將應用NB2-1I大鼠淋巴瘤細胞增殖分析進行體外評價。簡而言之，將衍生自大鼠淋巴瘤的NB2-1I細胞與rhGH溫育，其引起rhGH分子與細胞表面的受體結合。受體結合誘導信號轉導級聯，從而引起細胞增殖。分析結果是基于測定的蛋白質濃度和未修飾的rhGH的100%生物活性。優選的是，對于測量GH活性，應用實施例24中描述的方案。體外半衰期可以應用本領域已知的方法來測量。在這個方面，強調實施例2。因此，本發明的第二方面涉及臨床有效量的包含第一方面的rhGHPEG化的前藥的藥物組合物，其用于治療人GH相關疾病的方法中。第二方面可以選擇性地描述為治療人GH相關疾病的方法，該方法包括給人施用臨床有效量的包含第一方面的rhGH PEG化的前藥的藥物組合物。在一種情況中，其中與天然的人GH相比，前藥的剩余活性(對于暫時PEG綴合的rhGH的情況)被顯著降低，脂解作用可能不會發生，甚至在延長暴露時。本文描述稱為rhGH PEG化的前藥的化合物是綴合物，其與人GH相比具有顯著降低的剩余活性。為了顯示治療有用的活性，rhGH必須從前藥綴合物中釋放，對于這一點，本文描述的前藥需要經歷活化步驟(例如I，6-釋放機理)，本文稱為自動裂解，將PEG基團從藥物中裂解。1，6_釋放機理在WO-A 2005/099768中有很好的描述。不受理論的限制，本發明人認為本文公開的暫時PEG化的rhGH綴合物顯著減少了脂肪萎縮，因為在PEG通過可自動裂解的連接體逐漸裂解之前，PEG化的rhGH綴合物具有低活性。這可以確保前藥不會比人GH或上述的其它永久PEG化的rhGH化合物更頻繁地誘導脂肪萎縮。本發明潛在的問題也是通過包含適合的藥物賦形劑并且還包含式(AA)的人生長激素(hGH)的前藥綴合物的藥物組合物來解決的hGH-NH-La-S° (AA)其中hGH-NH 表示 hGH 殘基；
La表示官能團，其是通過自動裂解誘導基團^而自身可水解的(可自動裂解)；并且S0是聚合物鏈，其分子量為至少5kDa并且包含至少第一個分支結構BS1，至少第一個分支結構BS1包含至少第二條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S1，其中S°、BS1, S1中至少一個進一步包含自動裂解誘導基團G%并且其中分支結構BS1進一步包含至少第三條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S2，或者S'S1中至少一個包含至少第二個分支結構BS2，所述的BS2包含至少第三條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S2，并且其中不含hGH-NH的前藥綴合物的分子量為至少25kDa并且最大lOOOkDa、優選至少25kDa并且最大500kDa、甚至更優選至少30kDa并且最大250kDa、甚至更優選至少30kDa并且最大120kDa、甚至更優選至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更優選至少40kDa并且最大90kDa。
令人驚訝地發現，通過提供具有某最小長度(如它們分子量所定義的)的至少3條鏈的聚合物載體，本發明的前藥的剩余活性可以被有效地降低，從而與本文描述的暫時連接體組合解決了提供hGH前藥的問題，其可以更少頻率地施用并且沒有增加脂肪萎縮的風險。因此，前藥應當是水溶性的。對于至少雙-綴合的前藥，問題可以通過包含適合的藥物賦形劑并且還包含式(AB)的人生長激素(hGH)的前藥綴合物的藥物組合物來解決h GH- (NH-L-S0)n (AB)其中n 是 2、3 或 4;優選 2;hGH (-NH) n 表示 hGH 殘基；L各自獨立地是永久官能團Lp或官能團L%其是通過自動裂解誘導基團Ga而自身可水解的(可自動裂解)；并且Stl各自獨立地是分子量為至少5kDa的聚合物鏈，其中Stl任選是分支的，包含至少第一個分支結構BS1，至少第一個分支結構BS1包含至少第二條分子量為至少4kDa的聚合物鏈S1，其中S'BS^S1中至少一個進一步包含自動裂解誘導基團Ga，并且其中不含hGH-NH的前藥綴合物的分子量為至少25kDa并且最大lOOOkDa、優選至少25kDa并且最大500kDa、甚至更優選至少30kDa并且最大250kDa、甚至更優選至少30kDa并且最大120kDa、甚至更優選至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更優選至少40kDa并且最大90kDa。本發明的另一方面是以上定義的前藥綴合物。本發明優選的實施方案在下面僅通過實施例描述。定義在討論本發明詳述的實施方案之前，提供關于本發明主要方面的特別術語的定義。通常，本文所用的所有特別的技術術語應當被理解為技術人員將在本技術背景中
理解它們。rhGH或hGH或GH或hGH殘基指的是人生長激素。NH-hGH是hGH殘基，其中_NH_hGH的-NH-表示hGH的氨基。本文的術語“活性”應當被理解為生長激素或其綴合物當施用于哺乳動物、例如在體內模型中誘發生物學響應或在實施例描述的體外模型中產生可測量的響應的能力。
在前藥系統中，測量的活性將具有兩個貢獻，一個來自釋放的游離藥物實體，并且另一個來自仍未裂解的前藥綴合物。為了區分前藥綴合物的活性，本文的術語“剩余活性”應當被理解為可歸于前藥綴合物的測量的前藥活性的部分。本文的術語“自動裂解”應當被理解為暫時連接體和藥物分子rhGH之間的鍵在水性緩沖溶液中在PH 7. 4和37°C的生理條件下限速的水解裂解。自動裂解不需要存在酶。該自動裂解或自身水解是提供自動裂解誘導基團控制的，所述的基團是前藥分子的部分。該自動裂解誘導基團可以以本身存在或者以掩蔽形式存在，以便在自身水解機制啟動前需要暴露。連接體自動水解速率指的是hGH-PEG化的前藥在體內的裂解速率。由于酶或其它作用幾乎經常引起前藥連接體體內水解比體外進行更快，如果前藥的體內半衰期比相應的hGH PEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多5倍，那么將其定義為hGH PEG前藥以自動水解方式裂解。 本文的術語“暫時連接”或“暫時連接體”應當被理解為描述rhGH PEG化的前藥中PEG和rhGH之間連接的不穩定性。在這種暫時連接中，rhGH從相應的前藥中釋放，其體內連接體半衰期為至多1200小時。本文的術語“綴合物”應當被理解為共價鍵合至本文的藥物(人生長激素)的一種或多種PEG分子。術語“暫時綴合物”指的是包含至少一個暫時連接的hGH PEG化的前藥。術語“永久綴合物”指的是hGH PEG化的綴合物或前藥，其中PEG聚合物是通過具有體外半衰期為至少3000小時的連接結合到hGH上。體外半衰期或體外連接體半衰期是在pH 7. 4和37°C的緩沖液中從hGH PEG化的前藥中釋放50%的hGH。術語“體內半衰期”或“體內連接體半衰期”應當被理解為在施用于人體后其中50%的最初比例的生長激素從hGH PEG化的前藥中釋放的時間間隔，其是通過考慮如實施例2中描述的化合物相應的綴合物半衰期來計算的。術語“綴合物半衰期”應當被理解為其中50%的以上定義的hGH PEG化的永久綴合物從血液循環中清除的時間間隔。本文的術語“脂肪萎縮”應當被理解為用于脂肪組織局部丟失的醫學術語。在本文中，“脂肪萎縮”指的是注射部位脂肪萎縮，這意味著組織脂解發生在靠近注射部位。本文的術語“前藥”應當被理解為在顯示其全部藥理學作用前經歷轉化的任何化合物。IUPAC定義下給出了前體系統的分類(http:1l www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem, 2004 年 3 月 8 日接入):前藥前藥是在顯示其藥理學作用前經歷生物轉化的任何化合物。因此，前藥可以被認為是包含特別的無毒保護基的藥物，所述保護基以暫時的方式用于改變或消除母體分子中不希望的性質。雙重前藥(或前-前藥)雙重前藥是在體內分兩步(酶和/或化學方式)轉化為活性物質的生物無活性分子。
載體連接的前藥(載體前藥)載體連接的前藥是包含給定的活性物質與暫時載體基團的暫時連接的前藥，所述的暫時載體基團產生改善的物理化學或藥物動力學性質，并且其易于體內消除，通常是通過水解裂解。級聯前藥級聯前藥是其中載體基團的裂解僅在暴露活化基團后變成有效的前藥。生物轉化生物轉化是物質通過活有機體或酶制劑的化學轉化。相應地，級聯自動水解誘導基團僅在暴露某些自動水解誘導結構元件后變成有作·用。為了暴露自動水解誘導結構元件，需要一個或多個級聯暴露步驟。至少一個暴露步驟可以基于生物轉化步驟。術語“包含人體內臨床有效量的重組人生長激素(rhGH)PEG化的前藥的藥物組合物”應當被理解為在將藥物組合物施用于人后足夠高以在人體內獲得所需臨床作用的量，例如與治療GH相關疾病有關的所需的臨床作用。在本文中，技術人員通常能夠調整所施用的重組人生長激素(rhGH)PEG化的前藥的量，以獲得所需的臨床作用。本文的術語“生理條件”應當被理解為與人體的pH和溫度條件相同或相似的任何體外或體內條件。更特別的是，生理條件指的是在約pH 7. 4(pH 6. 8至pH 7.8)和約37°C (35°C至 40°C )的條件。術語“連接體”頻繁地用于生物綴合領域的出版物中并且廣義地描述用于連接兩個分子實體的化學結構。這種連接可以是永久的或暫時的。暫時連接體是其中藥物與PEG分子的綴合是可逆的連接體。這意味著連接體的裂解釋放天然和活化形式的藥物。對于載體前藥，特別是如果聚合物是永久與連接體結合并且因此連接體相關的降解產物不是作為前藥裂解的結果而釋放的，在結構上區分暫時連接體單元和聚合物載體可能是困難的。如果連接體既是自動裂解誘導基團又是分支單元，連接體的結構特征甚至更加具有挑戰性。因此，在本發明的含義中，術語連接體可以與官能團La和自動裂解誘導基團Ga的組合同義應用。在其中載體是分支的PEG的所述的載體前藥的情況中，優選應用基于La和Ga組合的結構描述。在這種情況下，裂解誘導基團Ga被認為是載體聚合物的部分。Ga的化學性質的變化在很大程度上使相應的載體連接的前藥的自身裂解性質得以設計。術語“永久連接體”指的是PEG通過形成脂族酰胺或脂族氨基甲酸酯而與hGH-提供的伯氨基綴合。如果應用常規的PEG化試劑，產生的綴合物通常對于水解是非常穩定的，并且對于前藥系統中的治療用途而言，酰胺或氨基甲酸酯鍵的裂解速率將非常緩慢。但是，這種永久連接體綴合物用于研究前藥綴合物的治療用途，因為它們可用于評價剩余活性。如果這種穩定的連接被用于前藥方法中，在治療應用的時間內沒有酶催化，官能團的裂解是不可能的。術語“水溶性前藥”指的是在生理條件下溶于水的前藥。典型的是，水溶性前藥將透射至少75%、更優選至少95%的相同溶液在過濾后透射的光。按重量計，水溶性聚合物優選至少約35% (重量)溶于水，仍然更優選至少約50% (重量)，仍然更優選至少約70%(重量)，仍然更優選至少約85% (重量)，仍然更優選至少約95% (重量)或完全溶于水。
本文所用的術語“PEG”或“PEG化殘基”用于例證以重復單元為特征的適合的水溶性聚合物。適合的聚合物可以選自聚烷氧基聚合物、透明質酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚^唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚·有機磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚酯。PEG鏈可以包含相互連接的部分、聚合物部分和末端基團。在hGH PEG化的前藥的分支的單綴合物的情況中，臨界距離規定為連接的原子所測量的PEG鏈S°與La的連接部位與第一個分支結構BS1之間的最短距離。本文的術語“PEG載量”應當被理解為包含連接至hGH的多個重復單元的聚合物鏈的分子質量的描述。總的PEG載量應當被理解為在分子基礎上連接至hGH的所有聚合物載體的總的分子質量。發明詳述
_7] 包含適合的藥物賦形劑的藥物組合物技術人員已知藥物組合物包含可藥用賦形劑和/或載體。“可藥用的”指的是包括任何賦形劑和/或添加劑，其不干擾活性成分的生物學活性的功效并且其對于所施用的宿主是無毒的。在優選的實施方案中，藥物組合物是皮下施用、肌內施用或靜脈內注射的組合物。對于治療本文描述的相關障礙/疾病，這是優選的施用途徑的實例。藥物組合物可以包含除本文描述的rhGH PEG化的前藥之外的其它活性成分。重組人生長激素(rhGH)由于重組人GH在序列上與天然人GH是相同的，本文的術語重組人生長激素(rhGH)還涉及所謂的生物仿制藥(biogenerics)等同物。因此,術語rhGH和hGH在本發明的含義中可以同義應用。本文的術語“生物仿制藥”應當被理解為仿制形式的生物藥物；應用生物方法，通常通過現代生物技術活動開發的分子。仿制化學藥物可以被定義為當與發明人產品相比時，具有基本上類似活性、基本上化學等同于它們市售相似物、生物等價的、在專利過期后通過簡短的程序獲得上市許可的那些分子。技術人員已知現在常規工作是制備例如較少氨基變化的感興趣的生物制品(本文是GH)而不顯著影響生物制品的活性。除了重組人和生物仿制藥，術語重組人生長激素(rhGH)在本文還涉及所有可能的rhGH多肽。在Pharmacia Corporation 的 W0-A 2005/079838 第 15 頁第 0043 段至且包括第0053段中給出了可能的rhGH多肽的準確描述。本文所用的術語“hGH多肽或hGH蛋白質”包括所有的hGH多肽，優選來自哺乳動物物種，更優選來自人和鼠科動物物種，以及它們的變體、類似物、直向同源物、同系物和衍生物以及其片段，其特征在于促進生長期的生長和維持正常的身體組分、合成代謝和脂質代謝。術語“hGH多肽或蛋白質”優選表示具有A. L. Grigorian等人，Protein Science(2005)，14，902-913中公開的序列的22kDa hGH多肽以及其變體、同系物和衍生物，其顯示出基本上相同的生物活性(促進生長期的生長和維持正常的身體組分、合成代謝和脂質代謝)。更優選的是，術語“hGH多肽或蛋白質”指的是具有準確的上述序列的多肽。hGH的衍生物特別包括hGH前藥綴合物，其包含永久連接的聚合物，例如PEG，即本發明的前藥可以包含除一種或多種暫時連接體聚合物綴合物之外的進一步的永久連接體聚合物綴合物。本文所用的術語“hGH多肽變體”指的是來自相同物種但是與參考hGH多肽不同的多肽。通常，差別是有限的，以致參考和變體的氨基酸序列整體是非常相似的并且在很多區域是相同的。優選的是，hGH多肽至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%等同于參考 hGH 多妝，優選 hGH 多妝具有 A. L. Grigorian 等人，Protein Science (2005), 14,902-913中所示的序列。由于多肽的氨基酸序列至少例如95% “等同”于查詢的氨基酸序列，可預期的是主題多肽的氨基酸序列等同于查詢的序列，除了主題多肽序列可能包括至多5個氨基酸改變(在查詢的氨基酸序列的每100個氨基酸中)。參考序列的這些改變可能發生在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端或這些末端位置之間的任何地方，單獨散布在參考序列的殘基中或散布在參考序列的一個或多個鄰近基團中。查詢的序列可以是參考序列的全部氨基酸序列或者本文描述的任何特別的片段。此類hGH多肽變體可以是天然存在的變體，例如天然存在的等位基因變體(其是通過占據生物體的染色體的給定基因座的數個交替形式的hGH之一編碼的)，或同種型(其是通過天然存在的源于單個初級轉錄物的剪接變體編碼的)。可選擇的是，hGH多肽變體可以是不確定是否天然存在并且可以用領域已知的誘變技術制備的變體。本領域已知一個或多個氨基酸可以從生物活性肽或蛋白質的N-末端或C-末端刪除，而基本上不丟失生物功能(參見例如Ron等人，(1993), Biol Chem.，2682984-2988，將該公開的全部內容并入本文作為參考)。本領域技術人員還認為hGH多肽的某些氨基酸序列可以是不同的而不顯著影響蛋白質的結構或功能。此類突變包括根據本領域已知的通用規則所選的缺失、插入、倒位、重復和取代，以便對活性產生較小影響。例如，在Bowie等人(1990)，Science 247 1306-1310中提供了關于如何制備表型沉默氨基酸取代的指南，將其全部內容并入本文作為參考，其中作者指出了研究氨基酸序列對改變的耐受的兩種主要方法。第一種方法依賴進化過程，其中突變是被天然選擇接受的或拒絕的。第二種方法應用基因工程，在克隆的hGH的特別位置引入氨基酸改變并且選擇或篩選以鑒定維持功能的序列。這些研究表明蛋白質令人驚訝地耐受氨基酸取代。作者進一步指出氨基酸改變在蛋白質的某些位置可能是允許的。例如，大多數隱蔽的氨基酸殘基需要非極性側鏈，但是表面側鏈的一些特征通常是保守的。在上文的Bowie等人(1990)以及其中引用的參考文獻中描述了其它的此類表型沉默取代。典型地所見的保守取代是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Phe間的互相代替、殘基Ser和Thr的羥基互換、酸性殘基Asp和Glu的互換、酰胺殘基Asn和Gln之間的取代、堿性殘基Lys和Arg的互換以及芳族殘基Phe、Tyr之間的代替。另外，下列氨基酸組通常表示等價改變:⑴ Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser、Thr ； (2) Cys、Ser、Tyr> Thr ； (3) Val、lie、Leu、Met、Ala、Phe ； (4) Lys、Arg、His ； (5) Phe、Tyr> Trp> His。術語hGH多肽還包括由hGH類似物、直向同源物和/或物種同系物編碼的所有hGH多肽。本文所用的術語“hGH類似物”指的是不同的和不相關的有機體的hGH，其在各自的有機體中表現出相同的功能，但是其不是源于有機體祖先共有的祖先結構。代替地，類似的hGH單獨出現，后來進化表現出相同的功能(或類似的功能)。換言之，類似的hGH多肽是具有非常不同的氨基酸序列但是表現出相同的生物活性(即在促進生長期的生長和維持正常的身體組分、合成代謝和脂質代謝)的多肽。本文所用的術語“hGH直向同源物”指的是兩種不同的物種內的hGH，其序列通過祖先物種中共有的同源hGH而互相關聯，但是其已經進化變成互相不同。本文所用的術語“hGH同系物”指的是不同有機體的hGH，其在各自的有機體內表現出相同的功能，并且其源于有機體祖先共有的祖先結構。換言之，同系hGH多肽是具有非常相似的氨基酸序列的多肽，其表現出相同的生物活性，即促進生長期的生長和維持正常的身體組分、合成代謝和脂質代謝。優選的是，hGH多肽同系物可以定義為多肽表現出至少 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%等同于參考hGH多肽，優選具有以上提及的序列的hGH多肽。 因此，hGH多肽可以是例如⑴其中一個或多個氨基酸殘基是用保守的或非保守的氨基酸殘基(優選保守的氨基酸殘基)取代的，并且這種取代的氨基酸殘基可能是或可能不是由遺傳密碼編碼的；或(ii)其中一個或多個氨基酸殘基包含取代基；或(iii)其中hGH多肽是與另一種化合物融合的，所述的化合物例如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸是融合到以上形式的多肽上的，例如IgG Fe融合區肽或者前導或分泌序列或者用于純化以上形式的多肽的序列或者蛋白質序列。hGH多肽可以是單體或多聚體。多聚體可以是二聚體、三聚體、四聚體或包含至少5個單體多肽單元的多聚體。多聚體還可以是同二聚體或異二聚體。多聚體可以是疏水、親水、離子和/或共價聯合的結果，和/或可以是間接連接的，通過例如脂質體形成。在一個實例中，共價聯合是在包含hGH多肽或其片段的融合蛋白中所包含的異源序列之間(參見例如美國專利號5，478，925，將該公開的全部內容并入本文作為參考)。在另一個實例中，hGH多肽或其片段是連接到一種或多個多肽上，所述的多肽可以是hGH多肽或通過肽連接體形成的異源多肽，例如US. 5，073，627中描述的那些(將其并入本文作為參考)。制備多聚體hGH多肽的另一種方法涉及應用融合到已知促進蛋白質的多聚化的亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈多肽序列上的hGH多肽，其中發現應用本領域技術人員已知的技術包括WO 94/10308的教導。在另一個實例中，hGH多肽可以通過含有Flag 多肽序列的融合hGH多肽中所含的Flag 多肽序列之間的相互作用而聯合。hGH多聚體還可以應用本領域已知的化學技術來產生，例如應用連接分子交聯和本領域已知的連接體分子長度優化技術(參見例如US 5，478，925)、本領域已知的在位于多聚體中包含的所需的多肽序列內的半胱氨酸殘基間形成一個或多個分子內交聯的技術(參見例如US 5，478，925，將半胱氨酸或生物素添加到hGH多肽的C-末端或N-末端)，以及產生包含一個或多個這些修飾的多肽的多聚體的技術(參見例如US 5，478，925)，或者產生包含hGH多聚體的脂質體的30種技術中的任何一種(參見例如美國專利號5，478，925)，將該公開的全部內容并入本文作為參考。本文所用的術語“hGH多肽片段”指的是包含hGH多肽的連續跨度的部分氨基酸序列的任何肽或多肽，優選具有以上提及的序列的多肽。rhGH PEG化的前藥-優詵的PEG,聚合物鏈如上所述，本文描述的rhGH PEG化的前藥應該具有相對低的活性。
因此，在一個優選的實施方案中，每個生長激素分子的總的PEG載量總計至少25kDa。通常，總的PEG載量將小于lOOOkDa。優選的是，PEG載量為至少25kDa并且最大500kDa、甚至更優選至少30kDa并且最大250kDa、甚至更優選至少30kDa并且最大120kDa、甚至更優選至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更優選至少40kDa并且最大90kDa。PEG可以通過一個或多個錨定點與hGH連接。在一個錨定點的情況中，hGH PEG前藥單綴合物中的相應PEG將是分支的并且包含至少3條鏈。在多于一個錨定點的情況中，例如雙綴合物，hGH PEG前藥中的相應PEG可以是分支的或線性的。雙綴合物可以包含一個或兩個暫時連接，并且PEG可以是線性的或分支的或者包含一個線性鏈和一個分支鏈的混合物。在這種情況中，雙綴合物包含一個暫時連接以及一個線性鏈和一個分支鏈，暫時連接可以在其中任一鏈上。在這種情況中，應用分支的PEG鏈，可以存在一個或多個分支單元。分支的PEG是包含連接兩條或多條PEG鏈的分支點的PEG分子，從而與連接生長激素的一個錨定點形成分子。其可以是兩條20kDa的PEG鏈，連接形成一條分支的40kDa的PEG分子。在其中分子包含兩個或三個分支點的情況中，該分子分別表不具有3和4個 臂的PEG。總之并且在以上提及的限制內，PEG聚合物不限于特別的結構并且可以是線性的、分支的或多個臂的(例如叉狀PEG或與多元醇核連接的PEG)、樹枝狀的或含有可降解的連接體。不受理論的限制，PEG載量旨在提供適合的分子質量，從而獲得所需的相對低的活性，并且不含有太高分子質量的PEG，太高分子質量的PEG可能導致其它問題。對天然人GH進行PEG化可以發生在數個賴氨酸基團上或者發生在N-末端胺上(Fl)，如Clark等人(本文參考文獻2)的第21973頁表III所描述的。高度反應性是位點Fl和LYS-HO0中度反應位點是LYS-115、LYS-38和LYS-70。弱反應性是位點LYS-172、LYS-41、LYS-158 和 LYS-168。在更通用的術語中，在本文中與暫時連接體組合應用的PEG可以通過適合選擇所述的聚合物來降低脂肪萎縮的風險。但是，本發明的原理還適用于除PEG之外的聚合物。因此，術語PEG在本文中僅用作適合聚合物的實例。因此，在優選的實施方案中，hGH PEG前藥是伯胺基團之一與聚合物鏈Stl的可自動裂解的官能團La綴合的單綴合物。該聚合物鏈S°的分子量為至少5kDa并且包含至少一個分支結構BS1。分支結構BS1包含第二個聚合物鏈S1，其分子量為至少4kDa。如上所述，需要至少第三個聚合物鏈S2，其分子量為至少4kDa。聚合物鏈S2可以是BS1的部分或者可以是S°或S1的進一步的分支，從而引起進一步的分支結構BS2，其包含S2。在本發明的前藥綴合物中存在任選多于3條聚合物鏈，例如4、5、6、7或8條。但是，每條進一步的聚合物鏈的分子量為至少4kDa。聚合物鏈的總數是受前藥綴合物的總重量(最大IOOODa (不包含hGH-NH))限制。因此，本發明優選的實施方案涉及組合物，其中分支結構BS^BS2中至少一個包含進一步的第四條聚合物鏈S3，其分子量為至少4kDa，或者S°、S1、S2之一包含第三個分支結構BS3，其包含至少第四條聚合物鏈S3，其分子量為至少4kDa。分支結構或聚合物鏈之一包含自動裂解誘導基團G%其是La的自動裂解所必需的。任選的是，分支結構之一用作基團G%從而分支結構包含Ga(代替包含所述的基團)，其也包括在術語“包括”中。前藥綴合物(AA)的制備通常產生綴合物的混合物，其中hGH的數個伯胺基團綴合，引起不同的單綴合的、不同的雙綴合的、不同的三綴合的等前藥。相應的單綴合、雙綴合或三綴合的hGH PEG前藥可以通過本領域已知的標準方法來分離，例如柱色譜法等。在hGH PEG前藥的單綴合物中，至少三條聚合物鏈S°、S1、S2包含“聚合物部分”，其特征在于一個或多個重復單元，這些重復單元可以是隨機的、嵌段的(block wise)或交替分布的。另外，至少三條聚合物鏈S°、S\S2顯示末端基團，其典型的是氫原子或具有I至6個碳原子的烷基，其可以是分支的或不分支的，例如甲基，特別是對于基于PEG的聚合物鏈，引起所謂的mPEG。
需要指出的是，在至少三條聚合物鏈S°、S1、S2中的聚合物部分可以進一步含有鏈樣取代基，其源于重復單元并且引起具有小于4kDa分子量的鏈，并且不認為該鏈是聚合物鏈S°、S1、S2等。優選的是，至少三條聚合物鏈S°、S1、S2具有小于IOOODa分子量的取代基。S0的相關結構特征是其臨界距離。臨界距離定義了連接的原子所測量的S°與La的連接位點與第一個分支結構BS1之間的最短距離。臨界距離的長度對剩余活性有影響，如化合物33所討論的。臨界距離優選小于50、更優選小于20、最優選小于10。至少三條聚合物鏈S°、S1、S2典型地各自含有互連部分。在至少一個互連部分中存在Ga。對于除S°之外的聚合物鏈，互連部分是連接例如S1的聚合物部分與BS1以及S2的聚合物部分與BS2的結構元件。對于S°，互連部分是連接La和BS1的結構元件。互連部分可以包括C1J烷基鏈，其是分支的或不分支的并且其任選被雜原子或官能團間斷或終止，所述的雜原子或官能團選自-O-、-S-、N(R)、C(O)、C(O)N(R)、N(R)C(O)、一個或多個碳環或雜環，其中R是氫或C1J烷基鏈，其任選被一個或多個上述原子或基團間斷或終止，其進一步含有氫作為末端原子；并且其中碳環是苯基、萘基、茚基、茚滿基、四氫化萘基、C3_10環烷基；并且其中雜環是4至7元雜環基或9至11元雜二環基。“C3_1(l環烷基”或“C3_1(l環烷基環”表示含有3至10個碳原子的環烷基鏈，其可以含有至少部分飽和的碳-碳雙鍵，例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環己烯基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基。環烷基碳上的每個氫可以被取代基代替。術語“C3_1(l環烷基”或“C3_1(l環燒基環”還包括橋連的二環,例如降冰片燒(norbonane)或降冰片烯(norbonene)。“4至7元雜環基”或“4至7元雜環”表示含有4、5、6或7個環原子的環，其可以含有至多最大數量的雙鍵(芳族或非芳族環，其是完全飽和的、部分飽和的或不飽和的)，其中至少一個環原子至至多4個環原子被雜原子代替，所述的雜原子選自硫(包括-S (0) -、-S (O)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)，并且其中環是通過碳或氮原子與分子的其它部分連接的。4至7元雜環的實例是氮雜環丁烷、氧雜環丁烷、硫雜環丁烷、呋喃、噻吩、批咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、5惡唑、_唑啉、異T惡唑、異$惡唑啉、噻唑、噻唑啉、異噻唑、異噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氫呋喃、四氫噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、P惡唑烷、異1唑烷、噻唑烷、異噻唑烷、噻二唑烷、環丁砜、吡喃、二氫吡喃、四氫吡喃、咪唑烷、吡啶、噠嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、嗎啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮雜環庚烷、氮雜攀或高哌嗪。
“9至11元雜二環基”或“9至11元雜二環”表示含有9至11個環原子的兩個環的雜環系統，其中至少一個環原子被兩個環共享并且其可以包含至多最大數量的雙鍵(芳族或非芳族環，其是完全飽和的、部分飽和的或不飽和的)，其中至少一個環原子至至多6個環原子被雜原子代替，所述的雜原子選自硫(包括-s(o)-、-s(o)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)，并且其中環通過碳或氮原子與分子的其它部分連接。9至11元雜二環的實例是吲哚、二氫吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并5惡唑、苯并異T惡唑、苯并噻唑、苯并異噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氫喹唑啉、喹啉、二氫喹啉、四氫喹啉、十氫喹啉、異喹啉、十氫異喹啉、四氫異喹啉、二氫異喹啉、苯并氮雜幕、嘌呤或蝶啶。術語9至11元雜二環還包括兩個環的螺環結構，例如1，4-二氧雜-8-氮雜螺[4. 5]癸烷，或者橋連的雜環，例如8-氮雜-二環[3. 2.1]辛烷。碳環、雜環和雜二環可以被CV2tl烷基取代，任選被雜原子或 官能團間斷或終止，所述的雜原子或官能團選自-O-、-S-、N(R)、C(0) ,C(O)N(R)、N(R) C(0)，其中R是氫或C1,烷基鏈，其任選被一個或多個上述原子或基團間斷或終止，其進一步含有氫作為末端原子。至少三條鏈S°、S\S2的聚合物部分形成鏈的主要部分，優選至少90%的每條鏈的分子量、更優選至少95 %、甚至更優選至少97.5%、甚至更優選至少99 %。因此，鏈的主要部分是由聚合物部分來表示的。優選的是，至少三條鏈S°、S\S2獨立地基于聚合物，所述的聚合物選自聚烷氧基聚合物、透明質酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚’惡唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有機磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚酯。優選的是，至少三條鏈S°、S1、S2是基于相同的聚合物。優選的是，至少三條鏈S°、S1、S2是基于聚烷氧基聚合物。甚至更優選的是，至少三條鏈S°、S1、S2基于聚乙二醇。相應地，也適用于進一步的鏈S3、S4、S5等。鏈sO包含分支結構BS1，從而S1與3°連接。對于S2的連接，可以應用分支結構BS1或存在進一步的分支結構BS2，其可以是S°或S1的部分。因此，當存在進一步的鏈時，可以存在進一步的分支結構。例如，在存在鏈S3的情況中，其可以與BS^BS2或分支結構BS3連接。分支結構BS3，如果存在，可以是S°、S1或S2的部分。通常，可以應用允許分支的鏈的任何化學實體。優選的是，分支結構獨立地選自至少3-倍取代的碳環、至少3-倍取代的雜環、叔碳原子、季碳原子和叔氮原子，其中術語碳環和雜環如上面所定義的。rhGH PEG化的前藥-暫時連接體結構，L5、G5在本領域的出版物中，自動裂解誘導基團有時被稱為連接體，以區分它們與載體的結構。但是，通常難以清楚地分離這些結構特征。因此，在本發明的含義中，裂解誘導基團Ga被認為是載體S的部分，所述的載體S包含至少S°、S1、S2、BS1和任選的BS2。Ga化學性質的變化在很大程度上使得相應載體連接的前藥的自我裂解性質得以設計。如上面所討論的，PEG化的前藥，其中藥物是例如專利申請W0-A2005/099768中描述的rhGH，并且具有釋放特征，其中其被描述為1，6裂解系統，而沒有產生有毒的芳族化合物。在該文獻中，廣泛描述了很多相關的適合的暫時連接體結構，以獲得感興趣的相關釋放分布。其它暫時連接體結構通常/廣泛描述于例如其它復雜生物系統GmbH申請中，例如WO-A 2005/034909, WO-A 2005/099768, WO-A 2006/003014 和 TO-A2006/136586。在例如WO-A 99/30727 (Enzon Inc)中廣泛描述了更多的暫時連接體結構。為了解決本文討論的GH的問題，本發明已經選擇了適合的優選的暫時連接體結構，以獲得本文描述的rhGH PEG化的前藥的相關的功能性質。基于本文詳述的優選的連接體結構，在技術人員的知識范圍內可以制備其它適合的優選的暫時連接體結構，其可以得到具有本文描述的相關功能性質的rhGH PEG化的前藥。特別的是，可以選擇適合的暫時連接體結構(其是可自身水解的(可自動裂解))摻入至S°。下面詳細描述本文所選的連接體結構。理想的是，本發明的綴合物將具有一種或多種以下特征和/或優于目前rhGH綴合物或制劑的優點可以易于以高產率合成、半衰期在優選的范圍內、可以純化以提供均勻的綴合物組合物、在自動裂解后表現出活性，例如體外和體內活性，并且具有優于未修飾的 rhGH和先前描述的rhGH綴合物的藥效學作用并且不引起脂肪萎縮。本文描述的結構表現出本文所需的釋放性質。通常，載體連接的前藥需要存在連接藥物和載體的可裂解的官能團。在缺乏自動水解誘導基團的情況中，涉及藥物提供的氨基(例如脂族酰胺或氨基甲酸酯鍵La)的官能團通常對于水解是非常穩定的，并且酰胺鍵的裂解速率對于前藥系統中的治療用途將非常緩慢。如果此類穩定連接被用于載體連接的前藥中，在沒有生物轉化的治療應用期間，官能團的裂解是不可能的。在這些情況中，連接體顯示出結構基序，其作為底物被相應的內源性酶識別。在這種情況中，官能鍵La的裂解涉及包含酶的復合物。實例是肽連接體，其被內源性蛋白酶識別并且酶解。酶的水平在個體間顯著不同，這導致通過酶裂解引起的前藥活化的生物學差異。酶的水平還取決于施用部位而不同。例如已知在皮下注射的情況中，身體的某些區域產生比其它區域更可預料的治療作用。這種高水平的患者間變異性是不希望的。另外，對于這種西酶-依賴的載體連接的前藥，難以建立體內-體外藥物動力學性質的對應關系。在缺乏可靠的體內-體外對應關系時，優化釋放分布變成一項麻煩的工作。為了避免患者間和注射部位的變異性，需要應用載體連接的前藥，其在治療應用時期內表現出裂解動力學而無需額外的酶幫助裂解。特別是對于高分子量載體，特別是對于分支的聚合物載體，對于酶由于空間位阻，獲得連接官能團La可能受到限制。因此，需要設計表現自身裂解性質的載體連接的前藥。自動裂解動力學可以例如通過在不含酶的緩沖溶液中記錄水解速率來體外測定。為了將水解不穩定性引入到官能團L(例如酰胺或氨基甲酸酯)中，需要將結構化學組分設計到載體中，以發揮作用，例如作為接近官能團的鄰近基團。此類自動裂解誘導化學結構(其對前藥酰胺鍵的可裂解性產生控制)稱為自動裂解誘導基團Ga。自動裂解誘導基團可以對給定的官能團La的水解速率具有很強的作用。優選的La選自C (0) -0-和C (0) _，其與hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基團。因此，優選本發明的組合物，其中La選自C(O)-O-和C(O)_，其與hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基團，產生式(AAl)或(AA2)
hGH-NH-C (0) O-S0 (AAl)hGH-NH-C (0) _S° (AA2)以下部分將列出多種結構組分，其可以用作裂解誘導基團Ga。基團Ga表示自動裂解誘導基團。^可以以本身存在或者作為級聯自動裂解誘導基團存在，其是暴露的以通過另外的水解或酶裂解步驟變得有效。如果Ga以本身存在，其控制La的限速自動水解。Ga的實例A. J. Garman 等人(A. J. Garman, S. B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987, 223 (2)，361-3651987)將PEG5000-馬來酸酐用于組織型纖溶酶原激活物和尿激酶中氨基的可逆修飾。PEG-uPA綴合物的功能酶的再生是在pH 7. 4緩沖液中溫育，通過裂解馬來酰胺酸連接，一級動力學半衰期為6.1小時。 單一的芳族部分可能意味著連接的氨基甲酸酯鍵的不穩定性(W0-A01/47562)。例如，在前藥方法中應用取代的或未取代的芴基甲基，使得氨基甲酸酯連接對多種生物活性試劑不穩定(Tsubery 等人，J Biol Chem 279(2004)38118-24)。在 W0-A 2007/075534 中兩條PEG鏈與芴基部分連接。因此，Ga是直接與氨基甲酸酯官能團La連接的芳族環或芴基甲基。因此，優選本發明的組合物，其中Ga是直接與由La和hGH的伯氨基形成的氨基甲酸酯官能團連接的芳族環或芴基甲基。可選擇的是，Ga的轉化可以誘導S°內的分子重排，例如1，4或1，6_消除。該重排使得La非常不穩定以至于被誘導裂解。Ga的轉化是級聯機制中的限速步驟。理想的是，暫時連接的裂解速率等同于給定的治療方案中藥物分子預期釋放速率。在這種基于1，6_消除的級聯系統中，需要La的裂解在其不穩定性被Ga的轉化誘導后基本上是同時發生的。另夕卜，需要限速裂解動力學是在治療應用期間進行，而無需另外的酶幫助，從而避免以上討論的與大部分酶裂解相關的缺點。R. B. Greenwald, A. Pendri, C. D. Conover, H. Zhao, Y. H. Choe，A. Martinez, K. Shum,S.Guan，J.Med. Chem.，1999，42，3657-3667 和 PCT 專利申請 WO-A 99/30727 描述了合成含氨基小分子化合物(基于1，4_或1，6_芐基消除)的聚乙二醇前藥的方法。在該方法中，藥物分子的氨基是通過氨基甲酸酯基團與PEG化的芐基部分連接的。聚乙二醇通過酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺鍵與芐基連接。藥物分子中PEG的釋放是通過自動水解和酶裂解的組合來發生的。在該方法中，釋放觸發掩蔽基團的裂解之后是經典的且快速的1，4_或1，6_芐基消除。該連接體系統還用于蛋白質的可釋放的聚乙二醇綴合物(S.Lee，R. B. Greenwald等人 Bioconj. Chem. 2001，12(2)，163-169)。將溶菌酶用作模型蛋白，因為當PEG化發生在賴氨酸殘基的e-氨基時其失去其活性。多種量的PEG連接體與蛋白質綴合。PEG綴合物中天然蛋白質的再生發生在大鼠血漿中或發生在非生理的高pH緩沖液中。還參見F. M. H. DeGroot 等人(W0-A 2002/083180 和 W0-A2004/043493)和 D. Shabat 等人(W0-A2004/019993)。因此，La是氨基甲酸酯官能團，所述基團的裂解是通過Ga的羥基或氨基經S°的1，
4-或1，6_芐基消除來誘導的，其中Ga包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺鍵，其經歷限速轉化。事實上，Ga可以通過水解裂解。
因此，優選本發明的組合物，其中La與hGH的氨基一起形成氨基甲酸酯官能團，所述基團的裂解是通過Ga的羥基或氨基經S°的1，4_或1，6_芐基消除來誘導的，其中Ga包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺鍵，其經歷限速轉化。Ga可以包含由Ga組分激活的級聯裂解系統，其包括代表上述前體的結構組合。Ga的前體可以包含另外的暫時連接，例如酰胺、酯或氨基甲酸酯。前體的暫時連接(例如氨基甲酸酯)對水解的穩定性或敏感性可以由自動水解性質控制或需要酶活性。Antczak 等人(Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48)描述了一種試劑，對于含胺的藥物分子，其形成了大分子級聯前藥系統的基礎 。在該方法中，抗體用作載體，穩定的鍵將抗體與活化的基團連接，帶有可裂解的掩蔽基團。在除去酯連接的掩蔽基團后，La裂解并且釋放藥物化合物。D. Shabat 等人(Chem. Eur. 3. 2004，10,2626-2634)描述了基于扁桃酸活化基團的聚合物前藥系統。在該系統中，掩蔽基團是通過氨基甲酸酯鍵與活化基團連接的。活化基團通過酰胺鍵與聚丙烯酰胺聚合物永久綴合。通過催化抗體活化掩蔽基團后，掩蔽基團通過環化裂解并且釋放藥物。藥物釋放后，活化基團仍然與聚丙烯酰胺聚合物連接。M. -R. Lee 等人(Angew. Chem. 2004，116，1707-1710)描述了基于扁桃酸活化基團和酯連接的掩蔽基團的類似前藥系統。但是，在這些連接中，1，6消除步驟仍然產生高活性芳族中間體。即使芳族部分與聚合物載體保持永久連接，也可能引起潛在毒性或免疫原性作用的副反應。Greenwald等人在2000年公開了基于三甲基鎖合內酯化作用的含氨基的前藥的聚乙二醇藥物遞送系統(R. B. Greenwald 等人，J. Med. Chem. 2000，43 (3)，457-487 ；W0-A02/089789)。在該前藥系統中，取代的鄰-羥基苯基_ 二甲基丙酸通過酰胺鍵與藥物分子的氨基偶聯。羥基通過酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基團與PEG連接。藥物釋放的速率確定步驟是內酯化作用(釋放芳族內酯副產物)的快速酰胺裂解后的這些官能團的酶裂解。最近，R.B. Greenwald 等人(Greenwald 等人，J. Med. Chem. 2004,47, 726-734)描述了基于雙-(N-2-羥基乙基)對羥苯基甘氨酸酰胺(N-二(羥乙基)甘氨酸酰胺)連接體的PEG前藥系統。在該系統中，兩個PEG分子與N-二(羥乙基)甘氨酸分子(其與藥物分子的氨基偶聯)連接。在前藥活化中第一個兩步是兩個PEG分子的酶裂解。所述的PEG和N-二(羥乙基)甘氨酸之間不同的連接引起不同的前藥活化動力學。該系統的主要缺點是與藥物分子綴合的N-二(羥乙基)甘氨酸的緩慢水解速率(在磷酸緩沖液中t1/2 = 3小時)，這引起N-二(羥乙基)甘氨酸修飾的前藥中間體的釋放，與母體藥物分子相比，這可能表現出不同的藥物動力學和藥效學性質。更特別的是，對于S°，以下描述了具有特別間隔部分的優選的基團La和Ga。根據WO-A 2005/099768，優選的結構選自通式(I)和(II)
權利要求
1.藥物組合物，該藥物組合物包含適合的藥物賦形劑并且還包含人體內臨床有效量的重組人生長激素(rhGH)PEG化的前藥綴合物，其中PEG通過自身可水解(自動裂解)的暫時連接體與rhGH連接；所述的前藥綴合物的特征在于 (1):綴合物的GH活性小于不含PEG的天然生長激素的5%； (2):連接體自動水解速率是體內半衰期為10小時至600小時的速率；并且 (3)=PEG的分子量為40kDa或更大。
2.權利要求1的藥物組合物，其中自動水解速率是體內半衰期比相應的hGHPEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多5倍的速率。
3.權利要求2的藥物組合物，其中體內半衰期比相應的hGHPEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多3倍。
4.權利要求2或3的藥物組合物，其中體內半衰期比相應的hGHPEG化的前藥綴合物的體外半衰期短至多2倍或幾乎相同。
5.權利要求1或2的藥物組合物，其中組合物是用于皮下施用、肌內施用或靜脈內注射的組合物。
6.權利要求1或2的藥物組合物，其中PEG化的前藥中每個生長激素分子的總PEG載量總計至少25kDa。
7.權利要求1或2的藥物組合物，其中前藥綴合物具有化學結構(A)
8.權利要求7的藥物組合物，其中權利要求7的結構(A)中的式(I)的部分結構，其是
9.權利要求7的藥物組合物，其中權利要求7的結構(A)中的式(II)的部分結構，其是
10.權利要求7的藥物組合物，其中權利要求7的式(A)中的PEG-X是式III的PEG-W
11.權利要求1或2的藥物組合物，其中前藥綴合物結構是
12.權利要求1或2的藥物組合物，其中連接體體內自動裂解速率是體內半衰期為20至300小時的速率。
13.權利要求1或2的藥物組合物，其中連接體體內自動裂解速率是體內半衰期為20至150小時的速率。
14.權利要求1或2的藥物組合物，其中連接體體內自動裂解速率是體內半衰期為30至100小時的速率。
15.權利要求1或2的藥物組合物，其中連接體體內自動裂解速率是體內半衰期為30至75小時的速率。
16.臨床有效量的權利要求1或2的藥物組合物，其用于治療人GH相關疾病的方法。
全文摘要
本發明涉及PEG化的重組人生長激素化合物。通過加入包含聚乙二醇的暫時連接體制備的化學修飾的人生長激素(rhGH)。化學修飾的蛋白質比未修飾的rhGH具有更長的rhGH活性持續期，從而能夠降低劑量和施用機會，并且修飾的rhGH不會引起脂肪萎縮。本發明還包括治療和/或預防其中應用生長激素是有利的疾病或障礙的應用方法。
文檔編號A61K47/48GK102989001SQ20121032558
公開日2013年3月27日 申請日期2009年4月29日 優先權日2008年4月29日
發明者H·拉烏, S·金德曼, T·萊斯曼, G·諾斯科夫拉斯姆森, U·赫澤爾, T·韋格, K·斯普羅格 申請人:阿森迪斯藥物股份有限公司