專利名稱：一種慢性腎間質纖維化模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種模型建立方法的技術領域，具體地說，是關于一種慢性腎間質纖維化模型的建立方法。
背景技術：
人類疾病動物模型是生物醫學科學研究中建立的具有人類疾病模擬性表現的動物實驗對象和材料，可為研究人類疾病的預防、治療(包括新藥物試用)提供理論依據。動物疾病模型的復制，在醫學科學研究中占有十分重要的地位。近年來，臨床上由于存在不按中醫辨證論治理論規范使用中草藥和民間“中草藥無毒”的錯誤觀念，以及國外對“中草藥腎病”含義的泛化，遏制了中草藥的臨床應用和中醫 藥的國際發展。因此，中草藥腎毒性的問題引起了國內外學者的廣泛關注，防治腎小管間質纖維化成為了腎病研究領域熱點。經了解，目前較多實驗研究中，常采用單側輸尿管梗阻導致腎間質纖維化模型進行研究，但該方法對實驗動物損傷較大，動物死亡率高，實驗成本較高，且未能證實藥物毒性可導致腎小管間質纖維化。另有鄭氏采用了馬兜鈴酸A標準品腹腔注射致大鼠慢性腎間質纖維化模型也較為經典，該方法雖證實了藥物毒性，但馬兜鈴酸A標準品價格昂貴，不易得到，也阻礙了該模型的使用。中藥尋骨風又名清骨風、貓耳朵(《南京民間藥草》)，穿地節、毛香、白毛藤、地丁香、黃木香(《江蘇植藥志》)，白面風、兔子耳(《江西民間草藥》)，為馬兜鈴科草本植物綿毛馬賀治Ar i s to I och i a mol lissima Hance的地上部份,性味辛、苦,平,歸肝經。具有祛風通絡，抗炎，止痛的功效，臨床主要用于風濕痹痛，胃痛，睪丸腫痛，跌打傷痛等癥。有文獻報道了尋骨風水煎劑不同劑量對實驗大鼠腎功能和腎小管-間質組織形態造成損害，但未闡明機制。亦有學者對香港服用了尋骨風69例患者的腎損害進行了初步評估，服用量最少每天IOg,最大每天30g,最短時間3天,最長為300天,每周服藥量< 5d,結果均未出現明顯的腎損害。中國專利文獻CN =1959408公開了一種含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分的體內樣品的測定方法。中國專利文獻CN 101884641A公開了中藥治療慢性腎臟損傷動物模型的建立方法。但是關于用尋骨風建立慢性腎間質纖維化模型方法目前還未見報道。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種慢性腎間質纖維化模型的建立方法。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是
一種慢性腎間質纖維化模型的建立方法，所述的該方法選用雌性Wister大鼠為動物模型，將尋骨風制成水煎液，尋骨風水煎液灌胃大鼠，所用尋骨風生藥劑量為2. 7g. kg—1. Cf1或 13. 5g. kg \ d 1 或 27g. kg d 1O
所述的劑量為27g. kg'Cf1。所述的雌性Wister大鼠體重120 150g。本發明優點在于
本發明明確了尋骨風所含馬兜鈴酸對腎小管間質造成的影響，并觀察了其對大鼠腎小管-間質影響的可能機制，旨在為腎小管間質纖維化模型建立提供一種較新的可靠方法，為規范臨床合理使用中草藥提供參考。本方法的結果證實了超常規劑量服用尋骨風能導致腎小管-間質的損害，高劑量尋骨風灌胃后能在90天內造成了大鼠腎間質的纖維化，大鼠腎功能衰竭，嚴重時可致死亡，而且腎小管和間質損傷程度與尋骨風用藥的劑量大小和時間長短相關。實驗中尋骨風高劑量組較馬兜鈴酸A組所引起的腎小管-間質損害程度重，腎間質纖維化較為嚴重。低 劑量尋骨風灌胃90天后腎小管和間質均未出現明顯異常。這為臨床合理使用尋骨風藥材提供了依據和參考。本方法在操作時，采用灌胃的給藥方式給藥，減少了對實驗動物的創傷，降低了死亡率。此外，本方法造模所用的中藥材尋骨風市場零售價為25元/公斤，價格便宜，進一步降低了實驗成本。
附圖I是光鏡觀察大鼠45天后，腎小管上皮變化圖。附圖2是光鏡觀察大鼠90天后，腎小管上皮變化圖。
具體實施例方式下面對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。(I)材料
①尋骨風飲片為市售產品。經反相高效液相色譜法測定實驗用尋骨風中含有馬兜鈴酸A的含量為0. 07%。②尋骨風制劑水煎液取實驗用尋骨風飲片lOOOg，加水12000ml，浸泡I小時，力口熱至沸騰后15min淋出。藥渣再加水8000ml，加熱至沸騰后15min淋出。二煎藥汁相合用旋轉蒸發儀減壓濃縮至700ml (相當于每毫升含生藥I. 43g,含馬覽鈴酸Al. 00mg),4°C下冰箱保存備用。③藥物配制尋骨風溶液用蒸餾水將尋骨風制劑原液配制成相當于每毫升含尋骨風生藥I. 62g (相當于含馬兜鈴酸Al. 134mg)濃度的溶液備用。(2)方法
①實驗動物雌性Wister大鼠，體重120 150g。大鼠適應性喂養3天。②給藥劑量及處理按人用尋骨風生藥最高用量30g/d，根據實驗大鼠與人體表面積比等效劑量換算比例0. 018計算為2. lg. kg' Cf1的10倍量計算為27g. kg' Cf1給予灌胃(用時按lml/100g大鼠灌胃)。持續給藥時間90天。大鼠在45天、90天時分別稱體重、留尿、大鼠腹股溝取血，處死后測腎重，留取腎組織，剝除腎臟外包膜放入福爾馬林固定。所有大鼠分組分籠飼養，實驗期間全部動物自由進食、飲水。所有大鼠分組分籠飼養，實驗期間全部動物自由進食、飲水。(3)檢測指標及方法
①尿液檢查潛血\腎功能早期損傷三項指標MA/Cr、TF/Cr及NAG/Cr；
②血清肌酐、尿酸、尿素氮檢測；
③腎組織病理學檢查和PAS染色方法
④病理檢查
(4)結果分析
尿常規檢查未發現尿潛血陽性，大鼠在45天時檢測NAG/Cr、MA/Cr、TF/Cr均明顯 升聞,90天后，二組尿液檢測指標進一步升聞。用藥90天后，大鼠Scr和BUN均出現升聞，
腎功能遭到了損害。具體數據見表I__
項目_0天_45天_90天_
NAG/Cr (U/g) 0. 10±0. 06&5±0. 37 2. 11±2. 6i~
MA/Cr (mg/mmol) 0. 13±0. 09±0. 55 2.29±1.7§~
TF/C(mg/mmol) 0. 05±0. 09H7±0. 20 0. 43±0. ~
Scr(timol/L) 18. 63 ±2. 56 丑700 ±13. 86 58.00±6.元_
BUN(mmol/L) |5. 73±0. 32|4. 46±0. 45 |6. 84±1.05
光鏡觀察大鼠45天后，出現腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性、部分脫落，管壁增厚，間
質水腫增寬、炎癥細胞浸潤，見圖1(圖I中的左邊圖為(HEX200)，右邊圖為(PASX200))。
90天后大鼠腎小管上皮細結構紊亂，可見明顯腎小管萎縮，管腔縮小、管壁增厚，部分閉塞，
間質區增寬，腎小管-間質少量炎性細胞浸潤，伴纖維化形成見圖2 (圖2中的左邊圖為
(HE X 200 )，右邊圖為(PAS X 200 ))，與用馬兜鈴酸A標準品腹腔注射致大鼠慢性腎間質纖
維化的模型比較無顯著差異。此結果還證明超常規劑量服用尋骨風能導致腎小管-間質的損害，且腎小管和間質損傷程度與尋骨風用藥的劑量大小和時間長短相關。實驗操作中，僅有I只大鼠因為灌胃死亡，其余均能完成實驗。本發明采用尋骨風水煎劑給實驗大鼠灌胃的方法，誘導其發生腎小管間質纖維化。該方法制作模型實驗動物創傷少，操作簡便，死亡率低，實現了實驗研究成本降低，便于研究者使用，促進臨床合理使用中草藥。尋骨風為馬兜鈴科植物棉毛馬兜鈴的根莖或全草，有研究報道了尋骨風水煎劑引起了大鼠腎小管-間質損害，但未闡明其機制。課題組先前通過反相高效液相色譜法測定了實驗用尋骨風中所含馬兜鈴酸A的含量為0. 07%,隨后經過尋骨風急性毒性試驗和亞急性毒性試驗，證實了尋骨風中藥材的毒性，確定了高(27g. kg-1. Cf1)、中(13. 5g. kg-1, cf1)、低(2. 7g. kg' cf1)三種劑量進行試驗。課題組將這三種劑量的尋骨風水煎液給各組別的雌性Wister大鼠連續灌胃90天，同鄭氏采用馬兜鈴酸A標準品腹腔注射所致大鼠慢性腎間質纖維化模型(馬兜鈴酸A組)相比較，結果顯示高劑量組(27g. kg-1, cf1)大鼠病理變化與國內外相關研究的報道相同，與經典方法比較無顯著差異，說明成功建立了腎小管間質纖維化模型。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種慢性腎間質纖維化模型的建立方法，其特征在于所述的該方法選用雌性Wister大鼠為動物模型，將尋骨風制成水煎液，尋骨風水煎液灌胃大鼠，所用尋骨風生藥劑量為 2. 7g. kg—1, d—1 或 13. 5g. kg—1, d—1 或 27g. kg—1, d—1。
2.根據權利要求I所述的慢性腎間質纖維化模型的建立方法，其特征在于所述的劑量為 27g. kg'cf1。
3.根據權利要求I所述的慢性腎間質纖維化模型的建立方法，其特征在于所述的雌性Wister大鼠體重120 150g。
全文摘要
本發明涉及一種慢性腎間質纖維化模型的建立方法，所述的該方法選用雌性Wister大鼠為動物模型，將尋骨風制成水煎液，尋骨風水煎液灌胃大鼠，所用尋骨風生藥劑量為2.7g.kg-1.d-1或 13.5g.kg-1.d-1或27g.kg-1.d-1。本發明為腎小管間質纖維化模型建立提供一種較新的可靠方法，為規范臨床合理使用中草藥提供參考。本方法在操作時，采用灌胃的給藥方式給藥，減少了對實驗動物的創傷，降低了死亡率。
文檔編號A61K36/264GK102772464SQ20121026047
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者周雯靜, 彭文, 金周慧 申請人:上海市普陀區利群醫院