多重耐藥鮑曼不動桿菌的高效抗菌活性反義核酸序列的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長的反義寡核苷酸序列及其應用。屬新型抗菌制劑研究與開發領域。本發明采用計算機輔助設計聯合寡核苷酸斑點雜交技術篩選出一條以多重耐藥鮑曼不動桿菌拓撲異構酶ⅡA亞基的編碼基因gyrA為靶基因的反義寡核苷酸，用以抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌的生長。本發明表明該反義寡核苷酸序列在低濃度時即具有明顯的抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長的活性，提高濃度顯示出快速、高效的殺菌活性即能夠引起多重耐藥鮑曼不動桿菌的死亡。本發明中設計的反義核酸具有抑制活性強，專一性高的特點，非常適合在治療多重耐藥鮑曼不動桿菌感染中的應用，并極有潛力發展為抗多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的藥物。
【專利說明】多重耐藥鮑曼不動桿菌的高效抗菌活性反義核酸序列
【技術領域】[0001]本發明涉及一種反義核酸序列，具體為一種抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌桿菌生長的反義核酸序列。
【背景技術】
[0002]反義技術是根據核酸雜交原理設計針對特定靶序列的反義核酸從而抑制特定基因表達，近年來其發展極其迅速，作為一種新的基因治療手段，反義技術已經被廣泛應用于病毒感染、腫瘤、遺傳性疾病等醫學研究，并取得了豐碩的成果，具有極其重要的理論和實際意義。原核生物與真核生物相比，具有基因組結構簡單，生長調控機制相對單一等優勢，將反義技術應用于原核生物系統無疑有著“神奇”的應用潛力。
[0003]目前，幾乎所有臨床應用的抗生素都出現了相應的耐藥菌，因此采用傳統靶點篩選出來的抗生素難以避免耐藥的問題。科學家已經完成了多種重要致病菌的全基因組測序工作，新一代測序技術將使這一名錄迅速增加。這些龐大的基因組序列信息為后基因組時代分析基因功能并借此尋找新的抗菌藥物作用靶點提供了可能。近年來，采用反義技術在基因組范圍內篩選鑒定致病菌必需基因的研究進展顯著，而這些必需基因有可能發展為新的抗菌藥物靶點近年來，反義技術在新型抗菌藥物研發中發揮了重要作用。人們采用反義技術鑒定必需基因，發現了許多具有發展前景的抗菌藥物作用靶點；針對耐藥基因的反義核酸能夠有效逆轉耐藥菌對現有抗生素的敏感性，針對生長必需基因的反義核酸具有顯著的抗菌活性，通過改善其細胞吸收特性以及抗菌活性，反義核酸有望發展成為新一代抗菌藥物，為人類造福。
[0004]鮑曼不動桿菌廣泛分布于環境中和健康人群中，極易在醫用材料上黏附，能引起人呼吸道、泌尿道、中樞神經系統等多部位的感染，近年來由于廣譜抗生素的大量應用，該菌引起的感染明顯上升。目前現有抗生素對于多重耐藥甚至泛耐藥的鮑曼不動桿菌引起的感染治療困難，由于其耐藥機制復雜且極有可能存在新的耐藥機制，因此傳統的抗菌藥物在治療中有相當的局限性，迫切需要開發出新的抗菌制劑。
[0005]反義核酸可以通過與靶基因的特異性結合形成空間位阻，抑制靶基因的轉錄和翻譯。以細菌生長的必須基因為靶，利用反義核酸使其生長所需必須蛋白缺失，可達到抑制細菌生長的目的。從基因水平上尋找治療多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的方法有望成為抗感染治療的新途徑。
[0006]gyrA基因是細菌生長的必需基因，作為拓撲異構酶II A亞基的編碼基因，在細菌DNA復制中發揮重要作用，抑制其表達可抑制細菌的生長。反義核酸對靶基因的抑制作用關鍵在于能否形成穩定的DNA:RNA雜化雙鏈(heteroduplexes)結構。由于mRNA 二級結構的空間位阻作用，只有少數位點可與反義核酸結合從而發揮基因表達下調作用，因此有效核酸序列的設計篩選是反義技術的關鍵。目前為止還沒有針對多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的高效反義核酸序列。
【發明內容】
[0007]為了克服多重耐藥鮑曼不動桿菌對現有抗生素廣泛耐藥，抗感染治療成功率低的難題，本發明提供了一種針對多重耐藥鮑曼不動桿菌具有高效抗菌活性的反義核酸序列，該序列為一段人工合成的核苷酸序列，它與多重耐藥鮑曼不動桿菌必需基因gyrA特定位點序列是互補的。將一定劑量本發明所述的反義核酸序列加以穩定性修飾并轉至菌體內，該類反義核酸能夠與靶基因特異性結合從而抑制靶基因的表達，達到高效、低毒或無毒地抑抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌的生長的目的，進而治療與其感染有關的疾病。
[0008]本發明是采用如下技術方案實現的:
[0009]1.本發明針對gyrA基因全長編碼區序列,通過利用Mfold和RNA structured:.6兩種mRNA 二級結構分析軟件預測分析gyrA mRNA的二級結構，以最低自由能原則繪制37°C時gyrA mRNA的二級結構圖，并進行自由能計算,包括Overall AG、Duplex AG、Breaktarg A G、oligo-self A G和oligo-oligo A G等參數,選擇mRNA局部雜交松弛區，如發卡、膨脹環、內環等結構區域，設計反義寡核苷酸探針。利用斑點雜交技術，將設計的反義寡核苷酸探針與地高辛標記的gyrA mRNA分子進行原位雜交，驗證其與靶基因結合的有效性，篩選出一條能與gyrA基因穩定結合的反義核酸序列。
[0010]2.根據以上I項所述的反義核酸序列，其特征在于，具有與多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的下述序列(Seq ID N0.1)互補的核苷酸序列:5’ GAUGGUGAUAGCGCUGCGGC 3’
[0011]3.根據以上I項所述的反義核酸序列，其特征在于，具有下述序列(Seq IDN0.2):
[0012]5， GCCGCAGCGCTATCACCATC 3，
[0013]4.根據以上1-3項中任一項的反義核酸序列，其特征在于它與多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA mRNA的堿基互補，能有效地抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長。
[0014]本發明所提供的反義核酸序列，經過穩定性修飾并導入細菌體內，可以顯著抑制細菌的生長且無明顯毒性作用。在本發明的一個優選實施例中，所述反義核酸的12個連續堿基序列Seq ID N0.3以肽核酸的形式合成，經過穿膜肽KFFKFFKFFK序列修飾，達到將反義序列以穩定的形式轉入細菌體內的目的。
[0015]本發明所提供的反義核酸序列可用于制備對抗多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的治療藥物，其對細菌生長的抑制作用是傳統抗生素無法匹敵的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1是不同濃度的PNA作用下根據測定0D600值繪制的細菌生長曲線(5 U mo I/L肽核酸濃度即可顯著抑制鮑曼不動桿菌生長)
[0017]圖2是不同濃度的PNA作用下根據平板菌落計數繪制的細菌生長曲線(5 u mol/L肽核酸濃度具有良好的抑制細菌生長效果，10 u mol/L肽核酸濃度即具有殺菌活性)
【具體實施方式】
[0018]1:反義核酸的合成
[0019]為保持反義核酸在研究中的穩定，不易被降解而失去抑制效能，將所述反義核酸以肽核酸(PNA)的形式合成以增加其穩定性，并加穿膜肽KFFKFFKFFK序列修飾，克服細菌膜結構對大分子的屏障作用，以達到將反義序列以穩定的形式轉入細菌體內的目的。
[0020]肽核酸(PNA)是人工合成的DNA類似物，以肽鍵(NH-CO)代替核酸天然骨架3’，5’磷酸二酯鍵，具有高水溶性、高穩定性、與堿基配對的特異性高等特點。然而，肽核酸比常用藥物的分子量大很多，導致其難以順利通過細菌外膜滲透進入細菌體內，通過穿膜肽修飾可提高肽核酸的滲透能力。除此之外，肽核酸的長度也將影響其自身的穿膜能力，一般9mer-12mer的肽核酸與穿膜肽KFFKFFKFFK連接時，可顯著提高肽核酸的滲透能力，同時有效提高反義抑制效率。
[0021]因此，本研究選用了 12mer的PNA序列，即選擇所述的反義核酸序列的其中12個連續堿基序列seq ID N0.3，進行肽核酸合成，并加穿膜肽序列KFFKFFKFFK修飾，形成肽肽核酸(KFF) 3K-PNA。
[0022]2:多重耐藥鮑曼不動桿菌的培養
[0023]研究所用多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株由重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科提供，藥敏試驗結果顯示其對氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛酯、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、妥布霉素、左旋氧氟沙星、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢替坦、頭孢曲松、氨曲南、慶大霉素、環丙沙星、呋喃妥因均耐藥。將菌株接種于LB液體培養基于37°C搖床振蕩過夜培養。
[0024]3:反義核酸對多重耐藥鮑曼不動桿菌的生長抑制作用
[0025]將上述過夜培養的菌液用MHB培養基稀釋至約105CFU/ml，取100 U I稀釋后的菌液加入96孔板，同時加入(KFF) 3K-PNA,使其濃度分別為0，5，10，20，40 y mol/L。將96孔板放入37°C孵箱培養24h，分別于Oh, lh，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h取出測定0D600值，同時于oh，2h，4h，6h，8h做平板菌落計數，觀察(KFF) 3K_PNA對細菌生長的抑制作用。
[0026]體外對多重耐藥鮑曼不動桿 菌的抑菌試驗結果顯示:本研究所使用的肽核酸在5 ii mol/L濃度時能顯著抑制細菌的生長，在IOii mol/L濃度時具有殺菌活性，結果見圖1，圖2。細胞毒性試驗在40 u mol/L濃度時未見明顯的毒性反應。結果表明本發明所提供的反義核酸序列具有極強的抗菌活性，可用于制備抗多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的治療藥物。
【權利要求】
1.一種反義核苷酸，其特征在于具有與多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的下述序列互補的核苷酸序列:5’ GAUGGUGAUAGCGCUGCGGC 3’。
2.如權利要求1所述的反義核苷酸，其特征在于具有以下序列:5’ GCCGCAGCGCTATCACCATC 3’
3.如權利要求1-2所述的反義核苷酸，其特征在于它與多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrAmRNA的堿基互補，有效地抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長。
4.如權利要求1-3中任一項的反義核苷酸序列的修飾型。
5.如權利要求1-3中一項反義核苷酸序列作為治療和/或預防多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的基因藥物的應用。
6.如權利要求1-3中任一項反義核酸序列在醫學中的應用。
7.如權利要求4的反義核酸序列的修飾型作為治療和/或預防多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的基因藥物的應用 。
【文檔編號】A61P31/04GK103571836SQ201210251518
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月20日 優先權日:2012年7月20日
【發明者】夏云, 王慧娟, 羅鵬 申請人:夏云, 王慧娟, 羅鵬