RNAi介導的Gremlin抑制用于治療眼內壓相關的狀況的制作方法

專利名稱：RNAi介導的Gremlin抑制用于治療眼內壓相關的狀況的制作方法
技術領域：
本發明涉及干擾RNA組合物的領域，所述組合物用于抑制眼內壓(IOP)相關狀況中蛋白質gremlin的表達，所述狀況為例如高眼壓和青光眼，包括正常眼壓性青光眼和開角型青光眼。
背景技術：
青光眼是一組異質性視神經疾病，它們共有某些臨床特征。青光眼中視力的喪失是由于神經視網膜中視網膜神經節細胞的選擇性死亡，其在臨床上被診斷為視野的特征性改變、神經纖維層缺陷，和視神經頭(ONH)的進行性杯形彎曲。青光眼發展的一個主要危險因素是存在眼高壓(升高的眼內壓(IOP))。需要足夠的眼內壓來維持眼的形狀和提供壓力梯度以允許房水向無血管的角膜和晶狀體的流動。IOP水平也可以涉及正常眼壓性青光眼(NTG)的病理，如從IOP降低藥療法受益的患者所證實。一旦進行中心角膜厚度的調節到NTG患者中的IOP讀數，發現這些患者許多是眼高壓的。與青光眼相關的升高的IOP是由于小梁網(I'M)中升高的房水流出阻力，小梁網是位于眼前房的虹膜一角膜角中的小的特化組織。TM的青光眼改變包括TM細胞的喪失和細胞外碎片的沉積和積累，所述碎片包括蛋白質性質的斑塊樣物質。此外，在青光眼ONH中也發生改變。在青光眼性眼中，在ONH膠質細胞中發生形態和流動性改變。在應答升高的IOP和/或暫時缺血損傷時，ONH細胞外基質的組成改變并且神經膠質細胞和視網膜神經節細胞軸突形態發生改變。原發性青光眼由眼內液流動的失調引起，所述眼內液具有解剖學或生理學基礎。繼發性青光眼由于對眼的損傷或創傷或者現有疾病引起。原發性開角型青光眼(POAG)也稱作慢性或單純性青光眼，代表所有原發性青光眼的多數。POAG的特征是小梁網的變性，導致對從眼的液體排出的異常高的阻力。此類阻力結果是IOP的升高，需要IOP來驅動眼正常產生的液體穿過升高的阻力。PCT 申請號 PCT/US02/35251 (于 2003 年 7 月 10 日以 TO03/055443 公開)涉及青光眼的早期診斷、治療青光眼及對此有用的化合物的鑒定。其中提供了治療青光眼的方法，其通過將組合物施用于有此需要的患者，所述組合物包含由至少一種選自下列的化合物組成的序列BMP2激動劑、BMP4激動劑、BMP5激動劑、BMP7激動劑、SmadI-5激動劑、脊索發生素拮抗劑、gremlin拮抗劑和促濾泡素抑制素拮抗劑。PCT公開W003/055443并未提供使用干擾RNA的教導或建議。當前的抗青光眼療法包括通過使用房水形成的抑制劑或增強眼色素層鞏膜流出的試劑、激光小梁成形術、或小梁切除術來降低IOP，所述小梁切除術屬于增強排出的過濾外科手術。藥物抗青光眼方法已顯示出多種不期望的副作用。例如，縮瞳藥例如毛果蕓香堿可引起目昏和其它不利的視覺副作用。全身施用的碳酸酐酶抑制劑(CAIs)也可引起惡心、消化不良、疲勞和代謝性酸中毒。此外，某些￠-阻斷劑已逐漸變為與嚴重的肺部副作用相關，這歸因于它們對肺部組織中￠-2受體的影響。擬交感神經藥引起心博過速、心律失常和高血壓。此類副作用可導致降低的患者依從性或導致治療的終止。另外，目前IOP降低療法的功效是相對短效的，每天需要反復給藥，且在一些情況下，功效隨時間降低。考慮到青光眼中高眼壓的重要性，以及現有治療方法的不足，將期望有一種治療高眼壓的改良的方法，該方法將解決其進展的根本原因。發明概述本發明提供了沉默GREMl mRNA表達從而去除gremlin對骨形態發生蛋白(bone·morphogenic protein)的拮抗作用的干擾RNA,所述骨形態發生蛋白阻斷至少一些與IOP升高有關的某些因子(例如TGF P )。因此，沉默GREMlm RNA表達導致患有IOP相關狀況的患者中眼內壓的降低。本發明的干擾RNA對治療患有IOP相關狀況，包括高眼壓和青光眼例如正常眼壓性青光眼和開角型青光眼的患者是有用的。本發明還提供了減弱受試者中IGFlR mRNA表達的方法。在一方面，該方法包括對受試者施用包含有效量的干擾RNA和藥學上可接受的載體的組合物，所述干擾RNA具有19到49個核苷酸的長度。在另一方面，施用于受試者的眼用于減弱人中GREMl的表達。在一方面，本發明提供了減弱受試者眼中GREMl mRNA表達的方法，其包括對受試者的眼睛施用干擾RNA，該干擾RNA包含能識別對應于SEQ ID NO: I的mRNA的部分的區域，所述SEQ ID NO: I是編碼GREMl的有義cDNA序列(GenBank檢索號NM0_13372)，其中GREMlmRNA的表達因而被減弱。另外，本發明提供了治療有此需要的受試者中IOP相關狀況的方法，其包括對受試者的眼睛施用干擾RNA，該干擾RNA包含能識別對應于SEQ ID NO: I的部分的mRNA部分的區域，其中GREMl mRNA的表達因而被減弱。在某些方面，設計本發明的干擾RNA用來靶定對應于SEQ ID NO: I的部分的mRNA，其中所述部分包含 SEQ ID NO: I 的核苷酸 402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或689。在特別的方面，“SEQ ID NO: I的部分”的長度是約19至約49個核苷酸。在某些方面，本發明的干擾RNA具有約19至約49個核苷酸的長度。在其它方面，干擾RNA包含有義核苷酸鏈和反義核苷酸鏈，其中每條鏈具有與另一條鏈至少19個核苷酸的至少接近完全連續互補的區域，其中反義鏈可識別對應于SEQ ID NO: I的部分的GREMlmRNA部分，且具有與所述GREMl mRNA部分至少19個核苷酸的至少接近完全連續互補的區域。有義和反義鏈可通過接頭序列連接，所述接頭序列允許有義和反義鏈彼此雜交從而形成如此處所述的發夾環結構。
在再一方面，本發明的干擾RNA是單鏈干擾RNA，且其中單鏈干擾RNA識別對應于SEQ ID NO: I的部分的mRNA部分。在某些方面，干擾RNA具有與對應于SEQ ID NO: I的部分的mRNA部分至少19個核苷酸的至少接近完全連續互補的區域。在其它方面，SEQID NO: I 的部分包含 SEQ ID N0:1 的核苷酸 402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或 689。在其它方面，本發明的干擾RNA包含(a)至少13個連續核苷酸的區域，其與對應于SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:13_SEQ ID N0:98中任一個的mRNA的3’末端的倒數第二位 的13個核苷酸有至少90%序列互補性、或者至少90%序列同一性；(b)至少14個連續核苷酸的區域，其與對應于SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:13_SEQ ID NO:98中任一個的mRNA的3’末端的倒數第二位的14個核苷酸有至少85%序列互補性、或者至少85%序列同一性；或者(c)至少15、16、17或18個連續核苷酸的區域，其分別與對應于SEQ ID N0:2和SEQ IDNO: 13-SEQ ID NO:98中任一個的mRNA的3’末端的倒數第二位的15、16、17或18個核苷酸有至少80%序列互補性、或者至少80%序列同一性；其中GREMl mRNA的表達因而得以減弱。在另外的方面，經局部、玻璃體內、經鞏膜(transcleral)、眼周、結膜、眼球筋膜下(subtenon)、前房內(intracameral)、視網膜下、結膜下、眼球后、或小管內的途徑將本發明的干擾RNA或包含本發明的干擾RNA的組合物施用于受試者。干擾RNA或組合物可通過例如干擾RNA表達載體的體內表達來施用。在某些方面，可通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內、吸入、肌內、鼻內、眼內、肺內、靜脈內、腹膜內、經鼻、眼、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或者經皮施用干擾RNA或組合物。在一方面，本發明的干擾RNA分子是分離的。術語“分離的”是指干擾RNA脫離了其總的天然環境。本發明進一步提供了治療有此需要的受試者中IOP相關狀況的方法，包括向受試者施用包含雙鏈siRNA分子的組合物，所述siRNA分子經RNA干擾下調了 GREMl基因的表達，其中siRNA分子的每條鏈獨立地為約19到約27個核苷酸長度；并且該siRNA分子的一條鏈包含具有與對應于GREMl基因的mRNA的實質互補性的核苷酸序列，從而siRNA分子通過RNA干擾指導mRNA的切割。在某些方面，通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內、吸入、肌內、鼻內、眼內、肺內、靜脈內、腹膜內、經鼻、眼、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或經皮途徑施用siRNA分子。本發明進一步提供用于向受試者除第一種干擾RNA外施用第二干擾RNA。第二種干擾RNA可與第一種干擾RNA靶定相同的mRNA靶基因，或可靶定不同的基因。此外，可以類似的方式施用第三、第四或第五等等干擾RNA。如此處所述的任一實施方案在制備用于減弱GRHMl mRNA表達的藥物中的用途也是本發明的實施方案。本發明特別優選的實施方案將從下文對某些優選實施方案的更詳細描述和權利要求變得顯而易見。附圖
簡述圖I 顯示了用 Gremlin siRNA # I、# 2、# 3 和# 4 轉染的 GTM-3 細胞中 GremlinmRNA表達的qRT-PCR分析的結果，每種siRNA為10nM、InM和0. InM。圖2 顯示了用 Gremlin siRNA # I、# 2、# 3 和# 4 轉染的 GTM-3 細胞中 Gremlin蛋白質表達的蛋白質印跡分析的結果，每種siRNA為10nM、lnM和0. InM。發明詳述本文顯示的細節是通過實例并且僅僅用于闡明性討論本發明的優選實施方案的目的并且是為了提供被認為是最有用的和容易理解本發明的多種實施方案的原理和概念方面的原因而給出。在這方面，不試圖比基本理解本發明、附圖描述和/或實施例所必須的更詳細的本發明的結構細節，使得本領域技術人員對于實踐中怎樣體現本發明的幾種形式是顯而易見的。下面的定義和解釋意在在將來的任何構造中起控制作用，除非在下面的實施例中清楚并且明確地修飾，或者當所述含義的應用使得任何構造無意義或者基本上無意義時。對于術語的構造將使得它無意義或基本上無意義的情況，該定義將從Webster’s Dictionary (第三版)或本領域技術人員所知的詞典例如Oxford Dictionaryof Biochemistry Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford UniversityPress, Oxford, 2004)得到。如此處所用的，除非另外指出，所有百分比都是重量百分比。如此處所用的且除非另外指出，術語“一個”是指“一個”、“至少一個”或“一個或多個”。除非通過上下文另外需要，此處所用的單數術語將包括復數，且復數的術語將包括單數。在某些實施方案中，本發明涉及干擾RNA抑制gremlin (GREMDmRNA表達的用途。Gremlin是骨形態發生蛋白(BMP)拮抗劑的CAN家族的成員。該家族的所有成員含有八成員的環形胱氨酸結。幾種生長因子受體配體，包括BMPs、TGFP和TOGF，也屬于胱氨酸結超家族。BMPs 2、4、5和I ;BMP受體Rla、Rlb和R2 ;以及BMP拮抗劑gremlin、bambi、和脊索發生素表達于小梁網(TM)中(PCT申請號PCT/US02/35251，同前；Wordinger等人.，Mol.Vision 2002,8:241-250)。BMP信號阻斷了至少一些與增高的IOP相關的TM功能(例如，增高的纖連蛋白分泌)中TGFP誘導的變化。Gremlin拮抗了 BMP對TGFP信號轉導的該效果。而且，青光眼TM細胞中gremlin表達升高(PCT申請號PCT/US02/35251，同前)，且gremlin提高了培養的人眼睛中的I0P。因此，此處提供沉默gremlin表達作為在高眼壓和青光眼相關的眼睛疾病的治療中降低IOP的有效方法。根據本發明，抑制GREMlmRNA的表達有效減少了 gremlin的作用。而且,夕卜源提供或內源表達的如此處所述的干擾RNA在沉默GREMlmRNA中是特別有效的。RNA干擾(RNAi)是用雙鏈RNA(dsRNA)沉默基因表達的一種過程。不希望被理論束 縛，RNAi以RNA酶III樣酶切丁酶將較長dsRNA切割成小的干擾RNA(siRNA)開始。siRNA是dsRNA，其長度通常為約19到28個核苷酸，或者20到25個核苷酸，或者21到22個核苷酸，并且通常含有2個核苷酸的3’突出端，和5’磷酸和3’羥基末端。siRNA的一條鏈摻入到稱作RNA誘導性沉默復合物(RISC)的核糖核蛋白復合物。RISC使用該siRNA鏈鑒定與摻入的siRNA鏈至少部分互補的mRNA分子，然后切割這些靶mRNA或者抑制它們的翻譯。因此，摻入RISC的siRNA鏈被稱作引導鏈或者反義鏈。另一 siRNA鏈稱作過客鏈或者有義鏈，被從siRNA清除并且與靶標mRNA至少部分同源。本領域技術人員將認識到siRNA的任一鏈可以摻入到RISC中并且作為引導鏈發揮功能。然而，siRNA設計(例如，在期望的引導鏈的5’末端的降低的siRNA雙鏈體穩定性)可以有利于期望的引導鏈摻入到RISC中。
siRNA的反義鏈是siRNA的活性引導劑，因為反義鏈摻入到RISC中，從而允許RISC鑒定與該反義siRNA至少部分互補的靶標mRNA用于切割或翻譯抑制。具有與引導鏈至少部分互補性的序列的mRNA的RISC介導的切割導致該mRNA和該mRNA編碼的對應的蛋白質的穩態水平降低。備選地，RISC還可通過翻譯阻抑降低對應蛋白質的表達而不用切割革巴標mRNA。本發明的干擾RNA對于靶標mRNA的切割似乎以催化的方式作用，即，干擾RNA能夠以亞化學計量的量實現靶標mRNA的抑制。與反義療法相比，需要顯著較少的干擾RNA來在此類切割條件下提供治療效果。在某些實施方案中，本發明提供在患有IOP相關狀況的患者中利用干擾RNA抑制GREMl靶mRNA表達從而降低GREMl水平的方法。根據本發明，外源提供或內源表達的干擾RNA實現了在眼組織中GREMl表達的沉默。如此處所用的短語“減弱mRNA的表達”，是指施用或表達一定量的干擾RNA (例如，siRNA)以通過mRNA切割或者通過翻譯的直接抑制來減少靶標mRNA向蛋白質的翻譯。如此處所述的術語“抑制”、“沉默”和“減弱”指的是與不存在本發明的干擾RNA時靶mRNA或對應蛋白質的表達相比，IG mRNA或對應蛋白質的表達可檢測的降低。IE mRNA或對應蛋白質表達的降低通常被稱作“擊倒”且相對于施用或表達非尋靶對照RNA(即，非尋靶對照siRNA)后存在的水平來報告。此處的實施方案預計包括和50%到100%之間的量的表達擊倒。然而，不必為了本發明的目的實現此類擊倒水平。通常通過用定量聚合酶鏈式反應(qPCR)擴增測量mRNA水平或者通過蛋白質印跡或者酶聯免疫吸附測定(ELISA)測量蛋白質水平來評估擊倒。分析蛋白質水平提供了mRNA切割以及翻譯抑制的評估。用于測量擊倒的其他技術包括RNA溶液雜交、核酸酶保護、northern雜交、用微陣列進行基因表達監測、抗體結合、放射免疫測定法，和熒光激活的細胞分析。由本發明的干擾RNA分子引起的GREMl的減弱表達可通過例如觀察IOP相關癥狀的改善，例如眼內壓的改善、視野損失的改善、或視神經頭變化的改善而在人或其它哺乳動物中得以推斷。可如下在體外評估干擾RNA擊倒例如HeLa細胞中內源性靶基因表達水平的能力。在轉染前24小時將HeLa細胞平板接種在標準生長培養基(例如，補充了 10%胎牛血清的DMEM)中。使用例如Dharmafect I (Dharmacon, Lafayette, CO)根據生產商的教導以0. InM到IOOnM的干擾RNA濃度進行轉染。將Si CONTROL 非尋靶siRNA # I和siCONTROL 親環蛋白B siRNA (Dharmacon)分別用作陰性和陽性對照。在轉染后24小時通過qPCR評估靶mRNA水平和親環蛋白BmRNA (PPIB，NM_000942)水平，使用例如優選覆蓋靶位點的TAQ.MAJN 基因表達測定法(Applied Biosystems, Foster City, CA) 當轉染效率是100%時，陽性對照siRNA給出了親環蛋白B mRNA的基本完全的擊倒。因此，通過參考轉染了親環蛋白B mRNA的細胞中親環蛋白B mRNA水平來用轉染效率校正靶mRNA擊倒。可以在轉染后約72小時(實際的時間取決于蛋白質更新率)通過例如蛋白質印跡評估靶蛋白水平。用于從培養的細胞分離RNA和/或蛋白質的標準技術是本領域技術人員已知的。為了降低非特異性、脫靶效應的機會，使用干擾RNA的最低可能的濃度，其將產生希望水平的靶基因表達擊倒。人角膜上皮細胞或其它人眼細胞系也可用于評估干擾RNA對內源靶基因的擊倒水平的能力。在一個實施方案中，施用靶定GRffll mRNA的單一干擾RNA以降低GREMl水平。在其他實施方案中，施用靶定GREMl mRNA的兩種或多種干擾RNA以降低GREMl水平。GenBank數據庫以檢索號NM_013372提供了 GREMl的DNA序列，在“序列表”中以SEQ ID NO: I提供。SEQ ID NO: I提供了對應于編碼gremlin的mRNA的DNA的有義鏈序列(只是用“T”堿基代替“U”堿基)。GREMl的編碼序列為核苷酸160-714。上述GREMl mRNA序列的等同物是其選擇性剪接形式、等位基因形式、同工酶或者同族序列。同族序列是來自另一哺乳動物物種的與SEQ ID NO: I同源的gremlin mRNA( BP,·直向同源物)。在某些實施方案中，需要治療IOP相關狀況或者處于發展IOP相關狀況的危險中的“受試者”是具有與gremlin的不希望的或者不合適的表達或活性相關的IOP相關狀況或者處于有IOP相關狀況的危險中的人或者其他哺乳動物。與此類病癥相關的眼結構可以包括例如，眼、視網膜、脈絡膜、晶狀體、角膜、小梁網、虹膜、視神經、視神經頭、鞏膜、前段和后段、或者睫狀體。受試者也可以是眼細胞、細胞培養物、器官或者離體(ex vivo)器官或組織或細胞。如此處所用的“I0P相關狀況”包括眼內高壓和與升高的眼內壓(IOP)相關的眼疾病，例如青光眼，包括正常眼壓性青光眼和開角型青光眼。除非另有標注，如此處所用的術語“siRNA”指的是雙鏈干擾RNA。通常，本發明的siRNA是包含兩條核苷酸鏈的雙鏈核酸分子，每條鏈具有約19至約28個核苷酸(即，約19、
20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸)。當指雙鏈干擾RNA時，術語“具有19至49個核苷酸長度的干擾RNA”指反義和有義鏈獨立地具有約19至約49個核苷酸的長度，包括其中有義和反義鏈通過接頭分子相連接的干擾RNA分子。除了 siRNA分子,其它干擾RNA分子和RNA樣分子可與RISC相互作用并沉默基因表達。可與RISC相互作用的其它干擾RNA分子的例子包括短發夾RNA (shRNA)、單鏈siRNA、微小RNA (miRNA)和切丁酶底物27聚體雙鏈體。可以與RISC相互作用的RNA樣分子的例子包括siRNA、單鏈siRNA、微小RNA和含有一個或多個化學修飾的核苷酸、一個或多個非核苷酸、一個或多個脫氧核糖核苷酸、和/或一個或多個非磷酸二酯鍵的shRNA分子。將可以與RISC相互作用并且參與基因表達中RISC介導的改變的所有RNA或RNA樣分子都稱作“干擾RNA”或“干擾RNA分子”。因此，siRNA、單鏈siRNA、shRNA,miRNA和切丁酶底物27聚體雙鏈體是“干擾RNA”或“干擾RNA分子”的子集。已經發現單鏈干擾RNA實現mRNA沉默，盡管效率低于雙鏈siRNA。因此，本發明的實施方案也提供了單鏈干擾RNA的施用，所述單鏈干擾RNA具有與SEQ ID NO: I的部分至少接近完全連續互補的區域。與上面引用的雙鏈干擾RNA—樣，單鏈干擾RNA具有約19到約49個核苷酸的長度。單鏈干擾RNA具有5’磷酸或者在5’位置原位或體內磷酸化。術語“5’磷酸化的”用于描述例如多核苷酸或寡核苷酸，其具有通過酯鍵連接到該多核苷酸或寡核苷酸的5’末端的糖(例如，核糖、脫氧核糖或者它們的類似物)的C5羥基的磷酸基團。如此處所述參考雙鏈干擾RNA，單鏈干擾RNA可通過化學合成或者通過體外轉錄或者從載體或表達盒內源表達。5’磷酸基團可以通過激酶加入，或者5’磷酸可以是RNA的核酸酶切割的結果。發夾干擾RNA是單個分子(例如，單個寡核苷酸鏈)，其在莖環或發夾結構(例如，shRNA)中包含干擾RNA的有義鏈和反義鏈。例如，shRNA可以從DNA載體表達，所述載體中，編碼有義干擾RNA鏈的DNA寡核苷酸通過短的間隔區連接到編碼反向互補的反義干擾RNA鏈的DNA寡核苷酸。如果選擇的表達載體需要，那么可以加入3’末端T和形成限制性位點的核苷酸。所得的RNA轉錄物自身向后折疊形成莖環結構。除非另外指出，此處引用的核酸序列以5’到3’的方向書寫。如此處所用的術語“核酸”指DNA或RNA或其修飾形式，其包含DNA中存在的嘌呤或嘧啶堿基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鳥嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”)或者RNA中的嘌呤或嘧啶堿基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶 “C”、鳥嘌呤“G”、尿嘧啶“U”)。本文提供的干擾RNA可以包含“T”堿基，尤其在3 ’末端，盡管“T”堿基不是天然存在于RNA中。“核酸”包括術語“寡核苷酸”和“多核苷酸”并且可以指單鏈分子或雙鏈分子。雙鏈分子通過A和T堿基、C和G堿基，和A和U堿基之間的沃森-克里克堿基配對形成。雙鏈分子的鏈可以相互部分、基本上或者完全互補并且將形成雙鏈體雜交分子，其成鍵強度取決于堿基序列的性質和互補性程度。如此處所用的術語“DNA靶序列”是指用來衍生本發明的干擾RNA的DNA序列。如此處所用的術語“RNA靶序列”、“干擾RNA靶序列”和“RNA靶”是指GRHMl mRNA或GRHMlmRNA序列的部分，其可由本發明的干擾RNA識別，從而干擾RNA可沉默如此處所述的GREMl基因表達。“RNA靶序列”、“siRNA靶序列”和“RNA靶”通常是與DNA序列的部分相對應的mRNA序列。mRNA序列可容易地從對應于DNA序列的序列推導出。例如,SEQ ID NO: I提供了對應于GREMl mRNA的DNA的有義鏈序列。mRNA序列與DNA有義鏈序列相同，只是用“U”堿基替換了 “T”堿基。因此，GREMl的mRNA序列從SEQ ID NO: I中已知。對應于SEQ IDNO: I的mRNA中的靶序列可位于mRNA的5’或3’非翻譯區以及mRNA的編碼區中。在某些實施方案中，利用可獲得的設計工具來選擇靶mRNA序列內的干擾RNA靶序列(例如，siRNA靶序列)。然后在體外通過轉染表達靶mRNA的細胞，隨后如此處所述進行擊倒評價來測試對應于GREMl靶序列的干擾RNA。可在體內利用如此處所述的動物模型進一步評估干擾RNA。提供了用于選擇siRNA的祀序列的技術，例如，通過由Tuschl, T.等人，"ThesiRNA User Guide, 〃(2004 年 5 月 6 日修訂，可以在 Rockefeller University 網站獲取；技術公報 #506，〃siRNA Design Guidelines, "Ambion Inc (Ambion 的網站)；和其他基于網頁的設計工具，例如在 Invitrogen、Dharmacon、Integrated DNA TechnoIogies>Genscript或Proligo網站提供。最初的搜索參數可以包括35%到55%之間的G/C含量和19到27個核苷酸的siRNA長度。靶序列可以位于mRNA的編碼區或者5’或3’非翻譯區中。靶序列可用于衍生干擾RNA分子，例如此處所述的那些。表I列出了 SEQ ID NO: I的GREM DNA靶序列的例子，從所述靶序列以上述方式設計本發明的siRNA。GREMl編碼gremlin,如上所述。表I 用于siRNA的GREMl靶序列
權利要求
1.治療需要其的患者中IOP相關狀況的方法，其包括對該患者施用干擾RNA分子，該干擾RNA分子通過RNA干擾減弱GRffll mRNA的表達。
2.權利要求I的方法，其中所述干擾RNA分子是雙鏈的且每條鏈獨立地為約19至約27個核苷酸長度。
3.權利要求2的方法，其中每條鏈獨立地為約19個核苷酸至約25個核苷酸長度。
4.權利要求2的方法，其中每條鏈獨立地為約19個核苷酸至約21個核苷酸長度。
5.權利要求2的方法，其中所述有義鏈和反義鏈通過接頭連接從而形成shRNA，其可減弱患者中GRHMl mRNA的表達。
6.權利要求2的方法，其中所述干擾RNA分子具有平頭末端。
7.權利要求2的方法，其中所述干擾RNA分子的至少一條鏈包含3’突出端。
8.權利要求7的方法，其中所述3’突出端包含約I至約6個核苷酸。
9.權利要求8的方法，其中所述3’突出端包含2個核苷酸。
10.權利要求I的方法，其中通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內、吸入、肌內、鼻內、眼內、肺內、靜脈內、腹膜內、經鼻、眼、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或經皮途徑施用所述干擾RNA分子。
11.權利要求I的方法，其中通過在體內從能夠表達干擾RNA分子的表達載體表達來施用所述干擾RNA分子。
12.權利要求I的方法，其中所述患者具有IOP相關狀況或處于發展IOP相關狀況的危險中。
13.權利要求12的方法，其中所述IOP相關狀況是青光眼。
14.權利要求I的方法，其中所述干擾RNA分子識別對應于SEQID N0:2和SEQ IDN0:13-SEQ ID NO:98 中任一個的 GREMl mRNA 的部分。
15.權利要求I的方法，其中所述干擾RNA分子識別GREMlmRNA的部分，其中該部分包含 SEQ ID NO: I 的核苷酸 402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或 689。
16.權利要求I的方法，其中所述干擾RNA分子包含至少一種修飾。
17.權利要求I的組合物，其中干擾RNA分子是shRNA、siRNA或miRNA。
18.權利要求I的方法，其中通過局部、玻璃體內、經鞏膜(transcleral)、眼周、結膜、眼球筋膜下(subtenon)、前房內(intracameral)、視網膜下、結膜下、眼球后、或小管內途徑所述施用干擾RNA分子。
19.具有約19至約49個核苷酸長度的干擾RNA分子，該干擾RNA分子包含 (a)至少13個連續核苷酸的區域，其與對應于SEQID N0:2和SEQ ID N0:13_SEQ IDNO:98中任一個的mRNA的3’末端的倒數第二位的13個核苷酸有至少90%的序列互補性、或者至少90%的序列同一性； (b)至少14個連續核苷酸的區域，其與對應于SEQID N0:2和SEQ ID N0:13_SEQ IDNO:98中任一個的mRNA的3’末端的倒數第二位的14個核苷酸有至少85%的序列互補性、或者至少85%的序列同一性；或者 (c)至少15、16、17或18個連續核苷酸的區域，其分別與對應于SEQ ID NO:2和SEQID NO: 13-SEQ ID NO:98中任一個的mRNA的3’末端的倒數第二位的15、16、17或18個核苷酸有至少80%序列互補性、或者至少80%序列同一性。
20.權利要求19的干擾RNA分子，其中所述干擾RNA分子識別對應于SEQID NO: 2和SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:98 中任一個的 GREMl mRNA 的部分。
21.權利要求19的干擾RNA分子，其中所述干擾RNA分子識別GREMlmRNA的部分，其中該部分包含 SEQ ID NO: I 的核苷酸 402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或 689。
22.權利要求19的干擾RNA分子，其中所述干擾RNA分子是shRNA、siRNA或miRNA。
23.權利要求19的干擾RNA分子，其中所述干擾RNA分子包含至少一種修飾。
24.權利要求19的干擾RNA分子，其中所述干擾RNA分子是雙鏈的，且其中所述干擾RNA分子的至少一條鏈包含3’突出端。
25.權利要求24的干擾RNA分子，其中所述3’突出端包含約I至約6個核苷酸。
26.權利要求25的干擾RNA分子，其中所述3’突出端包含2個核苷酸。
27.權利要求19的干擾RNA分子，其中所述干擾RNA分子是雙鏈的，且所述干擾RNA分子具有平頭末端。
全文摘要
提供了用于抑制眼內壓相關狀況中gremlin的RNA干擾，所述狀況包括高眼壓和青光眼，例如正常眼壓性青光眼和開角型青光眼。
文檔編號A61K31/713GK102743767SQ201210253570
公開日2012年10月24日 申請日期2007年8月24日 優先權日2006年8月24日
發明者A·F·克拉克, J·E·查特爾頓 申請人:愛爾康研究有限公司