專利名稱：一種治療仔豬白痢的中藥復方連翁止痢散及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明 屬于獸藥領域，涉及一種治療仔豬白痢的中藥復方制劑，具體來說，涉及一種連翁止痢散及其制備方法和應用。
背景技術：
仔豬白痢為仔豬外感暑濕之邪，濕熱郁結腸內，胃腸氣血阻滯，正氣與暑濕熱毒相搏，腸道粘膜及腸壁脈絡受損，化為膿血而導致的濕熱痢，因此當以清熱燥濕，涼血解毒止痢之法進行治療，邪毒被祛，則諸證可解。現代藥理學研究表明，黃連、白頭翁、老鸛草和大黃炭的具有抗炎、抗菌和調節免疫功能的作用。仔豬白痢是由大腸桿菌感染導致的腹瀉，該病的發生除與大腸桿菌在腸道內定居和產生腸毒素的作用有關外，還與由于年齡、免疫狀態、生理機能、飼養條件等多種誘因造成的消化機能紊亂有關。在各種不利因素的影響下，仔豬消化道內食物分解不全的產物或由于發酵產生的低級脂肪酸，刺激腸蠕動加快而引起瀉下。病豬消化機能紊亂使腸道菌群失調，有害細菌大量繁殖，產生更多的有毒產物，如細菌內毒素和腸毒素。這些有毒產物及食物分解不全的產物刺激腸粘膜發生炎癥過程，可促進液體從腸壁向腸腔滲出，力口重了瀉下。食糜中的大量脂肪酸被向后推移，與大腸腔內的堿性離子(鈉、鈣、鉀、鎂)結合，成為白色脂肪酸皂化物而使糞便變成灰白色，在臨床上即表現為白痢。現有中藥技術在治療仔豬白痢方面缺乏系統性，有些因療效不確切而中斷使用，有些使用價格昂貴的藥物，本發明在現有技術的基礎上，將上述中藥合用，制備成一種稱之為“連翁止痢散”的純中藥制劑，各藥材相互配合，發揮協同增效作用，使用方便、作用機理明確、毒副作用小、治療仔豬白痢不影響人類健康。
發明內容
根據中藥理論，“連翁止痢散”是由黃連、白頭翁、大黃炭、老鸛草四味中藥經粉碎加工制備而成的散劑，具有清熱燥濕，解毒止痢的功效。方用味苦性寒之黃連為君，清熱燥濕，解毒止痢；白頭翁為臣，助黃連止痢；老鸛草大為佐，使黃連、白頭翁解毒止痢倍增；黃炭為使，既可協君藥黃連解毒，又能取其炒炭之收斂功效以助君臣止瀉；四味相配，互相協同，優勢互補，共收清熱燥濕，解毒止痢之功。為提高藥材利用率，并結合市場的需求，通過體外溶出度的比較試驗、與飼料混合后的均勻度比較試驗，評價了將連翁止痢散制成普通粉體和極細粉的優缺點，為連翁止痢散制劑工藝提供試驗依據。本發明采用下述技術方案予以實現。一種治療仔豬白痢的中藥組合物，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連100-300g，白頭翁 100-300g，老鸛草 100-300g，大黃炭 100_300g。優選的本發明的中藥組合物，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連200g，白頭翁200g，老鸛草200g，大黃炭200g。本發明還包括，本發明的中藥組合物的制備方法，該方法包括，將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎，混勻的步驟。優選的制備方法是將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎成極細粉，過篩，混勻，即得。特別優選的制備方法是將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎成極細粉，必要時加入輔料，混勻，制備成散劑。所述步驟如下(I)黃連、白頭翁、老鸛草、大黃炭的粗粉碎將水分含量彡12. 0%的藥材按比例粉碎(2)細粉碎將粗粉的混合均勻加入超微粉碎機組，使藥材粉碎至粒度>200目，制成超微粉。(3)過篩將細粉碎后的藥材過200目篩。(4)混合將藥材混合均勻，即得連翁止痢散。本發明的連翁止痢散的制備方法包括藥材的粉碎、過篩、過濾、混勻等步驟，本發明可以有效的提聞有效成分的提取得率，提聞生物利用度，減少有效成分的損失，該制備方法適合于連翁止痢散的工業化生產。
本發明連翁止痢散用于治療仔豬白痢，連翁止痢散按照科學的處方組成和工藝制備，在較低溫度的環境下通過粉碎過200目篩制備而得，降低了粗纖維等對動物消化功能的不良影響，同時在一定程度上降低了有效成分的損耗。由于粉碎粒度達到75 左右，使藥材中的有效成分充分暴露，有利于豬的消化、吸收，大大提高了藥物的生物利用度，既節約了中藥資源，又可適當提高藥效。連翁止痢散在使用時采用拌料飼喂，也可混水灌服，使用方便的特性有利于該藥的推廣應用。臨床試驗結果顯示，本發明的連翁止痢散用于治療仔豬白痢效果良好。其用法用量為一次量，每Ikg體重，仔豬0. 25g，一日2次，連用3日。 本發明還包括，本發明的中藥組合物的檢測方法，包括，黃連的薄層鑒別，大黃炭的薄層鑒別，白頭翁藥材的薄層鑒別，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別。其中黃連的薄層鑒別，步驟如下( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘渣加甲醇IOml溶解，作為供試品溶液；( 2 )對照品溶液的制備取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液。(3)對照藥材溶液的制備取黃連對照藥材粉末0. 05g，加甲醇10ml，同法制成對照藥材溶液；(4)陰性對照溶液的制備取缺黃連陰性對照品0. 3g,同法制成陰性對照溶液；(5)薄層鑒別展開劑為正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)，點樣量I iil，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。其中，大黃的薄層鑒別，步驟如下( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時，濾過，蒸干，殘渣加水IOOml使溶解，再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷2ml使溶解，作為供試品溶液，(2)對照藥材溶液的制備取大黃對照藥材0. Ig,同法制成對照藥材溶液，(3)陰性對照溶液的制備
稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對照品0. 26g,同法制成陰性對照溶液，(4)薄層鑒別以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，點樣量4 Ul，展開，展距5cm，展畢，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。其中，白頭翁藥材的薄層鑒別，步驟如下供試品溶液的制備取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過。殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時間20分鐘。濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液；對照藥材溶液的制備另取白頭翁藥材lg，同法制備對照藥材溶液；陰性對照溶液的制備取缺失白頭翁的陰性對照樣品2g，同法制備陰性對照溶液；薄層鑒別以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，點樣量2 iil，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 °C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。其中，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別，步驟如下供試品溶液的制備取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘。濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘渣加甲醇IOml使溶解，作為供試品溶液；對照藥材溶液的制備對照溶液；取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液；陰性對照溶液的制備再取缺失白頭翁的陰性對照樣品3g，同法制成陰性對照液；薄層鑒別吸取上述溶液各2 yl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點顯色清晰。本發明的檢測方法是經過篩選獲得的，篩選過程如下2. I黃連的薄層鑒別( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘渣加甲醇IOml溶
解，作為供試品溶液。
( 2 )對照品溶液的制備取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液。(3)對照藥材溶液的制備取黃連對照藥材粉末0. 05g,加甲醇IOml,同法制成對照藥材溶液。(4)陰性對照溶液的制備取缺黃連陰性對照品0. 3g,同法制成陰性對照溶液。(5)薄層鑒別試驗參照2005版獸藥典方法，制成供試品、對照品、對照藥材及陰性對照品溶液。試驗主要進行黃連薄層鑒別條件優化包括展開劑、點樣量、預飽和時間、薄層板等因素對色譜分 離的影響。a展開劑的考察以硅膠G板，點樣量2iU，分別用以苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水(6:3:1. 5:1. 5:0. 3)和正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2) [2]作為展開劑展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，斑點清晰集中，確定正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑。b點樣量的考察以硅膠G板，分別點樣2 ill和I iU，以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開齊U，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。IiU的點樣量，分離度更好，確定點樣量Iu I。c飽和時間的考察以硅膠G板，點樣I iU，以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。分別考察了展開劑預飽和時間0分鐘、10分鐘對色譜圖的影響。結果表明，展開劑預飽和時間為0分鐘和20分鐘對色譜分離無明顯影響。確定展開劑無需預飽和。d薄層板的考察以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，點樣量liU，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。對不同薄層板(G板、GF254板)進行了考察，結果色譜行為差異不大。參照藥典選擇薄層G板。(6)小結通過薄層色譜(不同展開劑、不同點樣量、不同的預飽和時間、不同薄層板)優化，采用色譜條件以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，硅膠G薄層板，點樣量liU，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現性好，專屬性強，收入質量標準正文。2. 2大黃的薄層鑒別(I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時，濾過，蒸干，殘渣加水IOOml使溶解，再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷2ml使溶解，作為供試品溶液。
(2)對照藥材溶液的制備取大黃對照藥材0. Ig,同法制成對照藥材溶液。(3)陰性對照溶液的制備稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對照品0. 26g,同法制成陰性對照溶液。(4)薄層鑒別試驗參照2005版獸藥典M中大黃藥材的薄層鑒別方法，以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15 :5:1)的上層溶液為展開劑，主要考察了不同點樣量、不同預飽和時間、不 同薄層板、不同展距對色譜分離的影響。a點樣量的考察以硅膠G薄層板，分別點樣2 ill和4 iil，以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。結果2iU的點樣量，斑點不清晰，確定點樣量4iU。b飽和時間的考察以娃膠G薄層板，點樣量I,以石油醚(30-60 °C )-甲酸乙酯_甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。分別考察了展開劑預飽和時間0分鐘和10分鐘對色譜分離效果的影響。結果表明，展開劑預飽和時間為Omin和IOmin對色譜分離無顯著差異。確定展開無需預飽和。c薄層板的考察以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，點樣量
4Ul，展開，展距5cm，展畢，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。對不同薄層板(G板、GF254板、H板)進行了考察，結果表明，硅膠H板展開斑點成點性更好，確定選擇薄層H板。d展距的選擇以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，羧酸甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，點樣量4 u 1，展開，展距分別為5cm和10cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。展距IOcm時分離效果更好，確定展距10cm。(5)小結通過薄層色譜條件(不同點樣量、不同預飽和時間、不同薄層板、不同展距)優化，采用色譜條件以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，羧酸甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，點樣量4 yl，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同的橙黃色熒光斑點；置氨蒸氣中熏后，斑點變為紅色，陰性對照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現性好，專屬性強，收入質量標準正文。2. 3白頭翁藥材的薄層鑒別(I)方法一取本品0. 3g，加入70%乙醇10ml，振搖20min，過濾，濾液濃縮至1ml，
作為供試品溶液。另取對照藥材粉末O.lg，同法制成供試品溶液。取缺失白頭翁的散劑0. 2g，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各Iu 1，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(70 30 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm,取出，晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱5 10分鐘，日光下檢視。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，本品無相對應的斑點。(2)方法二 取本品I. 5g，加水10ml，加鹽酸4ml，回流提取lh，過濾，濾液濃縮至5ml，用50ml氯仿萃取一次，氯仿提取液濃縮至5ml，制得供試品溶液。另取白頭翁藥材0. 5g，同法制成對照藥材溶液；取缺失白頭翁的陰性對照品lg，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對照品藥材溶液和陰性對照溶液各I U 1，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，本品無相對應的斑點。 (3)方法三取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過。殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時間20分鐘。濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液。另取白頭翁藥材lg，同法制備對照藥材溶液。取缺失白頭翁的陰性對照樣品2g，同法制備陰性對照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液各I U 1，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的褐色斑點，陰性對照樣品無干擾。確定方法三為供試品溶液制備制備方法。(4)薄層鑒別實驗照方法三，分別制備供試品、對照品及陰性對照品溶液，進一步優化白頭翁薄層鑒條件，主要考察了不同展開劑、不同點樣量、不同飽和時間、不同薄層板、檢視方法對檢出效果的影響。a展開劑的考察以硅膠G 板，點樣 I iil，分別用氯仿-甲醇-水(60:40:10 ；65:35:10 ； 55:45:10)和正丁醇-醋酸乙酯-水(4:1:5)作為展開劑,展開,展距5cm,取出，晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果氯仿-甲醇-水(60:40:10)展開效果最佳，斑點清晰，Rf值大小適宜。確定氯仿-甲醇-水(60:40:10)作為展開劑。b點樣量的考察以硅膠G板，分別點樣I ill和2 iil，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果1 Ul點樣量，斑點不清晰且拖尾。確定點樣量為2iU。c飽和時間的考察以硅膠G板，點樣2 iU，以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm,取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。分別考察了預飽和時間0分鐘和20分鐘對色譜分離效果的影響。結果展開劑預飽和時間為0分鐘和20分鐘對色譜分離效果無顯著影響。確定展開無需預飽和。d薄層板及檢視方法的考察以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，點樣量
2Ul，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。對不同薄層板(G板、GF254板、H板)進行了考察。結果薄層板的類型對白頭翁的薄層分離效果影響不大，且在紫外下均無特征斑點，但硅膠G板和GF254板成點性較好，考慮到硅膠G板較通用，確定選擇硅膠G薄層板在日光下檢視。(5)小結
通過供試品溶液制備方法、薄層色譜條件(不同展開劑、不同點樣量、不同預飽和時間、不同檢視方法)優化，采用色譜條件以氯仿-甲醇-水￠0 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，點樣量2 yl，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現性好，專屬性強，收入質量標準正文。2. 4白頭翁皂苷B4的薄層鑒別取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘。濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘渣加甲醇IOml使溶解，作為供試品溶液。再取缺失白頭翁的陰性對照樣品3g，同法制成陰性(同時按處方量制成的缺失白頭翁樣品)對照溶液；取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國獸藥典》2010年版二部，附錄32頁)試驗，吸取上述兩種溶液各2 yl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點顯色清晰。結果供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結論通過供試品溶液制備方法、薄層色譜條件優化，采用色譜條件以氯仿甲醇水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯一個相同顏色的主斑點，陰性對照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現性好，專屬性強。通過參照藥典與文獻方法，分別進行了有效成分白頭翁皂苷B4和白頭翁對照藥材的檢出研究，結果兩種方法均能有效檢出藥物中的白頭翁。但因目前市場上無法購得中國藥品生物制品檢定所生產的白頭翁對照藥材，因為選用白頭翁皂苷B4對照品進行白頭翁的薄層鑒別，該方法專屬性很好，沒有干擾，所以選擇以白頭翁皂苷B4作為對照來檢出復方的白頭翁，將白頭翁皂苷B4薄層鑒別的方法收入質量標準正文。2. 5老鸛草的薄層鑒別(I)供試品溶液的制備取復方4. 5g，加甲醇45ml，水浴回流30分鐘，濾過，蒸干，殘渣加甲醇16ml溶解，作為供試品溶液。(2)對照藥材溶液的制備取老鸛草對照藥材lg，同法制成對照藥材溶液。(3)陰性對照溶液的制備取缺失老鸛草陰性樣品3. 5g，同法制成陰性對照溶液。(4)薄層鑒別實驗照薄層色譜法實驗，主要考察了不同展開劑、不同顯色劑對色譜分離的影響。a展開劑的考察 以硅膠G薄層板上，點樣量2iU，分別以氯仿-甲醇(10:1)，石油醚-丙酮(5:1)，石油醚-丙酮(2:1),甲苯-氯仿-丙酮(40:25:35)作為展開劑，展開，展距5cm,取出，晾干，置紫外365nm下檢視。在各展開條件下，對照藥材均無明顯斑點。b顯色劑的考察以硅膠G薄層板上，點樣量2 yl，石油醚-丙酮(2:1)為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別以10%硫酸乙醇、茴香醛顯色，日光下檢視，對照藥材無明顯斑點。(5)小結在不同展開體系和不同顯色劑條件下，對照藥材均無明顯斑點，不能從本品中有效檢出老鸛草藥材，老鸛草藥材的薄層鑒別方法尚待于進一步研究，暫不列入本品質量標準。本發明的中藥組合物是經過實驗篩選獲得的，藥效學實驗數據如下本發明以實施例2所得連翁止痢散對大腸桿菌感染導致的仔豬白痢的臨床防治效果試驗本試驗選擇患有腹瀉，排乳白或灰白色漿糊狀腥臭糞便，尾根腹側、肛門周圍粘有糞便等典型仔豬白痢臨床癥狀的揚州江都寶龍豬場的大約梅三元雜交瘦肉仔豬為初選對象，無菌采集8頭疑似仔豬白痢患豬的肛門棉拭子和2頭病死豬發炎小腸粘膜病料，按細菌學經典檢驗方法，經分離培養、形態觀察、染色反應、生化試驗和抗原血清型凝集試驗等鑒定證實，其病原主要是08:F4、0138:F4血清型的致病性大腸桿菌，據此確診該豬場仔豬所患疾病為致病性大腸桿菌引起的仔豬白痢病。選擇該豬場同日齡健康仔豬作為藥物耐受性試驗的實驗動物。通過選擇25 35日齡健康斷奶仔豬65頭作連翁止痢散耐受性試驗，150頭患白痢斷奶仔豬作實驗性療效試驗和80頭25 40日齡患白痢斷奶仔豬作擴大臨床療效試驗。具體方法如下由于引發仔豬白痢的因素很多，在試驗分組的設計過程中，應充分考慮天氣、環境、母豬等因素對試驗結果的影響，從而確保試驗盡可能在相同條件下進行，以減少試驗誤差，達到客觀評價藥物療效的目標。因此，整個試驗采用同窩對照試驗原則，力求減少主、客觀因素對實驗結果的影響。試驗期間，試驗仔豬給予不添加任何抗菌素的全價飼料，按常規飼養管理飼養。I藥物耐受性試驗選取25 35日齡、體重5 6. 5kg的臨床健康斷奶仔65頭，逐頭稱重、編打耳號后，隨機分為3組，參照中華人民共和國獸藥典[4]和大鼠急性毒性試驗結果[5]，其中2個給藥組各20頭仔豬，分別按連翁止痢散2g/Kg/d、lg/Kg/d的劑量分2次拌飼內服，I個空白對照組25頭仔豬，給予相應量的醫用淀粉，連續給藥5d。給藥后每天觀察，仔細記錄各頭仔豬的采食、飲水、排便和毒性反應出現的時間、死亡情況，連續觀察10d。觀察期內自由采食和飲水。觀察期結束后分別稱重，統計各組的日均增重，最后各組處死2頭存活仔豬，進行眼觀病理學檢查。2實驗性療效試驗選擇該場25 35日齡、體重為5飛.5kg的自然患白痢斷奶仔豬150頭，經確認仔豬未用過任何藥物治療后，逐頭編打耳號、稱重后，將同窩仔豬隨機分為5組即連翁止痢散高、中、低劑量組，仔豬止痢散藥物對照(陽性藥物對照)組和陽性對照(患病不給藥)組，每組各30頭。所有試驗組用藥途徑均為拌飼，分2次/d(間隔8 10h)，連用3d。按仔豬耳號建立病歷檔案，從給藥當日起，每天觀察并按組逐頭記錄仔豬的精神狀態、飲食狀況、腹瀉程度和糞便性狀，好轉所需時間等，觀察期為7d。觀察期結束后于IOd分別稱重，統計各組的日均增重(已死亡豬的日均增重記為0)，詳細分組及給藥試驗處理見表I。表I各試驗組處理情況
Sii I
還翁 ll#| tit f'.'.'j 糾 M；IiAj 猜按體 iff I j4/K /d 的 ifl M: 分 2 次 /d (11 jJ _
!0_'l2h) AU珠連_ !
職Il #j敗中剎蘭嫌體概劑:,丨:_, 11余N I.
翁 11: _ 散低煙 Ii : W 病猜按體'1(0, 2 / K g/d 的擁丨 j ；fn 藥 i l: i—i M I: 藥物對IU訃》土病 1 痛諸按的劑!_〖給藥,1;
丨I)
Hifki-JIS| 猜《服相矽V:的阪川淀粉，It細I;
健til m. Xf藥物耐受性ii驗的個:r I I _處A1 Jj
空Strtl253擴大臨床療效試驗選擇該場25 40日齡、體重為5 7. 5kg的自然患白痢斷奶仔豬80頭，經確認仔豬未用過任何藥物治療后，逐頭編打耳號，將同窩仔豬隨機分為2組即連翁止痢散治療組和仔豬止痢散治療(陽性藥物對照)組，每組40頭。兩種藥物都按體重0. 5g/Kg/d劑量(其中連翁止痢散根據上述實驗性治療試驗結果確定劑量，仔豬止痢散按說明書給藥)分2次(間隔8 10h)拌飼給藥，連用3d。按仔豬耳號建立病歷檔案，用藥后每天觀察記錄療效情況，觀察期為7d。因本不同窩試驗仔豬日齡和初始體重存在一定的個體差距，故不再進行日均增重統計，其治療結果判斷以仔豬排出糞便性質變化，作為藥物治療效果的判定標準，治療效果分痊愈、有效、無效3個級別，具體標準如下
痊愈治療后患豬糞便成型，干稀適度，顏色正常，尾根腹側及肛門周圍粘有糞便，仔豬活動、精神和食欲恢復正常，觀察期內無復發。有效治療后患豬糞便明顯變稠，拉稀次數明顯減少。仔豬食欲、活動和精神狀態有明顯改善。無效治療后患豬精神、食欲、糞便無明顯改善，甚至加重或死亡。5 結果5. I藥物耐受性試驗結果試驗期間，連翁止痢散2g/Kg/d劑量組和lg/Kg/d劑量組試驗仔豬采食、飲水、排便均未見異常和任何副作用及中毒現象。給予醫用淀粉的空白對照組有3頭仔豬分別在試驗開始后2 4d內出腹瀉，在未經治療的情況下，經4 5(1逐步恢復，該組其余試驗仔豬均未見出現任何異常現象。觀察期結束后分別稱重，日均增重統計結果顯示連翁止痢散中劑量組最高，為0. 259Kg/d，其次是連翁止痢散高劑量組為0. 258Kg/d，空白對照組最低為0.252，但3組間無明顯差異(P>0. 05)，詳細結果見表3。最后各組隨機 撲殺2頭仔豬，經剖檢胃、腸、心、肝、脾、腎、輸尿管等臟器均未見明顯病理變化，說明連翁止痢散2g/Kg/d以下劑量對仔豬是安全的。表2耐受性試驗各組生長性能n=20，2權利要求
1.一種治療仔豬白痢的中藥組合物，其特征在于，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連100-300g，白頭翁100-300g，老鸛草100-300g，大黃炭100_300g。
2.根據權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連200g，白頭翁200g，老鸛草200g，大黃炭200g。
3.根據權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，是散劑。
4.根據權利要求I所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎，混勻即得。
5.根據權利要求I所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎成極細粉，過篩，混勻，即得。
6.根據權利要求I所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于將白頭翁、黃連、老鸛草、大黃炭四味藥材，粉碎成極細粉，必要時加入輔料，混勻，制備成散劑。
7.—種權利要求I所述的中藥組合物的檢測方法，其特征在于， 包括，黃連的薄層鑒別，大黃炭的薄層鑒別，白頭翁藥材的薄層鑒別，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別。
8.權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，其中黃連的薄層鑒別，步驟如下 (1)供試品溶液的制備 取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘渣加甲醇IOml溶解，作為供試品溶液； (2)對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液， (3)對照藥材溶液的制備 取黃連對照藥材粉末0. 05g，加甲醇10ml，同法制成對照藥材溶液； (4)陰性對照溶液的制備 取缺黃連陰性對照品0. 3g，同法制成陰性對照溶液； (5)薄層鑒別 展開劑為正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)，點樣量I yl，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。
9.權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，其中，大黃的薄層鑒別，步驟如下 (1)供試品溶液的制備 取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時，濾過，蒸干，殘渣加水IOOml使溶解，再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷2ml使溶解，作為供試品溶液， (2)對照藥材溶液的制備 取大黃對照藥材0. lg，同法制成對照藥材溶液， (3)陰性對照溶液的制備 稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對照品0. 26g，同法制成陰性對照溶液， (4)薄層鑒別 以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，點樣量4 yl，展開，展距5cm，展畢，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。
10.權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，其中，白頭翁藥材的薄層鑒別，步驟如下供試品溶液的制備取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時間20分鐘，濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液； 對照藥材溶液的制備另取白頭翁藥材lg，同法制備對照藥材溶液； 陰性對照溶液的制備取缺失白頭翁的陰性對照樣品2g，同法制備陰性對照溶液；薄層鑒別以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，點樣量2 yl，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視； 其中，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別，步驟如下 供試品溶液的制備取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘，濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘渣加甲醇IOml使溶解，作為供試品溶液； 對照藥材溶液的制備對照溶液；取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液； 陰性對照溶液的制備再取缺失白頭翁的陰性對照樣品3g，同法制成陰性對照液； 薄層鑒別吸取上述溶液各2 yl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點顯色清晰。
全文摘要
本發明涉及一種治療仔豬白痢的中藥復方連翁止痢散及其制備方法和應用。以黃連100-300g，白頭翁100-300g，老鸛草200g，大黃炭200g為原料，按照科學的處方組成和工藝制備，在較低溫度的環境下通過粉碎過200目篩制備而得，降低了粗纖維等對動物消化功能的不良影響，同時在一定程度上降低了有效成分的損耗。由于粉碎粒度達到75μm左右，使藥材中的有效成分充分暴露，有利于豬的消化、吸收，大大提高了藥物的生物利用度，既節約了中藥資源，又可適當提高藥效。連翁止痢散在使用時采用拌料飼喂，也可混水灌服，使用方便的特性有利于該藥的推廣應用。本發明還公開了連翁止痢散對大腸桿菌引起的仔豬白痢有較好的治療作用，具有良好的應用和推廣前景。
文檔編號A61K36/718GK102772508SQ20121028944
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者付海寧, 龐云露, 沈巍, 王春元, 王艷玲, 賈德強, 郝智慧, 鐘英杰 申請人:青島農業大學, 青島康地恩動物藥業有限公司, 青島康地恩藥業股份有限公司