專利名稱：一種堿性磷酸酶納微顆粒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及藥物制備領域，尤其涉及一種堿性磷酸酶藥物組合物的納微顆粒，以及納微顆粒的制備方法。
背景技術：
堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,以下簡稱AKP)屬于同源二聚體蛋白，在堿性環境中可水解各種天然及人工合成的磷酸單酯化合物底物，包括核酸、蛋白、生物堿等，將底物分子上的磷酸基團除去，生成磷酸根離子和自由的羥基。一般認為，AKP與骨的鈣化作用密切相關，成骨細胞中的AKP作用產生磷酸，與鈣生成磷酸鈣沉積于骨中。盡管臨床上·AKP升高的情況較常見，但是仍有大量疾病包括重癥慢性腎炎、乳糜瀉、貧血、惡病質、兒童甲狀腺功能不全或減退、維生素C缺乏癥壞血病、呆小癥、遺傳性低磷酸酶血癥會造成AKP減少，甚至嚴重降低。臨床上，低磷酸酯酶癥屬于一種遺傳性代謝紊亂，由組織非特異性AKP缺乏導致的缺陷骨礦化引起的，患者主要臨床表現為軟骨病和佝僂病，主要采用酶補償替代療法進行治療。另外，據報道AKP可以通過去除由細菌產生的脂多糖上的磷酸基團，對革蘭氏陰性菌引起的內毒素產生解毒作用，從而作為治療由內毒素引起的敗血癥的候選藥物。目前，AKP主要通過注射方式產生疾病治療作用，但注射方式不但操作繁瑣，而且給患者帶來了一定程度的疼痛感，特別對于需要長期用藥的患者來說十分痛苦。相比之下，肺吸入制劑具有多方面的優勢。第一，作為人類重要的生理器官，肺具有很大的表面積,成人每側肺約有3 4億個肺泡,總面積約為80-100m2 ;第二,肺泡壁由單層細胞膜構成，單層細胞膜的厚度約為100-200nm，藥物可快速透過；第三，肺泡被大量的毛細血管密集纏繞，藥物在透過肺泡的單層細胞膜后直接進入血液循環，從而輸送至全身發揮療效。以上這些生理特征決定了肺是一個理想的藥物遞送場所。肺吸入藥物具有明顯優勢無胃腸道降解作用；無肝臟首過效應；藥物吸收迅速、起效快；給藥劑量低、毒副作用小；非侵入治療方式、患者順應性好。因此，肺吸入制劑一直是治療局部性疾病，如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的首選方式，最近又進一步發展成為通過遞送活性生物分子來預防和治療周身性疾病的革命性的新興方式，因此獲得了快速發展。將藥物通過吸入方式有效遞送入肺是一個復雜的科學問題，而藥物顆粒的大小和分散性是關鍵，將直接決定藥物顆粒隨吸氣氣流在呼吸道的沉積部位。一般來說，大于IOum的藥物顆粒隨吸氣氣流只能沉積在口腔和咽喉等上呼吸道部位，小于5 u m的顆粒可以進入(細)支氣管等下呼吸道，小于2 u m的顆粒可以進入肺泡，但小于0. 5 ii m顆粒在吸入肺泡之后又會隨呼氣氣流排出，所以0. 5-2 是進入肺泡的最佳粒徑。因此，要實現藥物顆粒進入肺泡從而實現有效的吸收和發揮療效，顯然要制得2 u m以下尤其是0. 5-1 y m的納微藥物顆粒。納米噴霧干燥技術是近兩年發展起來的革命性肺吸入顆粒制造技術。其作用原理是在高頻振動下，溶液透過亞微米孔以數以百萬計的極細小液滴噴入熱空氣當中，溶劑瞬間蒸發形成納米顆粒。利用納米噴霧干燥技術，可以從低至幾亳升樣品中高產率地(收率約為90%)直接獲得平均粒徑在0. 5-1 u m大小的微粒，整個操作過程快速、溫和、粒徑可控且在最適合肺吸入的直徑范圍內。這些突出的優點使其在制備肺吸入顆粒制備上具有巨大的優勢，是目前最適合制備熱敏性生物大分子肺吸入顆粒的技術手段，有望在創新藥物制劑領域發揮重要作用。肺吸入制劑有三種類型噴霧劑、氣霧劑和粉霧劑。噴霧劑是將藥物溶液通過超聲等方式霧化，然后隨吸氣氣流吸入肺中。氣霧劑是將藥物顆粒和拋射劑一起置于密封罐中，使用時藥物經定量閥噴出形成氣溶膠吸入肺中。粉霧劑中藥物顆粒的噴出“霧化”完全由患者本身的主動吸氣氣流引發，不需要借助任何拋射劑，具有靶向、高效、速效、毒副作用小等特點。因此，需要制備一種堿性磷酸酶藥物組合物，并將堿性磷酸酶藥物組合物通過特殊工藝制備成納米干粉顆粒，以特定制劑形式經肺傳遞給藥用于疾病治療。
發明內容
本發明解決的問題是提供一種堿性磷酸酶納微顆粒及其制備方法。為解決上述問題，本發明揭示了一種堿性磷酸酶納微顆粒，包括輔料和藥物，所述藥物為堿性磷酸酶，所述輔料和所述藥物的質量比為I : io(Tioo:i，所述輔料包括穩定劑和分散劑，所述穩定劑與所述分散劑的質量比為i:io(Tioo:i，所述納微顆粒的產率為20 98%，平均顆粒粒徑為0. f IOiI m，生物活性藥物的活性保持率為5(Tl00%，體外肺沉積效率為10 98%。優選地，所述穩定劑取自碳水化合物、氨基酸或其混合物，包括環糊精、乳糖、海藻糖、甘露醇、殼聚糖中的一種或一種以上。優選地，所述分散劑取自亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、丙氨酸或甘氨酸中的一種或一種以上。本發明還揭示了一種用于制備所述堿性磷酸酶納微顆粒的制備方法，包括以下步驟，SI :將所述穩定劑與所述分散劑按一定比例混合，攪拌溶解，配制成混合溶液；S2 :將在步驟SI中所配得的混合溶液中加入一定比例量的堿性磷酸酶，攪拌溶解，充分混合，配制成納米噴霧干燥預備溶液；S3 :將在步驟S2中所得到的納米噴霧干燥預備溶液，通過納米噴霧干燥技術進行噴霧干燥。優選地，在步驟SI中，所述穩定劑與所述分散劑的質量比為I : 10(Tl00:l。優選地，在步驟S2中，所述穩定劑、分散劑和所述堿性磷酸酶的質量比為1:100 100:1。優選地，在步驟S3中，通過納米噴霧干燥技術噴霧干燥的工藝流程包括，將在步驟S2中所得到的預備溶液，經納米噴霧干燥儀霧化，在噴霧干燥筒內被干燥成納微顆粒。優選地，所制得的堿性磷酸酶納微顆粒可以制成肺吸入制劑，包括粉霧劑、氣霧劑或噴霧劑。與現有技術相比，本發明具有以下優點本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒，通過將堿性磷酸酶在輔料的合理配比作用下配制而成，并經納米噴霧干燥制備成粒徑小、均一、具有良好分散性能的納微顆粒，且堿性磷酸酶藥物能夠有效維持其生物活性。本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒，可以通過多種肺吸入制劑形式遞送入肺，用于治療堿性磷酸酶缺乏引起的多種疾病，比如，低磷酸酯酶癥、由內毒素引起的敗血癥。
圖I是本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒的制備流程圖；圖2是本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒粒徑分布圖；圖3是本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒電鏡觀察圖。
具體實施例方式本發明揭示了一種堿性磷酸酶納微顆粒，包括輔料和藥物，其中，藥物為堿性磷酸 酶，輔料和藥物的質量比為I:io(Tioo:I。具體地，輔料包括穩定劑和分散劑，穩定劑與分散劑的質量比為1:10(T100:1。本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒的產率為20、8%，平均顆粒粒徑為0. rio u m,生物活性藥物的活性保持率為5(Tl00%，體外肺沉積效率為10 98%。本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒，通過將堿性磷酸酶在與輔料的合理配比作用下配制而成，可用于治療由于堿性磷酸酶缺乏引起的多種疾病，比如，低磷酸酯酶癥、由內毒素引起的敗血癥。而現有的堿性磷酸酶藥物主要通過注射方式產生疾病治療作用，鑒于注射方式不但操作繁瑣，而且給患者帶來疼痛，特別對于需要長期用藥的患者來說十分痛苦；另一方面，考慮到肺吸入制劑具有多方面的優勢，比如，使用過程中無胃腸道降解作用、無口服藥物所產生的肝臟首過效應，藥物吸收迅速、起效快，給藥劑量低、毒副作用小，患者順應性好。因此，發明人考慮改變現有的堿性磷酸酶藥物以注射劑存在的形式，轉變為肺吸入制劑的形式。在本發明優選實施例中，穩定劑取自碳水化合物，包括但不局限于環糊精、乳糖、海藻糖、甘露醇、殼聚糖中的一種或一種以上。堿性磷酸酶納微顆粒的分散增強方法可采用分散增強劑，分散增強劑包括但不局限于亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、丙氨酸或甘氨酸中的一種或一種以上。此外，還可添加致孔劑，致孔劑可以使納微顆粒在一定溫度下易分解化合物，此處致孔劑包括但不局限于碳酸氫銨、碳酸銨等。本發明還揭示了一種用于制備上述堿性磷酸酶納微顆粒的制備方法，如圖I所示，包括以下步驟，SI :將穩定劑與分散劑按一定比例混合,攪拌溶解,配制成混合溶液；S2 :將在步驟SI中所配得的混合溶液中加入一定比例量的堿性磷酸酶，攪拌溶解，充分混合，配制成納米噴霧干燥預備溶液；S3 :將在步驟S2中所得到的納米噴霧干燥預備溶液，通過納米噴霧干燥技術噴霧干燥而成。優選地，在步驟SI中，穩定劑與分散劑的質量比為I : 10(Tl00:l。
優選地，在步驟S2中，穩定劑、分散劑和堿性磷酸酶的質量比為1:10(Tl00: I。優選地，在步驟S2中，所得到的納米噴霧干燥預備溶液的濃度為I X 10-5 IOOg/
mLo優選地，在步驟S3中，通過納米噴霧干燥技術噴霧干燥的工藝流程包括，將在步驟S2中所得到的預備溶液，經納米噴霧干燥儀霧化，在噴霧干燥筒內被干燥成納微顆粒。其中，工藝流程的工藝參數為噴霧干燥筒的進口溫度為5(Tl20°C，噴霧干燥筒的氣體流速為8(Tl60L/min，噴頭的噴帽孔徑為4 y m、5. 5 y m或7 y m。通過上述制備方法，所制得的堿性磷酸酶納微顆粒的產率為20、8%，平均顆粒粒徑為0. f IOiI m，生物活性藥物的活性保持率為5(Tl00%，體外肺沉積效率為10、8%。
實施例I稱取0. 60g ^ -環糊精和0. IOg堿性磷酸酶至IOOmL超純水,冰浴攪拌至完全溶解，用0. 45 U m孔徑的濾膜過濾，得到納米噴霧干燥預備溶液。然后將所得到的納米噴霧干燥預備溶液進行納米噴霧干燥，納米噴霧干燥的工藝參數設置為噴霧干燥筒的進口溫度為100°C，噴霧速率為100%，進料速率模式為I，氣體流速130L/min，噴帽孔徑4iim。經上述工藝制得的堿性磷酸酶納微顆粒的檢測表征結果堿性磷酸酶納微顆粒產率為75% ;酶活保持率為65% ；90%的微粒粒徑分布在0. 40-3. 50 u m ;掃描電鏡觀察顯示平均粒徑分布在2 ii m左右，形貌為光滑的圓球體；體外肺沉積效率為21. 59%。實施例2稱取0. 33g ^ -環糊精、0. 27g L-亮氨酸和0. IOg堿性磷酸酶至IOOmL超純水，冰浴攪拌至完全溶解，用0. 45 y m孔徑的濾膜過濾，得到納米噴霧干燥預備溶液。然后將所得到的納米噴霧干燥預備溶液進行納米噴霧干燥，納米噴霧干燥的工藝參數設置為噴霧干燥筒的進口溫度為100°C，噴霧速率為100%，進料速率模式為I，氣體流速130L/min，噴帽孔徑 4 y m0經上述工藝制得的堿性磷酸酶納微顆粒的檢測表征結果產率為68% ;酶活保持率為95% ；90%的微粒粒徑分布在0. 45-3. OOum ;掃描電鏡觀察顯示平均粒徑分布在I y m左右，形貌為光滑和褶皺相間的圓球體；體外肺沉積效率為86%。實施例3稱取Ig乳糖和IOmg堿性磷酸酶至IOOmL超純水，冰浴攪拌至完全溶解，用
0.45 Pm孔徑的濾膜過濾，得到納米噴霧干燥預備溶液。然后將所得到的納米噴霧干燥預備溶液進行納米噴霧干燥，納米噴霧干燥的工藝參數設置為噴霧干燥筒的進口溫度為60°C，噴霧速率為100%，進料速率模式為I，氣體流速150L/min，噴帽孔徑5. 5 y m。經上述工藝制得的堿性磷酸酶納微顆粒的檢測表征結果產率為46% ;酶活保持率為99% ；90%的微粒粒徑分布在I. 05-9. 55 ii m ;掃描電鏡觀察顯示平均粒徑分布在
3.50 um左右，形貌為光滑的圓球體；體外肺沉積效率為18%。實施例4稱取IOmg乳糖和Ig堿性磷酸酶至IOOmL超純水，冰浴攪拌至完全溶解，用
0.45 Pm孔徑的濾膜過濾，得到納米噴霧干燥預備溶液。然后將所得到的納米噴霧干燥預備溶液進行納米噴霧干燥，納米噴霧干燥的工藝參數設置為噴霧干燥筒的進口溫度為60°C，噴霧速率為100%，進料速率模式為I，氣體流速150L/min，噴帽孔徑5. 5 y m。
經上述工藝制得的堿性磷酸酶納微顆粒的檢測表征結果產率為90% ;酶活保持率為51% ；90%的微粒粒徑分布在0. 95-8. 73 um ;掃描電鏡觀察顯示平均粒徑分布在3 y m左右；體外肺沉積效率為38%。實施例5稱取0. 50g海藻糖、0. IOg色氨酸和0. IOg堿性磷酸酶至IOOmL超純水，冰浴攪拌至完全溶解，用0. 45 孔徑的濾膜過 濾，得到納米噴霧干燥預備溶液。然后將所得到的納米噴霧干燥預備溶液進行納米噴霧干燥，納米噴霧干燥的工藝參數設置為噴霧干燥筒的進口溫度為120°C，噴霧速率為100%，進料速率模式為1，氣體流速80L/min，噴帽孔徑7 y m。經上述工藝制得的堿性磷酸酶納微顆粒的檢測表征結果產率為70% ;酶活保持率為82% ；90%的微粒粒徑分布在0. 46-3. 30 u m ;掃描電鏡觀察顯示平均粒徑分布在I U m左右；體外肺沉積效率為75%。實施例6稱取0. 20g殼聚糖、0. IOg精氨酸和0. IOg堿性磷酸酶至IOOmL超純水，冰浴攪拌至完全溶解，用0. 45 孔徑的濾膜過濾，得到納米噴霧干燥預備溶液。然后將所得到的納米噴霧干燥預備溶液進行納米噴霧干燥，納米噴霧干燥的工藝參數設置為噴霧干燥筒的進口溫度為120°C，噴霧速率為100%，進料速率模式為1，氣體流速80171^11，噴帽孔徑411111。經上述工藝制得的堿性磷酸酶納微顆粒的檢測表征結果產率為59% ;酶活保持率為78% ；90%的微粒粒徑分布在0. 43-2. 62 u m ;掃描電鏡觀察顯示平均粒徑分布在I U m左右；體外肺沉積效率為81%。實施例7稱取2g甘露醇、0. 50g異亮氨酸和Ig堿性磷酸酶至IOOmL超純水,冰浴攪拌至完全溶解，用0. 45 孔徑的濾膜過濾，得到納米噴霧干燥預備溶液。然后將所得到的納米噴霧干燥預備溶液進行納米噴霧干燥，納米噴霧干燥的工藝參數設置為噴霧干燥筒的進口溫度為100°C，噴霧速率為100%，進料速率模式為1，氣體流速120L/min，噴帽孔徑7iim。經上述工藝制得的堿性磷酸酶納微顆粒的檢測表征結果產率為86% ;酶活保持率為91% ；90%的微粒粒徑分布在I. 55-10. 24 um ;掃描電鏡觀察顯示平均粒徑分布在4 y m左右；體外肺沉積效率為15%。以上實施例中的堿性磷酸酶納微顆粒是用包括以下步驟的方法表征的(I)將收集的堿性磷酸酶納微顆粒通過制備前后稱取質量計算產率，產率范圍為20 98%。(2)將堿性磷酸酶顆粒溶于二乙醇胺-鹽酸緩沖液(PH9. 8)，與對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)溶液在37°C下反應lmin，用紫外可見分光光度計在405nm處讀取吸光度值，根據標準曲線計算得到堿性磷酸酶酶活保持率。(3)將堿性磷酸酶納微顆粒利用激光衍射法粒度儀測量空氣動力學粒徑分布，結合冷場發射掃描電鏡觀察，粒徑分布為0. f 10 ym，如圖2所示為堿性磷酸酶納微顆粒粒徑分布圖，圖3所示為堿性磷酸酶納微顆粒電鏡觀察圖。(4)取一定量堿性磷酸酶納微顆粒裝入干粉吸入器制成干粉吸入劑，在一定的吸氣流速下，干粉微粒隨氣流遞送至體外肺模擬吸入裝置的微粉多級碰撞收集器進行碰撞收集。微粒根據粒徑大小沉積在不同層級上，收集沉積在給藥器、人工喉、預分離器和碰撞收集器不同層級的干粉吸入劑樣品，通過高效液相色譜儀或紫外可見分光光度計分析定量，計算各部分藥物沉積效率，得到體外肺沉積效率為10、8%。本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒，通過將堿性磷酸酶在輔料的合理配比作用下配制而成，并經納米噴霧干燥制備成粒徑小、均一、具有良好分散性能的納微顆粒，使堿性磷酸酶藥物不但能夠有效維持其生物活性，且具有優異的肺吸入效率。本發明所揭示的堿性磷酸酶納微顆粒，適用于治療由于堿性磷酸酶缺乏引起的多種疾病，比如，低磷酸酯酶癥、由內毒素引起的敗血癥，且使用過程中無胃腸道降解作用、無肝臟首過效應，藥物吸收迅速、起效快，給藥劑量低、毒副作用小，患者順應性好。對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。 對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
權利要求
1.一種堿性磷酸酶納微顆粒，包括輔料和藥物，其特征在于所述藥物為堿性磷酸酶，所述輔料和所述藥物的質量比為i:io(Tioo:i，所述輔料包括穩定劑和分散劑，所述穩定劑與所述分散劑的質量比為1:10(T100:1，所述納微顆粒的產率為20、8%，平均顆粒粒徑為0.flOilm，生物活性藥物的活性保持率為50 100%，體外肺沉積效率為10 98%。
2.根據權利要求I所述的堿性磷酸酶納微顆粒，其特征在于所述穩定劑取自碳水化合物、氨基酸或其混合物，包括環糊精、乳糖、海藻糖、甘露醇、殼聚糖中的一種或一種以上。
3.根據權利要求I所述的堿性磷酸酶納微顆粒，其特征在于所述分散劑取自亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、丙氨酸或甘氨酸中的一種或一種以上。
4.一種用于制備I至3任一權利要求所述的堿性磷酸酶納微顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟， 51:將所述穩定劑與所述分散劑按一定比例混合，攪拌溶解，配制成混合溶液； 52:將在步驟SI中所配得的混合溶液中加入一定比例量的堿性磷酸酶，攪拌溶解，充分混合，配制成納米噴霧干燥預備溶液； 53:將在步驟S2中所得到的納米噴霧干燥預備溶液，通過納米噴霧干燥技術進行噴霧干燥。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟SI中，所述穩定劑與所述分散劑的質量比為I: KKTlOO: I。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟S2中，所述穩定劑、分散劑和所述堿性磷酸酶的質量比為I : 100 100:1。
7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟S3中，通過納米噴霧干燥技術噴霧干燥的工藝流程包括，將在步驟S2中所得到的預備溶液，經納米噴霧干燥儀霧化，在噴霧干燥筒內被干燥成納微顆粒。
8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所制得的堿性磷酸酶納微顆粒可以制成肺吸入制劑，包括粉霧劑、氣霧劑或噴霧劑。
全文摘要
一種堿性磷酸酶納微顆粒，包括輔料和藥物，所述藥物為堿性磷酸酶，所述輔料和所述藥物的質量比為1:100~100:1，所述輔料包括穩定劑和分散劑，所述穩定劑與所述分散劑的質量比為1:100~100:1，所述納微顆粒的產率為20~98%，平均顆粒粒徑為0.1~10μm，生物活性藥物的活性保持率為50~100%，體外肺沉積效率為10~98%。該納微顆粒粒徑小、均一、具有良好分散性能，可以通過多種肺吸入制劑形式遞送入肺，不但能夠有效維持藥物的生物活性，具有優異的肺吸入效率，使用過程中無胃腸道降解作用、無肝臟首過效應，非侵入治療方式使得患者順應性好。
文檔編號A61K38/46GK102743339SQ20121025398
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者李浩瑩, 郭靜 申請人:蘇州大學