專利名稱：一種靶向抑制POLD1基因表達的siRNA序列的制作方法
—種靶向抑制P0LD1基因表達的siRNA序列
技術領域：
本發明涉及分子生物學與生物醫藥領域，尤其涉及一種靶向抑制POLDl基因表達的siRNA序列。
背景技術：
DNA復制是細胞正常分裂、增殖的關鍵一步。DNA聚合酶δ (ρο δ )是真核生物DNA復制的最主要復制酶，在哺乳動物細胞中，ρο δ由4個亞基組成，分別是ρ125、ρ50、ρ68、ρ12。ρ125亞基是它的催化亞基，具有5' -3'聚合酶活性和3' -5'核酸外切酶活性，這使該酶在DNA復制、修復、維持基因組穩定性、重組及細胞周期調控中都起到重要作用。癌的惡性增殖需要DNA的大量復制滿足其持續的細胞分裂活動。近年來，ρο δ與細胞癌變之間的關系逐漸被研究者重視。國內外實驗研究發現，Ρ125的表達與肝腫瘤的惡性程度、腫瘤細胞分化程度、靜脈侵襲和肝內轉移密切相關。Ρ125高表達的肝癌細胞系Ifep3B和H印G2 的侵襲能力明顯強于P125低表達的Huh7細胞系。pl25的表達與POLDlmRNA(P0LDI是編碼DNA聚合酶δ催化亞基ρ125的基因)表達呈正相關，在轉錄水平上沉默POLDl基因表達，能明顯降低肝癌細胞的侵襲能力。POLDl基因是多種增殖性調控基因最終產生效應的基因，也可能自身的變化就是細胞癌變的重要原因。在肝癌細胞H印G2中，POLDl基因的第472密碼子由酪氨酸突變為組氨酸；乳腺癌易感基因BRCA1/2的熱點突變區就潛伏在POLDl基因上；P0LD1基因的突變使乳腺癌的發生率增加了 2倍。在小鼠體內將POLDl基因一個等位基因的ExoII功能區D400位點突變后，能夠誘發小鼠淋巴癌及上皮癌。此外，在結腸癌、宮頸癌中也發現了 POLDl基因的高表達。因此，通過進一步研究闡明POLDl基因表達或pl25功能活性被抑制后直接阻斷癌細胞增殖的機理，分離鑒定阻斷癌細胞異常增殖的有效作用靶點，為新藥開發提供最確切的理論依據。小RNA干擾(small interference RNA, RNAi)技術是近幾年發展起來的一種阻抑基因表達的新方法。RNAi作用的高度特異性，有可能特異地抑制致病的突變等位基因，但又不影響正常等位基因功能，所以RNAi在基因治療上有廣闊的應用前景。RNAi作用機制是雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞后，在Dicer酶的作用下，降解為21_23bp，3’端帶有2個突出堿基的siRNA,并與細胞內核酸內外切酶、解鏈酶、Argonaute蛋白等結合,形成具有多個亞單元的核糖核苷酸蛋白復合物-RISC(RNA-inducing silencing complex),高效遞進式介導細胞內源性的同源mRNA的降解。哺乳動物細胞內，導入長雙鏈RNA可導致基因表達廣泛抑制，直接應用短雙鏈的siRNA同樣高效介導RNAi，并避免非特異性基因抑制效應。且短雙鏈siRNA通過化學方法易合成，操作簡便、轉染效率高，對細胞的或者組織的毒副作用小，可大規模制備，臨床應用方便，在藥物開發方面具有不可替代的優勢。但是，由于siRNA的堿基分布，兩端自由能大小及靶mRNA的二級結構等因素的影響，靶向同一基因mRNA不同靶點的siRNA，封閉基因表達的效果明顯不同。在siRNA沉默特定基因的實驗中，為保證siRNA能高效降解靶mRNA，一般需要針對靶基因設計合成多條不同序列的siRNA，從中篩選出有效序列。有效siRNA序列的設計篩選是siRNA介導RNAi實驗的關鍵點之一。
發明內容本發明要解決的技術問題在于提供一種靶向抑制人POLDl基因表達的siRNA序列，能聞效抑制POLDl基因的表達，從而抑制腫瘤的生長、增殖和運動轉移，促進腫瘤細胞死亡。本發明是這樣實現的一種靶向抑制人POLDl基因表達的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八條序列中的至少一條POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA3 序列，其正義鏈為 5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反義鏈為5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，；P0LDlsiRNA5 序列，其正義鏈為 5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反義鏈為5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，；P0LDlsiRNA6 序列，其正義鏈為 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反義鏈為5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，；P0LDlsiRNA7 序列，其正義鏈為 5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反義鏈為5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，；P0LDlsiRNA8 序列，其正義鏈為 5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反義鏈為5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。進一步地，所述siRNA序列包括以下三條序列POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。進一步地，所述siRNA序列包括以下兩條序列POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。本發明具有如下優點首先，POLDl基因是腫瘤基因治療的良好靶點，應用siRNA介導的RNAi技術可以比以往的任何手段更高效、特異、方便的抑制靶基因的表達。本發明提供能高效抑制POLDl基因表達的siRNA序列，并作用于腫瘤細胞，檢測POLDl siRNA抑制POLDl基因表達后，腫瘤細胞在增殖、運動轉移、細胞周期等方面的變化，為POLDl siRNA應用于惡性腫瘤的臨床
治療奠定重要基礎。其次，本發明提供能高效抑制POLDl基因表達的siRNA序列，為POLDl基因功能的進一步研究奠定重要基礎，從而抑制腫瘤的生長、增殖和運動轉移，促進腫瘤細胞死亡。通過研究癌細胞中對POLDl基因癌性表達和pl25功能活性癌性表現的抑制，尋找癌細胞增殖阻斷的靶點，為發展最有效的新的抗癌或抗細胞增殖性疾病藥物提供理論基礎。
下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的說明。圖I為MTT法檢測POLDlsiRNA抑制癌細胞增殖結果圖； 圖2為熒光實時定量PCR檢測POLDlsiRNA對POLDlmRNA表達的抑制作用結果圖；圖3A為蛋白質電泳圖；圖3B為P125蛋白質的相對表達量圖。圖4為顯微鏡觀察細胞形態變化結果圖；圖5為HE染色觀察細胞核形態變化結果圖；圖6為克隆形成實驗結果圖；圖7為Transwell檢測細胞運動轉移能力結果圖；圖8為AnnexinV-PI雙染流式細胞術檢測凋亡結果圖；圖9為PI單染，流式細胞術分析細胞周期結果圖。
具體實施方式本發明涉及一種靶向抑制人POLDl基因表達的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八條序列中的至少一條POLDI s iRNAI 序列，其正義鏈為 5 ’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3 ’，其反義鏈 5 ’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA3 序列，其正義鏈為 5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反義鏈為5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，；P0LDlsiRNA5 序列，其正義鏈為 5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反義鏈為5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，；P0LDlsiRNA6 序列，其正義鏈為 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反義鏈為5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，；P0LDlsiRNA7 序列，其正義鏈為 5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反義鏈為5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，；P0LDlsiRNA8 序列，其正義鏈為 5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反義鏈為5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。較優的，所述siRNA序列包括以下三條序列POLDlsiRN Al 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正義鏈為 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。較優的，所述siRNA序列包括以下兩條序列POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正義鏈為 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。所述siRNA序列中的各正義鏈和反義鏈的3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾。本發明siRNA序列的獲得方式如下根據生物信息學方法在genebank獲取人POLDlmRNA序列(LOCUS NM_002691. 2)，采用RNA structure分析軟件對POLDlmRNA序列的二級結構進行預測，總結以往提出的siRNA設計原則，綜合分析其GC含量、兩端自由能大小、mRNA作用位點的二級結構、siRNA對堿基偏愛性的要求等，設計siRNA系列。根據該軟件對設計出的siRNA系列的評價，進一步采用NCBI GenBank(美國國立醫學圖書館和美國國立衛生研究院編寫)提供的BLAST軟件，對選擇的靶序列進行同源分析，排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能，初步篩選出8條siRNA序列，并委托上海吉瑪制藥技術有限公司代為合成上述8條siRNA序列。所述8條siRNA序列的堿基序列、作用位點、GC含量以及評估等級如表I所示。表I
權利要求
1.一種靶向抑制人POLDl基因表達的SiRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括下述八條序列中的至少一條 POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2序列，其正義鏈為5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，； P0LDlsiRNA3序列，其正義鏈為5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反義鏈為5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，； P0LDlsiRNA4序列，其正義鏈為5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，； P0LDlsiRNA5序列，其正義鏈為5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反義鏈為5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，； P0LDlsiRNA6 序列，其正義鏈為 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反義鏈為5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，； P0LDlsiRNA7序列，其正義鏈為5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反義鏈為5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，； P0LDlsiRNA8序列，其正義鏈為5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反義鏈為5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。
2.根據權利要求I所述的一種靶向抑制人POLDl基因表達的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括以下三條序列 POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2序列，其正義鏈為5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反義鏈為5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，； P0LDlsiRNA4序列，其正義鏈為5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。
3.根據權利要求2所述的一種靶向抑制人POLDl基因表達的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括以下兩條序列 POLDlsiRNAl 序列，其正義鏈為 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反義鏈 5’ 為AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA4序列，其正義鏈為5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反義鏈為5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。
4.根據權利要求I或2或3所述的一種靶向抑制人POLDl基因表達的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列中的各正義鏈和反義鏈的3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾。
全文摘要
本發明提供一種靶向抑制人POLD1基因表達的siRNA序列，所述siRNA序列的正義鏈和反義鏈的3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾，將本發明作用于腫瘤細胞，檢測POLD1基因被POLD1siRNA抑制后，腫瘤細胞在增殖、運動轉移及細胞周期方面的變化，經實時熒光定量PCR及蛋白質免疫印跡方法檢測，發現POLD1siRNA1、POLD1siRNA4可顯著下調POLD1 mRNA及蛋白水平的表達，并在人小細胞肺癌NCI-H446細胞上驗證了設計合成的POLD1 siRNA對腫瘤細胞增殖、運動轉移等生物學特性的影響，為POLD1 siRNA臨床應用于腫瘤的治療奠定基礎。
文檔編號A61K48/00GK102911938SQ20121027650
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者許瑞安, 張均平 申請人:華僑大學