單鏈胰島素的制作方法

專利名稱：單鏈胰島素的制作方法
技術領域：
本發明涉及單鏈胰島素，它具有胰島素的活性，可以用于糖尿病的治療。單鏈胰島素具有高的物理穩定性以及低的原纖維形成傾向，在中性PH下是可溶的。本發明還涉及了編碼單鏈胰島素的DNA序列、它們制備的方法以及含有單鏈胰島素的藥物組合物。
背景技術：
胰島素是由胰腺的β -細胞分泌的多肽激素，由兩個多肽鏈A和B組成，它們由鏈間二硫橋連接起來。此外，A鏈具有一個鏈內二硫橋。 該激素作為單鏈前體胰島素原(前胰島素原)合成，它由含24個氨基酸的前肽以及其后的含86個氨基酸的胰島素原按照以下的構型組成』i_B_Arg Arg-C-Lys Arg-A,其中C是31個氨基酸的連接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是用于從A和B鏈切割連接肽形成雙鏈胰島素分子的切割位點。胰島素在維持正常的代謝調控中是必需的。胰島素的兩條鏈結構使胰島素可以呈現多種構象，一些發現已經表明胰島素具有發生相當大的構象改變傾向，對這種改變能力的限制顯著降低了胰島素受體與配基的親和性。與天然胰島素相比，胰島素原對胰島素受體的親和性降低了 100倍。封閉胰島素中的氨基酸殘基Al導致與受體結合較弱，這與“Α鏈的自由N端和B鏈的自由C端對于與胰島素受體的結合是非常重要的”這個法則一致。胰島素分子的內在物理和化學穩定性是糖尿病的胰島素療法的基本條件。這些基本性質對于胰島素的形成和可應用的胰島素給藥方法，以及藥物制劑的保存期和儲存條件是重要的。在胰島素的給藥中溶液的使用使分子暴露于一些因素的組合中，例如升高的溫度、可變的氣液固界面以及剪切力，這些可以導致不可逆的構象改變例如原纖維形成。這對于滴注泵(無論是在體外攜帶還是移植的)中的胰島素溶液是有重要意義的，滴注泵使胰島素暴露在這些因子的組合中以及由于泵的長時間移動產生的剪切力中。因此在使用滴注泵作為胰島素的給藥系統時原纖維形成特別成為人們關注的問題。此外，胰島素的溶解性受到多種因子的影響，在PH范圍從4. 2到6. 6溶解性顯著降低。pH沉淀區一般限制了制劑，但是在開發某些類似物的制劑中也被有意使用。因此，胰島素的穩定性和溶解性性質對于目前的胰島素治療是重要的根本方面。本發明通過在B和A鏈之間引入C肽降低分子彈性，同時降低原纖維形成傾向并且限制或者改變PH沉淀區，以提供穩定的單鏈胰島素類似物而解決這些問題。具有胰島素活性的單鏈胰島素在EP 1，193，272中公開。這些單鏈胰島素具有
5-18個氨基酸的修飾的C肽，據報道它們具有最多42%的胰島素活性。EP 1，193，272公開了下列連接 B 30 和 A21 的修飾的 C 肽=Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg (SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :5)，Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :6)，Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 8), Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9)，和 Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO :10)。EP 741，188 公開的單鏈胰島素具有 10-14 個氨基酸殘基的修飾的C肽，并且具有14到34%胰島素活性且具有以下連接肽Gln-PiO-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO 11)和 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr (SEQ ID N0:12)。WO 95/16708 公開了具有 1-15 個氨基酸殘基的連接肽且連接肽中C末端氨基酸殘基非Lys或Arg的單鏈胰島素。WO 95/16708公開了以下的 C妝序列 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr (SEQ ID NO 13)和Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Ala-Ala-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQ ID NO: 14)。據報道這些單鏈胰島素具有胰島素活性，但是與IGF-I受體也具有相當高的親和性。本發明的目的是提供與已知化合物相比具有改良性質的單鏈胰島素，涉及到胰島素的活性、物理穩定性和溶解性以及藥代動力學例如延長或者迅速 作用特征。本發明的另一個目的是提供單鏈胰島素的制備方法以及含有這些化合物的藥物組合物。發明概述本發明一方面涉及了具有生物胰島素活性并且包含由連接肽連接的人胰島素或者其類似物或衍生物的B和A鏈的單鏈胰島素，其中的連接肽具有5-11個氨基酸殘基并且不含有兩個相鄰的堿性氨基酸殘基并且其中單鏈胰島素對人胰島素受體的親和性是人胰島素的至少大約20% (如果單鏈胰島素分子沒有被酰化化學修飾的話)。在另一個方面中，本發明涉及具有生物胰島素活性并且包含由連接肽連接的人胰島素或者其類似物或衍生物的B和A鏈的單鏈胰島素，其中的連接肽具有5-11個氨基酸殘基，前提是如果連接肽含有兩個相鄰的堿性氨基酸殘基則B和/或A鏈中的至少一個天然氨基酸殘基被另一個可編碼的氨基酸殘基替代，或者A鏈、B鏈或者連接肽中的至少一個賴氨酸殘基已經被酰化化學修飾，或者連接肽不是以下的序列 Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 6),Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO :8)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9),或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。在另一個方面中本發明涉及具有生物胰島素活性并且包含由連接肽連接的人胰島素或者其類似物或衍生物的B和A鏈的單鏈胰島素，其中的連接肽具有5-11個氨基酸殘基，前提是Pl在大約6. 5以上的該單鏈胰島素與人胰島素的A和B鏈相比在A和/或B鏈中包含至少一個氨基酸殘基替代和/或缺失，或者A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經被酰化化學修飾。在另一個方面中本發明涉及具有生物胰島素活性并且包含由連接肽連接的人胰島素或者其類似物或衍生物的B和A鏈的單鏈胰島素，其中的連接肽具有5-14，5-11，6-10，
6-8，6-7，7-9或者7-8個氨基酸殘基，且其中A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經被酰化化學修飾。在一個實施方案中，單鏈胰島素在單鏈胰島素分子中至少一個賴氨酸基團上被酰化。在另一個實施方案中，B29Lys被酰化。在另一個實施方案中，在單鏈胰島素分子中插入的賴氨酸被酰化或者BlN-末端氨基酸殘基被酰化。—方面單鏈胰島素被具有6-24,6-20,6-18或者6_14個碳原子的脂肪酸酰化。另一方面本發明涉及在中性pH下可溶、pi低于大約6. 5的單鏈胰島素。另一方面,單鏈胰島素的pi從大約4. 5到低于大約6. 5。另一方面本發明涉及了單鏈胰島素，其中至少一個賴氨酸殘基被酰化修飾。另一方面，具有未化學修飾A和B鏈的單鏈胰島素與人胰島素受體的親和性是人胰島素的至少30%。另一方面，單鏈胰島素在連接肽中最多含有兩個堿性氨基酸·殘基，它們由至少一個非堿性氨基酸殘基隔開。本發明的另一個方面中，單鏈胰島素與天然人胰島素的A和B鏈相比，在A或B鏈中含有至少一個額外的堿性氨基酸。優選通過替代B鏈的C末端或者A鏈的N末端中的一個天然氨基酸殘基弓I入堿性氨基酸，在本發明的一個實施方案中B27位置的殘基被Arg替代。在本發明的另一個方面中單鏈胰島素在A鏈的A21位置具有的氨基酸殘基與天然的氨基酸殘基Asn不同。因此位置A21中的Asn可以被除Cys外的任何其他可編碼氨基酸殘基替代。在一個實施方案中位置A21的氨基酸殘基可以選自由Ala，Gln，Glu，Gly，His，He, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr 或者 Val 組成，特別是由 Gly, Ala, Ser,和 Thr 組成的組。在另一個實施方案中A21是Gly。在本發明的一個實施方案中單鏈胰島素在連接肽中含有至少一個堿性氨基酸殘基并且在位置A21上是Gly。在本發明的另一個實施方案中單鏈胰島素在連接肽中含有兩個堿性氨基酸殘基并且在位置A21上是Gly。在另一個實施方案中單鏈胰島素具有的連接肽有6-10，6-9，6-8，或6_7個氨基酸殘基。在另一個實施方案中單鏈胰島素具有的連接肽有7-10，7-9或7-8個氨基酸殘基。在另一個實施方案中連接肽在相對于A鏈中第一個氨基酸殘基(Al)的倒數第二個位置上具有Gly。在另一個實施方案中連接肽包含選自AGRGSGK(SEQ ID NO :15) ；AGLGSGK(SEQ IDNO 33) ；AGMGSGK(SEQ ID NO :45) ；ASWGSGK(SEQ ID NO :48) ；TGLGSGQ(SEQ ID NO :22)；TGLGRGK(SEQ ID NO :23) ；TGLGSGK(SEQ ID NO :21) ；HGLYSGK(SEQ ID NO :50) ；KGLGSGQ(SEQID NO 51) ；VGLMSGK(SEQ ID NO :56) ；VGLSSGQ(SEQ ID NO :27) ；VGLYSGK(SEQ ID NO :28)；VGLSSGK(SEQ ID NO :30) ；VGMSSGK(SEQ ID NO :65) ；VffSSSGK(SEQ ID NO :76) ；VGSSSGK(SEQID NO 16)和 VGMSSGK (SEQ ID NO :106)的序列。在另一個實施方案中單鏈胰島素具有式B (1_26) _X「X2_X3_X4_A (1_21)其中X1 是 Thr, Lys 或 Arg, X2 是 Pro, Lys 或 Asp, X3 是 Lys, Pro 或 Glu, X4 是 6-11個氨基酸的肽序列，B (1-26)是由人胰島素B鏈的從B鏈N末端開始的前26個氨基酸殘基組成的肽鏈或者其類似物或衍生物，A(l-21)是天然胰島素的A鏈或者其類似物或者衍生物，其中X4不含有兩個相鄰的堿性氨基酸殘基且其中的單鏈胰島素對人胰島素受體的親和性是人胰島素的至少大約20%，如果單鏈胰島素分子沒有被酰化化學修飾的話。
在另一個實施方案中單鏈胰島素具有式B (1_26) -XfX2-X3-X4-A (1_21)其中X1 是 Thr, Ly s 或 Arg, X2 是 Pro, Ly s 或 Asp, X3 是 Ly s, Pro 或 Glu, X4 是 6-11 個氨基酸的肽序列，B(l-26)是由人胰島素B鏈的從B鏈N端開始數前26個氨基酸殘基組成的肽鏈或者其類似物或衍生物，A(l-21)是天然胰島素的A鏈或者其類似物或者衍生物，前提是如果X4含有兩個相鄰的堿性氨基酸殘基則B和/或A鏈中的至少一個天然氨基酸殘基被另一個可編碼氨基酸殘基替代或者A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經通過酰化被化學修飾或者X4不是下列序列中的一個Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys_Arg(SEQ ID NO I),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2),Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO :4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :6)，Gly-Gly-T yr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :8)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9),或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。在另一個實施方案中單鏈胰島素具有式B (1_26) _X「X2_X3_X4_A (1_21)其中X1 是 Thr, Lys 或 Arg, X2 是 Pro, Lys 或 Asp, X3 是 Lys, Pro 或 Glu, X4 是 6-11個氨基酸的肽序列，B (1-26)是由人胰島素B鏈的從B鏈N端開始的前26個氨基酸殘基組成的肽鏈或者其類似物或衍生物，A(l-21)是天然胰島素的A鏈或者其類似物或者衍生物，前提是Pl在大約6. 5以上的單鏈胰島素與人胰島素的A和B鏈相比在A和/或B鏈中包含至少一個氨基酸殘基替代和/或缺失，或者A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經被酰化化學修飾。在另一個實施方案中單鏈胰島素具有式B (1_26) -XfX2-X3-X4-A (1_21)其中X1 是 Thr, Lys 或 Arg, X2 是 Pro, Lys 或 Asp, X3 是 Lys, Pro 或 Glu, X4 是 5-14,5-11，6-10，6-8，6-7，7-9或7-8個氨基酸的肽序列，B (I-26)是由人胰島素B鏈的從B鏈N端開始的前26個氨基酸殘基組成的肽鏈或者其類似物或衍生物，且A(l-21)是天然胰島素的A鏈或者其類似物或者衍生物，其中A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經通過酰化被化學修飾。在其中一個方面中，X1是Thr，X2是Pro，且X3是Lys。在另一個實施方案中，X4是具有下式Xa-Xb-Xe-Xd-Xe-Xf-Xg (SEQ ID NO :129)的肽序列，其中Xa 選自由 L，R，T，A，H，Q，G，S 和 V 組成的組；Xb選自由W，G，S，A，H，R和T組成的組；X。選自由 L，Y，M，H，R，T，Q，K，V, S，A，G 和 P 組成的組；Xd選自由R，A，Y，M，S，N，H和G組成的組；Xe 選自由 S，R，A，T，K P，N M，H，Q，V 和 G 組成的組；Xf選自由G和A組成的組；且Xg 選自由 K，R，P，H，F，T，I，Q，W和 A 組成的組
在另一個實施方案中父3選自由1^，1 ，1'，八，!1和￥組成的組；Xb選自由W，G，S，A，H，R和T組成的組；X。選自由 L，Y，M，H，R，T，Q，K，V, S，A，G 和 P 組成的組；Xd選自由R，A，Y，M，S，N，H和G組成的組；Xe選自由S，R，A，T，K P和N組成的組；Xf是G;且Xg選自由K，R，Q和P組成的組；在另一個實施方案中Xa選自由T，A V，K組成的組；Xb 是 G ;Xc選自由L，Y，M，H，R K，W組成的組；Xd 是 G ;Xe選自由S，K組成的組；父{是6;且Xg選自由K，R，Q組成的組在另一個實施方案中X4 具有序列 X5-G-X6-G-X7-G-X8(SEQ ID NO :130)其中X5 選自由 Val, Leu, Arg, Thr, Ala, His, Gin, Gly 或 Ser 組成的組，X6 選自由 Leu, Tyr, Met, His, Arg, Thr, Gin, Lys, Val, Ser, Ala, Gly, Pro 組成的組，X7 選自由 Ser, Arg, Ala, Thr, Lys, Pro, Asn, Met, His, Gin, Val, Gly 組成的組，且X8 是 Lys 或 Arg。在另一個實施方案中X5選自由Val, Leu, Arg, Thr, Ala和His組成的組，X6選自由Leu, Tyr, Met和His組成的組，X7 選自由 Ser, Arg, Ala, Thr, Lys, Pro 和 Asn 組成的組，且X8 是 Lys 或 Arg。在一個實施方案中X4包含序列SGK。在另一個實施方案中X4包含序列GSGK(SEQID NO :131)。在另一個實施方案中X4包含序列SSSGK (SEQ ID NO :132)。在一個實施方案中在位置BI, B3, BIO, B22, B27, B28, B29, A8，A15，A18 和 A21 的
天然氨基酸殘基中的至少一個被另一個氨基酸殘基替代。在另一個實施方案中單鏈胰島素是desBl，desB25, desB27, desB28或desB29胰島素類似物。在另一個實施方案中X4包含序列TRXXXGR(SEQ ID NO :112)，其中X是任何氨基酸。在另一個方面本發明涉及單鏈胰島素，其中A鏈和B鏈通過含有6-11個氨基酸的肽序列相連，前提是該肽序列不是Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1), Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :6)，Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO 8), Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO :9),或者 Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。在另一個實施方案中連接肽不是SANNTK (SEQ ID NO : 136)，SPNTTK (SEQ ID NO:137)，SSNTTK (SEQ ID NO :138)或者 SRNTTK (SEQ ID NO :139)。本發明還涉及編碼所要求的單鏈胰島素的多核苷酸序列。另一方面本發明涉及含有這種多核苷酸序列的載體以及含有這種多聚核苷酸序列或者載體的宿主細胞。另一方面本發明涉及在宿主細胞中產生單鏈胰島素的方法，所述方法包括(i)在適宜所述單鏈胰島素表達的條件下培養包含編碼單鏈胰島素的多核苷酸序列的宿主細胞； 以及(ii)從培養基中分離單鏈胰島素。在本發明的一個實施方案中宿主細胞是酵母宿主細胞且在另一個實施方案中宿主細胞選自糖酵母屬(Saccharomyces)。在另一個實施方案中宿主細胞選自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)種。在另一個實施方案中本發明涉及在單鏈胰島素分子中至少一個賴氨酸殘基被酰化的方法。在另一個實施方案中本發明涉及單鏈胰島素作為藥物用于糖尿病的治療的用途。另一方面本發明涉及包含本發明單鏈胰島素以及適宜佐劑和添加劑例如適于穩定、保存或者維持等滲的一種或多種物質(例如鋅離子、苯酚、甲苯酚、對羥基苯甲酸酯、氯化鈉、甘油或者甘露醇)的藥物制劑。本發明制劑的鋅含量可以是每個胰島素六聚體O到大約6個鋅原子。藥物制劑的pH可以在大約4到大約8. 5之間,在大約4到大約5之間，在大約6. 5到大約7. 5之間。另一方面本發明涉及包含單鏈胰島素以及至少一種其他藥物例如迅速作用或者延長作用的胰島素類似物以及GLP-1，GLP-2和exendin及其類似物和衍生物的藥物組合物。根據本發明的單鏈胰島素還可以與迅速作用或者延長作用的胰島素類似物以及GLP-1，GLP-2和exendin及其類似物和衍生物或者口服抗糖尿病藥例如噻唑烷二酮、二甲雙胍(metformin)以及其他用于口服治療的其他II型糖尿病藥物制劑一起在組合治療中使用。在另一個方面中本發明涉及單鏈胰島素在制備用于降低哺乳動物中血糖水平特別用于治療糖尿病的藥物制劑中的用途。在另一個實施方案中本發明涉及通過向需要進行以下治療的患者施用治療活性劑量的根據本發明的單鏈胰島素，在哺乳動物中降低血糖水平的方法。附圖
簡述圖I顯示根據本發明的單鏈胰島素在正常Wistar大鼠中的血糖降低與人胰島素的效果進行比較。HI是人胰島素，SCI是單鏈胰島素，圖2顯示在豬中s. c.給藥后單鏈胰島素的消失以及圖3顯示在豬中s. c.給藥后另一個單鏈胰島素的消失。發明詳述根據本發明的單鏈胰島素具有胰島素生物活性。如果單鏈胰島素分子沒有被酰化化學修飾，它們還與胰島素受體具有人胰島素的至少20%的親和性。而且它們具有IGF-I受體親和性，與人胰島素的該親和性相似或者更低。沒有被酰化化學修飾的單鏈胰島素與胰島素受體具有人胰島素該親和性的至少20%。根據本發明的單鏈胰島素的特征還在于具有高度的物理穩定性。與人胰島素相比具有一個額外正電荷且pi低于大約6. 5的單鏈胰島素在中性pH下可溶且具有如人胰島素的作用特征但是具有提高的物理穩定性。如果向胰島素分子引入與人胰島素相比額外的正電荷則Pl會隨著每加入的一個正電荷升高一。與人胰島素相比具有兩個額外正電荷則單鏈胰島素會獲得延長的特征。也可以通過在一個或者更多Lys殘基中或者在N末端的BI氨基酸殘基中引入酰基基團使單鏈胰島素延長作用。酰化的單鏈胰島素在中性PH下可溶并且可以與迅速作用的雙鏈胰島素例如NovoRapid混合。單鏈胰島素可以選擇性地在例如B29上酰化。或者在B鏈的C末端、連接肽序列或者A鏈的N末端的一個或者更多天然氨基酸殘基可以被Lys殘基替代，然后可以用如美國專利No. 6500645中公開的眾所周知的方法將Lys殘基酰化。本發明的具有提高穩定性的單鏈胰島素還可以與美國專利No. 6500645和5，750，497中描述的可溶的長效胰島素相混合。產生的組合保持了兩相性藥物動力學特征。而且單鏈胰島素可以在位置BlO和/或B28上具有氨基酸替代，降低胰島素自身聚合。本發明單鏈胰島素中的連接肽最長可以是14個氨基酸長。但是連接肽通常的長度是 6-10 或 7-10，7-9 或 7-8。在一個實施方案中連接肽具有基序VGSSSGX(SEQ ID NO 122) VGSSSXK(SEQ IDNO :123) ； VGSSXGK (SEQ ID NO :124) VGSXSGK(SEQ ID NO :125) ；VGXSSGK(SEQ ID NO:126) ；VXSSSGK (SEQ ID NO :1127)和 XGSSSGK(SEQ ID NO : 128)，其中 X 是任何可編碼的氨
基酸殘基。下表表示了 X的選擇含義。
權利要求
1.具有生物胰島素活性并且包含由連接肽連接的人胰島素B和A鏈或者其類似物或衍生物的單鏈胰島素，其中的連接肽具有5-11個氨基酸殘基并且不含有兩個相鄰的堿性氨基酸殘基，并且如果單鏈胰島素分子沒有被酰化化學修飾則其中單鏈胰島素對人胰島素受體的親和性是人胰島素對人胰島素受體的親和性的至少大約20%。
2.具有生物胰島素活性并且包含由連接肽連接的人胰島素的B和A鏈或者其類似物或衍生物的單鏈胰島素，其中的連接肽具有5-11個氨基酸殘基，前提是如果連接肽含有兩個相鄰的堿性氨基酸殘基則B和/或A鏈中的至少一個天然氨基酸殘基被另一個可編碼的氨基酸殘基替代，或者A鏈、B鏈或者連接肽中的至少一個賴氨酸殘基已經被酰化化學修飾，或者連接肽不是以下序列之一 Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 6),Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-A sp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO :8)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9),或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。
3.具有生物胰島素活性并且包含由連接肽連接的人胰島素B和A鏈或者其類似物或衍生物的單鏈胰島素，其中的連接肽具有5-11個氨基酸殘基，前提是P I在大約6. 5以上的單鏈胰島素與人胰島素的A和B鏈相比在A和/或B鏈中包含至少一個氨基酸殘基替代和/或缺失，或者A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經被酰化化學修飾。
4.具有生物胰島素活性并且包含由連接肽連接的人胰島素B和A鏈或者其類似物或衍生物的單鏈胰島素，其中的連接肽具有5-14，5-11，6-10，6-8，6-7，7-9或者7_8個氨基酸殘基，且其中A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經被酰化化學修飾。
5.根據權利要求1-3中任何一項的單鏈胰島素，該單鏈胰島素分子中至少一個賴氨酸基團被酰化。
6.根據權利要求5的單鏈胰島素，其在B29被酰化。
7.根據權利要求6的單鏈胰島素，其被具有6到24，6-20，6-18或6_14個碳原子的脂肪酸酰化。
8.根據權利要求I的單鏈胰島素，其在中性PH下可溶并且pi低于大約6.5。
9.根據權利要求8的單鏈胰島素，其pi為大約4.5到低于大約6. 5。
10.根據權利要求I的單鏈胰島素，其與人胰島素受體的親和性是人胰島素對人胰島素受體親和性的至少30%。
11.根據權利要求1-10任何一項的單鏈胰島素，其中的連接肽具有7-10，7-9或7-8個氣基酸殘基。
12.根據權利要求1-10中任何一項的單鏈胰島素，其中的連接肽包含選自下列的序列AGRGSGK(SEQ ID NO :15) ；AGLGSGK(SEQ ID NO :33) ；AGMGSGK(SEQ ID NO :45)；ASffGSGK(SEQ ID NO :48) ；TGLGSGQ(SEQ ID NO :22) ；TGLGRGK(SEQ ID NO :23) ；TGLGSGK(SEQID NO 21) ；HGLYSGK(SEQ ID NO :50) ；KGLGSGQ(SEQ ID NO :51) ；VGLMSGK(SEQ ID NO :56)；VGLSSGQ(SEQ ID NO :27) ；VGLYSGK(SEQ ID NO :28) ；VGLSSGK(SEQ ID NO :30) ；VGMSSGK(SEQID NO 65) ； VffSSSGK(SEQ ID NO :76) ；VGSSSGK(SEQ ID NO : 16)和 VGMSSGK(SEQ ID NO:106)。
13.根據權利要求I的單鏈胰島素，其具有式 B(HG)-XfX2-X3-X4-A(Hl)，其中 X1 是 Thr> Lys 或 Ar g, X2 是 Pro> Lys 或 Asp, X3 是 Lys、Pro 或 Glu, X4 是 6-11 個氨基酸殘基的肽序列，B (1-26)是由人胰島素B鏈的從B鏈N末端數起的前26個氨基酸殘基組成的肽鏈或者其類似物或衍生物，A(l-21)是天然胰島素的A鏈或者其類似物或者衍生物，其中X4不含有兩個相鄰的堿性氨基酸殘基，且如果單鏈胰島素分子沒有被酰化化學修飾，其中的單鏈胰島素對人胰島素受體的親和性是人胰島素對人胰島素受體的親和性的至少大約20%。
14.根據權利要求2的單鏈胰島素，其具有式 B (1-26) -X1-X2-X3-X4-A (1-21)的單鏈胰島素， 其中 X1 是 Thr、Lys 或 Arg, X2 是 Pro、Lys 或 Asp, X3 是 Lys、Pro 或 Glu, X4 是6-11個氨基酸殘基的肽序列，B(1-26)是由人胰島素B鏈的從B鏈的N末端數起的前26個氨基酸殘基組成的肽鏈或者其類似物或衍生物，A(l-21)是天然胰島素的A鏈或者其類似物或者衍生物，前提是如果X4含有兩個相鄰的堿性氨基酸殘基則B和/或A鏈中的至少一個天然氨基酸殘基被另一個可編碼氨基酸殘基替代，或者A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經通過酰化被化學修飾，或者 X4 不是下列序列中的一個Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 6),Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO 8), Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ IDNO :9)，或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。
15.根據權利要求3的單鏈胰島素，其具有式 B(HG)-XfX2-X3-X4-A(Hl)，其中 X1 是 Thr> Lys 或 Arg, X2 是 Pro> Lys 或 Asp, X3 是 Lys> Pro 或 Glu, X4 是 6-11 個氨基酸殘基的肽序列，B (1-26)是由人胰島素B鏈的從B鏈N末端數起的前26個氨基酸殘基組成的肽鏈或者其類似物或衍生物，A(l-21)是天然胰島素的A鏈或者其類似物或者衍生物，前提是Pl在大約6. 5以上的單鏈胰島素與人胰島素的A和B鏈相比在A和/或B鏈中包含至少一個氨基酸殘基替代和/或缺失，或者A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經被酰化化學修飾。
16.根據權利要求4的單鏈胰島素，其具有式 B(HG)-XfX2-X3-X4-A(Hl)，其中 X1 是 Thr> Lys 或 Arg, X2 是 Pro> Lys 或 Asp, X3 是 Lys> Pro 或 Glu, X4 是 5-14,5-11，6-10，6-8，6-7，7-9或7_8個氨基酸殘基的肽序列，B (1-26)是由人胰島素B鏈的從B鏈N末端數起的前26個氨基酸殘基組成的肽鏈或者其類似物或衍生物，A(l-21)是天然胰島素的A鏈或者其類似物或者衍生物，其中A鏈、B鏈或者連接肽中至少一個賴氨酸殘基已經通過酰化被化學修飾。
17.根據權利要求1-16中任何一項的單鏈胰島素，其中位置A21的氨基酸殘基被除Cys外的另一個氨基酸殘基替代。
18.根據權利要求13-16的單鏈胰島素，其中X4是具有下式Xa-Xb-Xe-Xd-Xe-Xf-Xg(SEQID NO :129)的肽序列，其中 Xa選自由L，R，T，A，H，Q，G，S和V組成的組； Xb選自由W，G，S，A，H，R和T組成的組； Xc 選自由 L，Y，M，H，R，T，Q，K，V, S，A，G 和 P 組成的組； Xd選自由R，A，Y，M，S，N，H和G組成的組； Xe選自由S，R，A，T，K，P，N M，H，Q，V和G組成的組； Xf選自由G和A組成的組；且 Xg選自由K，R，P，H，F，T，I，Q，W和A組成的組。
19.根據權利要求13-18中任何一項的單鏈胰島素，其中X4包含序列SGK。
20.根據權利要求13-18中任何一項的單鏈胰島素，其中X4包含序列GSGK(SEQID NO:131)。
21.根據權利要求13-18中任何一項的單鏈胰島素，其中X4包含序列SSSGK(SEQIDNO :132)。
22.根據權利要求1-21中任何一項的單鏈胰島素，其中位置B1、B3、B10、B22、B28、B29、A8、A15、A18和A21中的至少一個天然氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基替代。
23.根據權利要求1-21中任何一項的單鏈胰島素，其是desBl，desB27,desB28或desB29胰島素類似物。
24.編碼根據權利要求1-23的任何單鏈胰島素的多核苷酸序列。
25.含有根據權利要求24的多核苷酸序列的表達載體。
26.含有根據權利要求25的表達載體的轉化的宿主細胞。
27.包含生物活性量的根據權利要求1-23中任何一項的單鏈胰島素的藥物制劑。
28.藥物制劑，它包含生物活性量的根據權利要求1-23中任何一項的單鏈胰島素以及另外的生物活性化合物。
29.根據權利要求28的藥物制劑，其中另外的生物活性化合物選自由迅速作用胰島素類似物、延長作用胰島素類似物、GLP-U GLP-2以及exendin或其類似物或衍生物組成的組。
30.根據權利要求29的藥物制劑，其pH為4-10.5。
31.根據權利要求30的藥物制劑，pH為4-8.5。
32.降低哺乳動物中血糖水平的方法，其通過向需要進行該治療的患者施用治療活性劑量的根據權利要求27-31任何一項的藥物制劑。
33.根據權利要求1-23的任何一項的單鏈胰島素作為藥物的用途。
34.根據權利要求1-23的任何一項的單鏈胰島素在制備用于治療糖尿病的藥物制劑中的用途。
全文摘要
本發明涉及具有胰島素活性的單鏈胰島素，其包含由5-11個氨基酸的連接肽連接的B和A鏈或修飾的B和A鏈。該單鏈胰島素具有生物胰島素活性和與人胰島素的IGF-1相比類似或者更低的IGF-1受體親和性以及高的物理穩定性。單鏈胰島素在連接肽中可以含有至少一個堿性氨基酸殘基。單鏈胰島素還可以在一個或者多個Lys殘基中被酰化。
文檔編號A61K38/00GK102816228SQ20121030424
公開日2012年12月12日 申請日期2004年12月3日 優先權日2003年12月3日
發明者T·B·克耶爾德森, A·S·安德森, M·施雷恩, A·R·索倫森, P·馬德森 申請人:諾和諾德公司