專利名稱：一種小牛血去蛋白提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種小牛血去蛋白提取物及其制備方法，以及小牛血去蛋白提取物在制劑中的應用。
背景技術：
小牛血去蛋白提取物由Jaeger KH于20世紀60年代研制成功，主要由無機離子鉀、氯、鈉等及小分子多肽、氨基酸、核苷酸、酮酸等物質組成，能夠促進細胞對葡萄糖和氧的攝取和利用，促進線粒體呼吸，促進組織的復原和再生，能保護大腦神經細胞，減輕腦缺血再灌注損傷，改善大腦中氧和能量供應，消除氧自由基、促進神經細胞修復等作用。特別對中風、顱腦外傷等器質性精神障礙有特殊的療效，對創傷、潰瘍、灼傷等損傷組織也有 促進愈合的作用。小牛血去蛋白提取物進口制劑如瑞士素高公司生產的素高捷療眼膏、奧地利奈科明的愛維治已進入中國市場，國產制劑生產商也有數家，如錦州奧鴻藥業有限責任公司、黑龍江江世藥業有限公司、吉林康乃爾藥業有限公司等等，其中制劑原料有來自血清、全血、紅細胞三種形式。專利96120777、200510132478. O公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括采幼牛靜脈血，分離出血清，用乙醇去蛋白，減壓去除乙醇，加入復合蛋白酶水解，離心分離留上清，將上清液中的乙醇濃縮，濃縮液用超濾截留，即得到小牛血去蛋白提取液。該方法采用低溫離心方式進行分離，對工藝設備要求較高，同時能耗也較大。專利200710194950. 2公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括采幼牛靜脈血，離心得到血清，加熱除蛋白，濾液濃縮后加乙醇進行醇沉，過濾并濃縮濾液，得到醇沉后的濾液，濾液調酸性并加入活性炭脫色，過濾收集濾液，濾液調至堿性，冷凍除蛋白，過濾得到的濾液用纖維膜超濾除高分子物質，反復2 5次，過濾即得到小牛血去蛋白提取物。該方法冷凍除蛋白的條件為-50 0°C，時間為12 72小時，且需反復2 5次，工序較長，能耗較大。專利200610080520. 3公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括采幼牛靜脈血，分離出血清，用乙醇去蛋白，減壓去除乙醇，加入復合蛋白酶水解，離心分離留上清，上清液以截留分子量為5000道爾頓的中空纖維柱超濾，然后分別過葡聚糖G-15凝膠柱、Sephadex-50凝膠柱,特征性收集280nm處有特異吸收的懼分,最后采用微孔濾膜過濾和紫外線滅活。該方法采用葡聚糖G-15凝膠柱、Sephadex-50凝膠柱分離純化，分離效率偏低，產業化存在一定難度。專利200810094486. 4公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血清用96%乙醇進行醇沉，離心后留上清濃縮后用截留分子量100000D的中空纖維柱粗濾，濾液依次用甲苯、乙酸乙酯、正丁醇萃取，保留水層，水層溶液濃縮后用BI0-GEL-P2凝膠層析分離；即為小牛血清去蛋白提取液。該方法采用有機溶劑萃取和柱層析結合的方式進行分離純化，不僅會導致效率不高，同時甲苯二類溶劑會影響產品的安全性。專利200710117951. 7公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血清先用紗布粗濾，去除纖維蛋白后，以500(Tl0000rpm離心2min,然后依次用濾紙過濾、O. 2 μ m濾膜精濾、10000^20000分子量的超濾器進行超濾、5000-8000分子量的超濾器進行超濾，將超濾液濃縮后調PH值至6. 5^7. 5，滅菌后冷凍f 2d，緩化放置3 15d，調pH值至
5.5飛.5，再用6000分子量的超濾器進行超濾，經O. 2 μ m濾膜精濾和滅菌。該方法生產周期長，會影響生產效率；滅菌冷凍后緩化3 15天對工作廠地大小和環境有較高要求，將制約生產產能和生產效率。專利200810148841. I公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血全血依次經過酸沉、冷凍、融化、收集離心后上清液，上清液依次再經過堿沉、冷凍、融化、離心，離心上清液再進行酸沉，上清液依次進行反滲透濃縮、中空纖維柱超濾。該方法需要冷凍至-20°C，再在40°C條件下融化，整個生產周期長，生產效率不高。專利200910246717. 3,200510076914. 7制備方法中均加入了枸椽酸鈉，并在低溫保存后收集上清液，上清液加入胃蛋白酶酶解，并過活性碳柱或者殼聚糖改性活性碳柱。該 制備方法采用了酶解工藝，容易產生雜質，同時上清液過活性炭柱無法控制產品的無菌。專利201010291699. 3公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血進行反復低溫冷凍、升溫后再加入注射用水，離心得上清液，上清液冷卻至_5°C，攪拌加入-1(T-2(TC的冷丙酮，低溫環境下靜置后離心得上清液；上清液濃縮后依次調節pH值3. 5 4. 5,7. 5 8. 5離心得上清液，上清液然后pH值6. 5 7. 5后，然后再分別利用50KD，IOKD和5KD超濾膜逐級超濾澄清。該制備方法需在低溫條件下進行，對工藝設備要求較高，同時該工藝存在多次調PH值工序的問題，耗時較長。專利200410062657. 7公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血離心得紅細胞，加水凍溶，破壞紅細胞膜，釋放出內容物，離心，得到去除部分大分子量蛋白質的上清液，對上清液進行巴氏消毒，然后進行超濾、納濾脫鹽、反滲透濃縮，最后醫用活性炭脫色。該方法采用超慮、納濾、反滲透濃縮技術，其中納濾對液體中分子量為數百的有機小分子具有分離性能，而小牛血去蛋白提取物分子量一般控制在5000道爾頓，其工藝會損失部分活性成分。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的是提供一種制備小牛血去蛋白提取物的方法，應用該方法制備的提取物總固體含量、呼吸活力、刺激指數均符合藥用要求，蛋白質、高分子量物質也能得到有效控制，從而保證了小牛血制劑的原料質量，減低小牛血制劑臨床使用的風險，該制備方法同時具備操作簡便，易于產業化的特點。為了實現上述目的，采用如下技術方案制備小牛血去蛋白提取物
(1)取小牛全血,加入體積為I.5^2倍全血量的純化水，不斷攪拌,并加熱至體系(小牛全血與水的混合物)溫度達到80°C，對小牛血進行滅活；
(2)滅活后的小牛血降至室溫，并向體系中加入80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置，分離全部上清液；
(3)合并步驟(2)兩次得到的上清液，并對上清液進行減壓濃縮，濃縮液倒入澄清過濾器進行過濾；(4)濾液用稀鹽酸調pH呈弱酸性，然后向弱酸性濾液中加入針用活性炭，進行脫色；
(5)依次使用鈦棒過濾、微孔濾膜過濾、富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。所述步驟(I)加入I. 5 2倍全血量的純化水，不僅可以減低體系的粘度，便于攪拌，此外，純化水的加入降低細胞外溶液的濃度，在滲透壓的作用下，細胞發生吸水溶脹，在外力攪拌作用下利于細胞破裂而釋放內容物，可提高小牛全血利用率。攪拌過程中加熱使體系溫度達到80°C，并保溫30mirT40min，以殺滅小牛全血中的病毒，同時使部分蛋白變
性。 所述步驟(2)向體系中加入80% 90% (v/v)乙醇量為小牛全血量的4飛倍，攪拌均勻，靜置36h，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入小牛全血量4飛倍80% 90% (v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置12h，分離全部上清液；
所述步驟(3)對上清液采用單效濃縮器進行減壓濃縮，真空壓力控制在O. 06Mpa O. 08Mpa，蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，上清液濃縮溫度控制在40°C 50°C，濃縮液與上清液的體積比控制在1:20(Γ250，濃縮液倒入澄清過濾器進行過濾。所述步驟(4)濾液采用質量濃度為9. 5^10. 5%的稀鹽酸調節pH至4. O 5. O之間，按濾液體積O. 5 °/Γθ. 9%的量加入針劑用活性炭，攪拌，加熱至80°C并保溫30min。所述步驟(5)先用鈦棒濾炭后，再用裝有0.22 μ m微孔濾膜的平板濾器過濾，上述濾液再用富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。小牛血去蛋白提取物廣泛應用于注射液、凍干粉針、膠囊劑、外用制劑或眼用制劑等制劑，采用本發明技術方案制備的小牛血去蛋白提取物所制備的小牛血去蛋白提取物注射液和注射用小牛血去蛋白提取物的呼吸活力、總固體含量、游離氨基酸等檢測項目均符合藥品注冊標準，尤其是本發明技術方案生產的小牛血去蛋白提取物制備的注射用小牛血去蛋白提取物在不加任何制劑輔料即可制備出成型性良好的合格產品，可降低了輔料對制劑造成的安全隱患，可提高制劑的安全性。本發明能夠達到以下技術效果
本發明通過對醇沉工藝、脫色工藝、過濾材料組合使用來實現小牛血去蛋白提取物的制備，避免了現有提取技術中萃取、柱層析等不利于產業化的操作步驟，具有操作簡便，便于工藝化大生產，條件溫和的特點，減少了小牛血活性成分的破壞，可有效提高提取物的內在質量；小牛血去蛋白提取物采用小牛全血作為提取原料，并通過加適量純化水使細胞溶脹，加速細胞的破裂釋放內容物，在滿足制劑質量要求的前提下，提高了小牛全血利用率；此外，本發明制備的小牛血去蛋白提取物制備注射用凍干粉針劑時可以不添加甘露醇等任何賦形劑即可達到理想的制備效果，可消除輔料的安全隱患。
圖I為小牛血去蛋白提取物制備工藝流程圖。
具體實施例方式應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的說明。在本說明書中，除非特別指明，否則所用技術術語為本領域中的普通技術人員常用術語；本說明書中未注明具體條件的實驗方法為常規實驗方法；本說明書中所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品，各種試劑的成分和配制方法可參見常規實驗手冊中的操作。如圖I所示，一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括以下步驟 (1)取小牛全血(濉溪縣匯豐生物科技有限公司)，加入體積為I.5 2倍全血量的純化水(不僅可以減低體系的粘度，便于攪拌，此外，純化水的加入降低細胞外溶液的濃度，在滲透壓的作用下，細胞發生吸水溶脹，在外力攪拌作用下利于細胞破裂而釋放內容物，可提高小牛全血利用率)，不斷攪拌，并加熱至體系(小牛全血與水的混合物)溫度達到80°C，并保溫30mirT40min，以殺滅小牛全血中的病毒，同時使部分蛋白變性；
(2)滅活后的小牛血降至室溫，并向體系(小牛全血與水的混合物)中加入體積為小牛全血量4 5倍的80% 90% (v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置36h，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入體積為小牛全血量4飛倍80% 90%(v/v)的乙醇，攪拌均勻，靜置12h，分離全部上清液；
(3)合并步驟(2)兩次得到的上清液，并對上清液采用單效濃縮器進行減壓濃縮，真空壓力控制在O. 06Mpa O. 08Mpa,蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，料液濃縮溫度控制在400C 50°C，濃縮液與上清液的體積比控制在1:200^250,濃縮液倒入澄清過濾器進行過濾；
(4)濾液用質量濃度為9.5^10. 5%的稀鹽酸調節pH至4. O 5. O之間，按濾液體積O. 59Π). 9%的量加入針劑用活性炭，攪拌，加熱至80°C并保溫30min，進行脫色；
(5)先用鈦棒濾炭后，再用裝有O.22 μ m微孔濾膜的平板濾器過濾，上述濾液再用FVRG75型富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。實施例I :
取小牛全血(濉溪縣匯豐生物科技有限公司)2000ml，加純化水3000ml，升溫至80°C，不斷攪拌并保溫30min以滅活，冷卻至常溫后加入80% 90%(v/v)乙醇8000ml，攪拌3h后，靜置36h，分離約4000ml上清液，向母液再加入80% 90%(v/v)乙醇8000ml，攪拌3h后，靜置12h，分離上清液。上清液采用單效濃縮器進行減壓濃縮，真空壓力控制在O. 06Mpa左右，蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，上清液濃縮溫度控制在40°C左右，濃縮至濃縮液約50ml，即濃縮液與上清液的體積比控制約1:200，將濃縮液倒入澄清過濾器過濾，向濾液中加入質量濃度為9. 5^10. 5%的稀鹽酸，調節pH至4. O,按濃縮液體積O. 5%加針劑用活性炭，不斷攪拌，加熱至80°C并保溫30min，濃縮液先用鈦棒濾炭，再用O. 22 μ m微孔濾膜的平板濾器進行過濾，最后采用富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。實施例2
取小牛全血(濉溪縣匯豐生物科技有限公司)2000ml，加純化水4000ml，升溫至80°C，不斷攪拌并保溫30min以滅活，冷卻至常溫后加入80% 90%(v/v)乙醇10000ml，攪拌3h后，靜置36h,分離約7000ml上清液，向母液再加入80% 90%(v/v)乙醇10000ml,攪拌3h后，靜置12h，分離上清液。上清液采用單效濃縮器進行減壓濃縮，真空壓力控制在O. OSMpa左右，蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，上清液濃縮溫度控制在50°C左右，濃縮至濃縮液約60ml,即濃縮液與上清液的體積比控制約1:250，將濃縮液倒入澄清過濾器過濾，向濾液中加入質量濃度為9. 5^10. 5%的稀鹽酸，調節pH至5. 0，按濃縮液體積O. 9%加針劑用活性炭，不斷攪拌，加熱至80°C并保溫30min，濃縮液先用鈦棒濾炭，再用O. 22 μ m微孔濾膜的平板濾器進行過濾，最后采用富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。
實施例 3
小牛血去蛋白提取物脫色采用活性碳吸附，為了達到理想的脫色效果，對活性炭使用量、溶液的PH值范圍進行了考察，采用質量濃度為9. 5^10. 5%的稀鹽酸使溶液呈弱酸性，然后向弱酸性溶液中加入針用活性炭，不斷攪拌下加熱至80°C并保溫30min，對比例的試驗條件見表I，其試驗結果見表2。表I對比例的試驗條件
權利要求
1.一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)取小牛全血，加入I.5^2倍全血量的純化水，不斷攪拌，并加熱至體系溫度達到80°C，對小牛血進行滅活； (2)滅活后的小牛血降至室溫，并向體系中加入80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置，分離全部上清液； (3)合并步驟(2)兩次得到的上清液，并對上清液進行減壓濃縮，濃縮液倒入澄清過濾器進行過濾； (4)濾液用稀鹽酸調pH呈弱酸性，然后向弱酸性濾液中加入針用活性炭，進行脫色； (5)依次使用鈦棒過濾、微孔濾膜過濾、富士濾器超濾，即得小牛血去蛋白提取物。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，加入體積為1.5 2倍全血量的純化水，不斷攪拌，并加熱小牛全血與水的混合物體系達到80°C，并保溫30min、0min,以通過加熱對小牛血進行滅活。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，向小牛全血與水的混合物體系中加入體積為小牛全血量4飛倍的80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置36h，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入體積為小牛全血量4飛倍的80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置12h，分離全部上清液。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，對上清液采用單效濃縮器進行減壓濃縮，真空壓力控制在O. 06Mpa O. 08Mpa,蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，上清液濃縮溫度控制在40°C 50°C，濃縮液與上清液的體積比控制在1:200 250，濃縮液倒入澄清過濾器進行過濾。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，濾液采用質量濃度為9.5^10. 5%的稀鹽酸調節pH至4. O 5. O之間，按濾液體積O. 5 °Γθ. 9%的量加入針劑用活性炭，攪拌，加熱至80°C并保溫30min。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，先用鈦棒濾炭后，再用裝有O. 22 μ m微孔濾膜的平板濾器過濾，上述濾液再用富士濾器超濾，即得小牛血去蛋白提取物。
7.一種小牛血去蛋白提取物，其特征在于，所述小牛血去蛋白提取物通過權利要求1-6任一項所述的方法制得。
8.—種權利要求7所述小牛血去蛋白提取物在注射液、凍干粉針、膠囊劑、外用制劑或眼用制劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種小牛血去蛋白提取物及其制備方法，該方法包括取小牛全血，加入1.5~2倍全血量的純化水，不斷攪拌，并加熱至體系溫度達到80℃，對小牛血進行滅活；滅活后的小牛血降至室溫，并向體系中加入80%～90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置36小時，分離1/3~1/2上清液，母液再次加入80%～90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置12小時，分離全部上清液；合并兩次得到的上清液，并對上清液進行減壓濃縮，濃縮液倒入澄清過濾器進行過濾；濾液用稀鹽酸調pH呈弱酸性，然后向弱酸性濾液中加入針用活性炭進行脫色；依次使用鈦棒過濾、微孔濾膜過濾、富士濾器超濾，即得小牛血去蛋白提取物。本發明的方法具有操作簡便，便于工藝化大生產，條件溫和的特點。
文檔編號A61P17/02GK102846664SQ20121030511
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者鄧霞飛, 劉紅華, 李青, 盧山, 陸毅, 高光田 申請人:武漢人福藥業有限責任公司