專利名稱：一種藍莓果皮提取物及其在制備抗肝損傷藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥學領域，涉及一種藍莓果皮提取物及其在制備與鎘損傷相關的抗肝損傷藥物中的應用。
背景技術：
重金屬鎘在工業中應用廣泛，包括染料、電鍍、涂料、電池等，但是近年來，鎘污染的問題日益嚴重，中國多地市場的鎘米危機(約10%的大米鎘含量超標)、廣西柳江鎘污染事件等，使得人們談“鎘”色變。鎘污染主要來源于礦石開采和提煉過程，在生活中，主要通過食物和水源被人體攝入。香煙燃燒是日常生活中鎘污染的一個重要途徑，數據顯示，每燃燒一支香煙，會釋放0. 2-3 Ug的鎘顆粒，而中國煙民每年消耗的香煙達2萬億支。急性和慢性鎘中毒會造成不同器官的損傷甚至癌癥的發生，鎘一旦被吸收，會迅速的從血液中分布 到全身各個器官，肝臟是鎘損傷的首要靶點器官；肝臟是人體新陳代謝的重要器官，肝臟一旦受到損傷，其功能即受到抑制。鎘的強毒性還與其低代謝率、長生物半衰期(10-30年)有關。因此，鎘被美國毒物管理委員會(ATSDR)列為第6位危及人類健康的有毒環境污染物質。鎘的毒性機制復雜，研究表明，氧化損傷、炎癥反應等參與了鎘的毒性機制的形成，基于此，鎘損傷保護劑的開發多關注于抗氧化劑、螯合劑或鈣結合劑的開發，目前已有的護肝產品參差不齊，護肝效果并不明顯，而且天然護肝產品的開發相對滯后。脂質過氧化反應廣泛的存在于人體細胞中，通過對膜脂、蛋白質以及DNA的損傷，引起細胞或細胞器結構和功能的改變，正常情況下，機體中存在著抗氧化防御體系，能夠維持氧化和抗氧化之間的動態平衡，保護細胞不受到嚴重損傷。一旦這種平衡被打破，細胞就會受到過量產生的自由基的損傷，從而引起凋亡或壞死。花青素是一種天然的植物色素，是目前已知的抗氧化活性最強的天然產物，其抗氧化活性比Vc和VE要強20-50倍，而且長期服用對細胞的正常功能和結構不具有毒副作用，是安全有效的天然抗氧化劑。超氧化物歧化酶(SOD)是生物機體內的抗氧化酶，其作用是清除超氧陰離子，防止自由基對細胞結構和功能的損傷，在平衡機體的氧化和抗氧化關系中起到至關重要的作用，體內SOD活性越高，自由基清除速度就越快。
發明內容
本發明的目的在于提供一種藍莓果皮提取物及其在制備抗肝損傷藥物中的應用。為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案。一種藍莓果皮提取物，所述藍莓果皮提取物的制備方法為將藍莓果皮用pH為0-3、質量分數為60%的酸化乙醇水溶液(酸化采用硫酸、鹽酸等常用酸)在25-40°C的水浴中超聲提取30-60min，超聲功率為60-200W，超聲提取后過濾得提取液，將提取液用旋轉蒸發儀常溫減壓(25°C、0. OlMpa)旋轉蒸發處理至液態物質不再減少，將旋轉蒸發處理后剩余的提取液用大孔樹脂純化，純化后用旋轉蒸發儀常溫減壓(25°C、0. OlMpa)旋轉蒸發濃縮，然后冷凍干燥得到藍莓果皮提取物。所述大孔樹脂純化包括以下步驟先用含0. 01%HC1的蒸餾水淋洗大孔樹脂層析柱，至流出液澄清后再用質量分數為0. 1%的三氟醋酸甲醇溶液洗脫，收集流出液。上述藍莓果皮提取物在制備抗肝損傷藥物中的應用。所述肝損傷為重金屬致肝損傷。所述肝損傷為鎘致肝損傷。所述藍莓果皮提取物的用量為3_30mg/kg。制備得到的藍莓果皮提取物呈紫紅色固態結晶、無味，易溶于水。采用pH示差法 測定總花青素含量，所述藍莓果皮提取物中花青素的質量分數為40%左右。本發明所述藍莓果皮提取物可以與藥學上可接受的輔料制備制劑，劑型包括口服制劑等。本發明所述藍莓果皮提取物為多酚類物質，主要活性成分包括花青素。通過建立鎘損傷小鼠肝臟損傷模型，觀察其組織病變結果及生化指標的改變表明，藍莓果皮提取物具有降低與鎘相關的肝損傷、保護肝臟的作用，3-30mg/kg藍莓果皮提取物能夠明顯降低損傷肝組織丙二醛(MDA)的含量，同時提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，本發明所述藍莓提取物在制備肝臟保護藥物中具有廣泛的應用前景。
圖I是鎘急性中毒模型組小鼠組織形態學切片，蘇木精&曙紅染色，40X觀察，一表示炎癥細胞侵潤，*表示空泡的形成；圖2是鎘急性中毒模型組與其他組小鼠MDA的含量；圖3是鎘急性中毒模型組與其他組小鼠SOD的活性。*表示與空白組相比，結果具有顯著性差異；#表示與損傷組相比，結果具有顯著性差異。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進一步說明。藍莓果皮提取物的制備方法為將藍莓果皮用pH為I、質量分數為60%的酸化乙醇水溶液在30°C的水浴中超聲提取40min，超聲功率為150W，超聲提取后過濾得提取液，將提取液用旋轉蒸發儀常溫減壓旋轉蒸發處理至液態物質不再減少，將旋轉蒸發處理后剩余的提取液用大孔樹脂(Amberlite XAD-7)純化，純化后用旋轉蒸發儀常溫減壓旋轉蒸發濃縮，然后冷凍干燥得到藍莓果皮提取物。所述大孔樹脂純化包括以下步驟先用含0. 01% (質量分數)HCl的蒸餾水淋洗大孔樹脂層析柱，使提取液中的色素隨流出液流出，至流出液澄清后再用質量分數為0. 1%的三氟醋酸(TFA)甲醇溶液洗脫，收集流出液，至流出液顏色變淡為止。藍莓果皮提取物在制備與鎘損傷相關的抗肝損傷藥物中的用途，采用的試驗方法是鎘致小鼠肝臟損傷，建立鎘急性中毒模型，胃飼藍莓果皮提取物后觀察小鼠肝臟組織形態學變化，同時測定肝臟組織中MDA的含量以及SOD的活性變化，與正常對照組以及保護組比較是否存在差異。具體如下I.材料I. I藥品與試劑藍莓果皮提取物，氯化鎘，0. 9%NaCl，pH7. 4的50mM磷酸緩沖液，濃鹽酸，2，6_ 二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，三氯乙酸(TCA)，硫代巴比妥酸(TBA)、考馬斯亮藍G-250，鄰苯三酚，蘇木精，曙紅。I. 2 儀器紫外可見分光光度計，Beckman低溫冷凍離心機，電熱恒溫水浴鍋，電子天平。
I. 3 動物昆明小鼠，體重為20±2g，雄性。I. 4統計學處理所有的實驗數據都表示為mean土S.E.來表示。平均值用單向方差分析法(one-way analysis of variance, ANOVA)和相應的學生 t_ 檢驗(Student，s t-test)進行統計學分析。統計學上P〈0. 05認為具有顯著性差異。2.試驗方法2. I試驗分組將小鼠隨機分成7組(每組7只):包括生理鹽水對照組，鎘急性中毒模型組以及試驗給藥組，試驗給藥組按藍莓果皮提取物濃度的不同分為5組，即試驗組I，試驗組II，試驗組III，試驗組iV以及試驗組V。2. 2試驗方法生理鹽水對照組(Control)腹腔注射(ip)0. 9%的生理鹽水以及灌胃(ig)0. 9%的生理鹽水鎘急性中毒模型組(Cd( II ))腹腔注射(ip)2mg/kg的氯化鎘溶液(CdCl2)以及灌胃(ig)0. 9%的生理鹽水試驗給藥組(Cd( II )+Ay)，藥物是藍莓果皮提取物，分別腹腔注射(ip) 2mg/kg的CdCl2溶液，以及灌胃(ig)不同劑量的藍莓果皮提取物，濃度分別為0. 3，I, 3，10，30mg/kg(即試驗組I-V),每天一次,連續給藥14天。在末次給藥禁食24h后將小鼠脫頸椎處死，解剖觀察肝臟組織變化，并取肝臟于福爾馬林中固定，制作石蠟切片，蘇木精和曙紅染色，光鏡觀察照相。另外，新鮮肝臟勻漿制備肝臟勻漿液，制備方法用生理鹽水充分洗去小鼠肝臟表面殘血，濾紙吸干。取適量肝組織稱重，置玻璃勻漿器中，加冰冷的磷酸緩沖液制成10%的肝勻漿。按照文獻報道方法，利用硫代巴比妥酸法測定肝臟勻漿中MDA的含量，鄰苯三酚自氧化法測定SOD的活性，考馬斯亮藍法測定勻漿中蛋白質的含量。3.結果3. I觀察小鼠肝臟組織病理學切片參見圖1，鎘的毒性作用能夠造成肝臟組織中空泡的形成以及炎癥細胞的侵潤。3. 2藍莓果皮提取物對鎘中毒小鼠肝臟組織內MDA的含量影響參見圖2，由MDA試驗結果分析，可以看出I)鎘急性中毒模型組MDA含量較生理鹽水對照組升高(p〈0. 05)，說明急性鎘中毒小鼠模型建立。2)藍莓果皮提取物試驗給藥組中，試驗組I與鎘急性中毒模型組相比較，有顯著差異，p〈0. 05，而試驗組II與鎘急性中毒模型組相比，無顯著性差異，p>0. 05，試驗組III、IV以及V與鎘急性中毒模型組相比具有顯著性差異，p〈0. 01，說明藍莓果皮提取物能夠降低MDA的產生，但與劑量濃度有關，呈現劑量依賴型關系，藍莓果皮提取物濃度為3-30mg/kg降低MDA生成的效果最好。3. 3藍莓提取物對鎘中毒小鼠肝組織SOD活性的影響參見圖3，由SOD活性結果分析得出I)鎘急性中毒模型組SOD含量較生理鹽水對照組明顯降低(p〈0. 05)，說明急性鎘中毒小鼠模型建立。
2)藍莓果皮提取物試驗給藥組中，試驗組I與鎘急性中毒模型組相比無顯著性差異，p>0. 05，而試驗組II-V與鎘急性中毒模型組呈顯著差異，p〈0. 01和p〈0. 001，此結果說明藍莓果皮提取物能夠提高SOD的活性，與劑量濃度有關，藍莓果皮提取物濃度在l_30mg/kg對SOD活性的提聞效果最好。4.對比試驗，藍莓果皮提取物為多酚類物質，其主要的活性成分之一是花青素。通過與多酹類化合物咖啡酸苯乙酯(CAPE, 10mg/kg)抗脂質過氧化反應作用進行比較(如圖2)，藍莓果皮提取物具有更強的抗氧化效果。\以及Ve在體內實驗中，效果較CAPE更差。5.結論鎘中毒小鼠肝臟組織形態學觀察到其肝臟中出現空泡以及炎癥細胞的侵潤，主要是由于鎘導致肝臟細胞的凋亡和壞死造成的，研究表明，鎘急性損傷的首要器官為肝臟，因此，鎘中毒與之最相關的臟器即為肝臟。重金屬鎘屬于非氧化還原性金屬，不能直接產生自由基，但是可以間接的影響自由基的產生，從而造成氧化壓力的形成。活性自由基通過攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化，形成脂質過氧化物。肝臟脂質過氧化的程度可以通過測定脂質過氧化物來評價。丙二醛(MDA)是不飽和脂肪酸脂質過氧化反應的終產物之一，它在組織中的含量能夠反映機體內脂質過氧化的程度，間接的體現自由基對細胞及組織的損傷破壞的程度。鎘致小鼠肝臟損傷結果表明藍莓果皮提取物能夠降低肝臟損傷，本發明基于鎘致肝臟損傷的機理，通過測定SOD活性及MDA含量的變化，發現并證實鎘引起肝臟損傷是由于自由基的損傷作用，導致機體SOD活性降低，以及MDA含量升高，通過本次發明闡明了鎘中毒與天然提取物改善鎘相關肝臟損傷的作用機理，其中藍莓果皮提取物3-30mg/kg能夠降低損傷組肝臟MDA的含量，提高SOD的活性，說明藍莓果皮提取物對肝臟的保護作用可能與自由基的清除或抑制作用有關。藍莓果皮提取物有望成為一種有效的鎘相關的肝臟損傷保護制劑，為從事鎘相關行業的職業人員以及吸煙者提供更好的肝臟保護作用。
權利要求
1.一種藍莓果皮提取物，其特征在于所述藍莓果皮提取物的制備方法為將藍莓果皮用PH為0-3、質量分數為60%的酸化こ醇水溶液在25-40°C的水浴中超聲提取30_60min，超聲功率為60-200W，超聲提取后過濾得提取液，將提取液用旋轉蒸發儀常溫減壓旋轉蒸發處理至液態物質不再減少，將旋轉蒸發處理后剰余的提取液用大孔樹脂純化，純化后用旋轉蒸發儀常溫減壓旋轉蒸發濃縮，然后冷凍干燥得到藍莓果皮提取物。
2.根據權利要求I所述ー種藍莓果皮提取物，其特征在于所述大孔樹脂純化包括以下步驟先用含0. 01%HC1的蒸餾水淋洗大孔樹脂層析柱，至流出液澄清后再用質量分數為0.1%的三氟醋酸甲醇溶液洗脫，收集流出液。
3.—種如權利要求I所述藍莓果皮提取物在制備抗肝損傷藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述ー種藍莓果皮提取物在制備抗肝損傷藥物中的應用，其特征在于所述肝損傷為重金屬致肝損傷。
5.根據權利要求3所述ー種藍莓果皮提取物在制備抗肝損傷藥物中的應用，其特征在于所述肝損傷為鎘致肝損傷。
6.根據權利要求3所述ー種藍莓果皮提取物在制備抗肝損傷藥物中的應用，其特征在于所述藍莓果皮提取物的用量為3-30mg/kg。
全文摘要
本發明屬于藥學領域，公開了一種藍莓果皮提取物及其在制備抗肝損傷藥物中的應用，解決了現有技術中的藥物在治療鎘相關肝臟損傷疾病中效果不佳的技術問題。本發明的藍莓果皮提取物為多酚類物質，主要活性成分之一為花青素，小鼠組織形態學切片及生化指標檢測結果顯示藍莓果皮提取物能夠降低肝臟損傷，其中藍莓果皮提取物3-30mg/kg能夠明顯降低損傷肝臟組織MDA的含量，提高SOD的活性，能夠起到對鎘相關的肝臟損傷的保護作用。
文檔編號A61K131/00GK102772471SQ20121027887
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年8月7日
發明者周安寧, 陳福欣, 龔頻 申請人:西安科技大學