下調鋅指蛋白A20表達的siRNA及其用途

下調鋅指蛋白A20表達的siRNA及其用途
【專利摘要】本發明涉及能夠下調鋅指蛋白A20的siRNA分子，以及所述siRNA分子用于下調鋅指蛋白A20、促進樹突狀細胞成熟和用于制備治療急性髓性白血病的藥物中的用途。本發明還涉及鋅指蛋白A20的表達下調或沉默后得到的樹突狀細胞，所述樹突狀細胞優選為AML腫瘤細胞誘導產生的樹突狀細胞（AML-DC）；本發明還涉及所述樹突狀細胞用于激活CTL和/或T細胞，以及用于制備治療急性髓性白血病的藥物中的用途。本發明建立了一種增強DC疫苗抗AML免疫應答的新方法，為AML的免疫治療開辟了一個新方向。
【專利說明】下調鋅指蛋白A20表達的siRNA及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及小干擾RNA分子及其用途，特別是能夠下調鋅指蛋白A20的小干擾RNA(siRNA)分子，以及所述SiRNA分子用于下調鋅指蛋白A20、促進樹突狀細胞成熟和用于制備治療急性髓性白血病的免疫細胞或藥物的用途。
【背景技術】
[0002]急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是一類我國常見且預后很差的惡性血液病腫瘤，目前仍有大量病人對常規治療(化療，造血干細胞移植，生物靶向治療等)不敏感或治療后復發，其中白血病微小殘留病灶(Minimal residual disease,MRD)是治療復發的主要障礙[1_2]。近年來，腫瘤的細胞免疫治療已經成為繼手術、放療、化療后的第四種腫瘤治療模式，并以安全有效，副作用小等優點逐漸被廣大的醫務工作者和患者認可[3]。目前認為AML病人在化療或者造血干細胞移植治療后，輔以特異的個體化生物免疫治療,有利于抑制或者消除殘留白血病(MRD)，延緩復發，取得良好的預后[4]。在AML細胞生物免疫治療中，以樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)遞呈腫瘤抗原誘導機體特異性抗腫瘤免疫的腫瘤生物治療已成為目前臨床試驗研究的熱點。
[0003]樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)是人體內功能最強大的抗原遞呈細胞，具有攝取、加工抗原，以MHC 1、II類肽結合物的形式遞呈抗原并促進T、B淋巴細胞增殖的能力，在天然免疫和獲得性免疫中都發揮著極其重要的作用。隨著對DC攝取、遞呈抗原機理的不斷認識，DC培養方法的不斷成熟和完善，針對腫瘤的弱免疫原性、抗原調變現象、MHC分子下調或缺失、抗原加工遞呈障礙等免疫特點而設計的DC疫苗已成為該領域的熱點之一。這些發展為開辟腫瘤的生物治療新途徑奠定了理論和實驗基礎。目前應用比較多的是DC主要來源于正常細胞，即供者正常外周血和病人治療緩解期正常造血狀態下分離的DC細胞。但是正常細胞(包括供者)來源的DC也存在諸多不足:1:來源較少，不能滿足臨床需要；2:制備過程中需要抗原負載步驟；3:容易引發遲發型超敏反應等問題[5_6]。有研究者發現了AML病人本身的AML腫瘤細胞也能誘導出DC樣的細胞(即AML-DC)，并應用于臨床，因此我們進行生物免疫治療所采用的細胞也包括AML-DC。
[0004]AML-DC的發現:1998年奧地利學者Oehler在研究粒細胞分化過程中發現在較高
純度的乳鐵蛋白存在的條件下，晚幼粒細胞的發育途徑可以發生逆轉，在GM-CSF、IL-4和
TNF- α存在的條件下，顛倒粒細胞成熟路徑可以產DC樣細胞，具有DC細胞的形態和表型，
甚至有抗原遞呈能力[7]。這為我們提供了利用髓性腫瘤細胞誘導分化產生DC的機會。近
些年來研究的比較成功的是CML-DC和AML-DC [8]。CML-DC成熟度較高，能有效刺激同種異
體T淋巴細胞反應，并在臨床中有了一定的應用[9]。通過體內擴增AML-DC，發現其表型和功
能存在缺陷，并且分化不夠徹底，去除誘導劑后會發生逆轉，不成熟的DC會誘導免疫耐受。
但是AML-DC具有來源豐富，不需要抗原負載和安全性高等優點，因此具有潛在的應用前景[10]。
[0005]如何能夠彌補AML-DC缺陷，使之應用于臨床，應用的較多的有在培養過程中加入CD40配體，SCF, Ca2+等，但是由于AML-DC存在個體差異較大，沒有一種方法能夠做到簡單適宜通用，如何更有效的促進DC細胞的成熟，是亟待解決的技術問題[11_13]。
[0006]A20 (tumor necrosis factor, alpha-1nduced protein3, TNFAIP3)是一種具有鋒指結構的泛素修飾酶，它有兩個泛素編輯區(Two ubiquitin-editing domains):N末端去泛素化酶保護受體相互作用蛋白(RIP)免于降解；(:末端泛素化連接酶促進RIP降解(A20結構見圖1) Cl4]0這使得A20具有兩種不同的生物學效應，即是否泛素化來調節許多關鍵分子的降解[15]。近年來的研究表明A20能夠通過抑制TNF和TLR (Toll-like receptor)這兩條激活途徑來影響NF- K B生物活性。其主要機制如下:
[0007](I)TNF途徑:A20的C末端有7個鋅指結構，至少4個鋅指是抑制TNF介導的NF-κ B激活所需要的；同時Dixit等認為A20的N端雖然具有去泛素化活性，但與抑制NF-κ B無明顯相關[16]。在TNF途徑中，TNF受體相關因子2和5 (TNF receptorassociated factor-2/5，TRAF2/5)可以使RIPl發生多泛素化，因此招集TGF-β激活酶-1(Transforming growth factor-beta-activated kinasel, TAKl)和 TAKl 結合蛋白-2(TAKl-binding protein2，TAB2)復合物，TAKl是NF-κ B激活所必需，因此RIPl的多泛素化是TNF途徑的關鍵。Dixit及其研究小組的研究指出:Α20是緊密和RIPl的去泛素化和再泛素化相關聯的。Α20可以通過C末端連接多個泛素分子，導致RIPl被蛋白酶體識別和降解，終止了 TNF所誘導的NF- κ B的激活。
[0008](2) TLR途徑:Boone [17]及其研究人員設計的體外試驗中，A20缺陷性巨噬細胞顯示出了適應于TLR2，TLR3和TLR9配體增高的NF- κ B的活性，提示Α20負調控多種TLR途徑。在TLR4信號通路中TRAF6 (TNF受體相關因子6，包含一個RING指域，是許多泛素E3連接酶所共有的部分)和二聚體E2 (也稱泛素結合酶)催化生成氨基酸63(K63)_多泛素化鏈，此鏈介導TLR途徑中下一個成分的激活，這個成分可能是MARKKK，比如TAKl。Α20的N末端和C末端活性在此途徑中可能是相互獨立的產生作用。盡管在調控TLR信號中C末端泛素連接酶活性尚未得到評價，但是Boone及其研究小組的確指出了 N末端有去泛素化酶，可以去泛素化TRAF6，減弱或者終止TLR誘導的NF- κ B的活化。
[0009]另外，IKK Y是抑制性κ B激酶(Inhibitory κ B kinase, IKK)復合物三個組成亞基之一，它將來自上游的NIK信號傳遞給IKK α和IKK β，在使用TNF或應答過表達TNFRl時，Α20可以通過鋅指結構與IKKy結合，影響它的信號傳遞，進而阻斷了 NF-κ B的激活。另外有相關研究證實，Α20在體內炎癥反應和細胞凋亡方面也存在廣泛的調控作用[18]。
[0010]目前的研究結果發現，Α20在DC細胞的成熟、細胞因子產生及免疫刺激方面發揮重要作用，尤其在這種抗原遞呈細胞中起關鍵的調節作用[19]。Α20沉默表達使得DCs能更好的激活CTLs和Th細胞，并抑制Treg細胞。這也提供了一種在腫瘤免疫治療中以一種抗體特有的方式去對抗Treg所介導的抑制作用的方法[2°]。A20負向調控DCs細胞的成熟和細胞因子的產生，A20沉默表達的DC能自發表現和提高共刺激分子和促炎性細胞因子的表達，在起始期提高T細胞的反應性，并且通過產生IL-6及TNF- α來抑制Treg細胞所介導的自身免疫抑制作用，增強腫瘤浸潤CTL細胞和Th細胞的活性，通過產生IL-6和腫瘤壞死因子-α (TNF-α )來抗拒Treg所介導的抑制作用。因此，通過研究鑒別A20作為一種抗原呈遞的負向調控因子在抗瘤免疫反應的起始期和效應期的控制作用，同時也提供了一種能以特異性的抗體方式對抗Treg所介導的抑制作用的方法，減少了 Treg直接靶細胞的需要。
[0011]綜上，通過下調鋅指蛋白A20的表達來促進DC細胞的成熟，進而增強AML患者的免疫應答，可以為AML的免疫治療提供一種新的途徑。

【發明內容】

[0012]本發明即利用RNAi技術對三種不同來源的DC細胞中的鋅指蛋白A20的表達進行下調，以促進DC細胞的成熟，特別是AML-DC細胞的成熟，進而增強AML患者的免疫應答，增強對AML腫瘤細胞的殺傷能力。具體地，本發明涉及以下幾方面:
[0013]本發明的第一方面涉及下調A20表達的小干擾RNA分子，其包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈或反義鏈包含選自以下(I)~(5)中任一項的至少一種序列:
[0014](I) SEQ ID NO:27 ~SEQ ID NO:35 中的任一序列；
[0015](2)與SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:35中任一序列的同一性至少為70%的序列，優選至少80%，更優選至少84%，更優選至少89%，更優選至少94%，例如為95%、96%、97%、98%、99%或100%，并具有下調A20表達的能力；
[0016](3)經過改造的選自(I)或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和/或3’方向上添加有至多30個核苷酸的序列，優選至多20個，更優選至多10個，更優選至多5個，例如為4個、3個、2個或I個，并具有下調A20表達的能力；
[0017](4)經過改造的選自(I)或(2)中的序列，其是在所述序列的基礎上經一個或者幾個(例如1、2、3、4、5個、I 一 10個)核苷酸的截短和/或替換，并具有下調A20表達的能力；
[0018](5)與上述(I)~(4)中任一序列對應的DNA序列。
[0019]在本發明的實施方案中，所述小干擾RNA分子的正義鏈選自SEQ IDNO:27~SEQID NO:35所示的序列，反義鏈為與其互補的序列。
[0020]為了增加穩定性、提高轉染效率，在本發明的實施方案中，所述小干擾RNA分子包含選自SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:18所示序列中的至少一種序列，優選為選自SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:12所示序列中的至少一種序列，例如為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2退火形成的 S1-1，SEQ IDNO:3 和 SEQ ID NO:4 退火形成的 Si_2，SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 退火形成的 S1-3，SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 退火形成的 Si_4，SEQID NO:9 和 SEQID NO: 10退火形成的S1-5和SEQ ID NO:11和SEQ IDNO: 12退火形成的Si_6 ;更優選為S1-1。
[0021]本發明的第二方面涉及重組載體，其可操作地連接有第一方面的小干擾RNA分子。在本發明的實施方案中，所述重組載體為連接有本發明第一方面小干擾RNA分子的Ad5/F35腺病毒載體。
[0022]本發明的第三方面涉及組合物，其含有第一方面的小干擾RNA分子或者第二方面的重組載體，以及藥學上可接受的載體。
[0023]本發明的第四方面涉及重組細胞，其包含有第一方面的小干擾RNA分子以及第二方面的重組載體。
[0024]本發明的第五方面涉及第一方面的小干擾RNA分子或者第二方面的重組載體用于下調細胞中鋅指蛋白A20表達的用途。
[0025]其中所述的細胞為樹突狀細胞前體細胞、樹突狀細胞或體內其它具有抗原遞呈能力的免疫細胞，如巨噬細胞，B細胞或者其他非專職抗原遞呈細胞。
[0026]所述樹突狀細胞前體細胞是指能夠通過誘導分化為樹突狀細胞的細胞,例如為外周血單個核細胞(PBMC)或髓系單核細胞(mo)。
[0027]在本發明的實施方案中，所述樹突狀細胞為正常人的樹突狀細胞，AML緩解期正常造血狀態下的樹突狀細胞或者AML腫瘤細胞誘導產生的樹突狀細胞(AML-DC)。
[0028]本發明的第六方面涉及第一方面的小干擾RNA分子或者第二方面的重組載體用于促進樹突狀細胞成熟的用途；在本發明的實施方案中，所述樹突狀細胞為正常人的樹突狀細胞，AML緩解期正常造血狀態下的樹突狀細胞或者AML腫瘤細胞誘導產生的樹突狀細胞(AML-DC)。
[0029]本發明的第七方面涉及第一方面的小干擾RNA分子或者第二方面的重組載體用于制備治療炎癥、惡性腫瘤或白血病的藥物中的用途；例如，其中所述白血病為急性髓性白血病。
[0030]本發明的第八方面涉及將鋅指蛋白A20的表達下調或沉默后得到的樹突狀細胞；在本發明的實施方案中，所述樹突狀細胞為正常人的樹突狀細胞，AML緩解期正常造血狀態下的樹突狀細胞或者AML腫瘤細胞誘導產生的樹突狀細胞(AML-DC)。
[0031]其中所述將鋅指蛋白A20的表達下調或沉默的方法為，通過RNA干擾或微小RNA(microRNA, miRNA)調控的方式下調或沉默DC中鋅指蛋白A20的表達；在本發明的實施方案中，所述RNA干擾的方式為將第一方面的小干擾RNA分子或第二方面的重組載體導入樹突狀細胞中。
[0032]本發明的第九方面涉及第八方面的樹突狀細胞用于激活CTL和/或T細胞的用途；在本發明的實施方案中，所述CTL和/或T細胞來自AML患者。
[0033]在本發明的實施方案中，所述激活T細胞是指T細胞的細胞因子分泌量增加，所述細胞因子例如為 IL-2、IL-4、IFN- y ,TNF- α、Perforin 和 / 或 Granzyme B。所述激活 CTL細胞是指DC所誘導的CTL細胞殺傷AML腫瘤細胞的能力增強，提高CTL對腫瘤細胞的殺傷效率；所述腫瘤細胞優選為來自AML患者。
[0034]本發明的第十方面涉及第八方面的樹突狀細胞用于制備治療炎癥、惡性腫瘤和白血病的藥物中的用途。例如，其中所述白血病為急性髓性白血病。
[0035]本發明還涉及下調A20表達的SiRNA分子所針對的靶序列，所述靶序列選自以下序列中的至少一種:
[0036](1) SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:35中的任一序列或與其互補的序列；
[0037](2)與SEQ ID N0:27~SEQ ID NO:35中的任一序列的同一性至少為70%的序列，優選至少80%，更優選至少84%，更優選至少89%，更優選至少94% ；
[0038](3)與(I)或(2)中任一序列對應的DNA序列。
[0039]發明的有益效果
[0040]本發明研究結果表明，鋅指蛋白A20在正常細胞來源的DC和AML-DC中都起到了負向調控DC的作用，利用SiRNA下調或者沉默其表達，可以對DC細胞起到“修飾”的作用，抑制DC自體的免疫抑制通路，促進DC成熟，激活抗白血病特異性的殺傷性T細胞(CTL)，抑制調節性T細胞(Treg)和誘導更強更持久的特異性抗AML免疫應答，殺傷體內殘存的腫瘤細胞(MRD)，從而建立了一種增強抗惡性腫瘤和白血病特別是AML特異性免疫應答的新方法，該方法能夠降低惡性腫瘤和白血病特別是AML復發率及提高患者的生存質量，也為惡性腫瘤和白血病特別是AML的免疫治療開辟了一個新方向。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1鋒指蛋白A20結構不意圖
[0042]圖2培養成熟的DCs在顯微鏡下形態(顯微鏡倍數40 X )
[0043]A: AML-M2培養成熟的DC; B: AML-M3培養成熟的DC;
[0044]C:AML-M5培養成熟的DC;D:正常細胞來源培養成熟的DC
[0045]圖3AML-DCS與正常人DCs細胞表型流式分析結果(n=4)
[0046]其中縱坐標表示帶有每種表型的細胞占全部細胞的百分比。結果表明AML-DC和正常DC相比較，在各種細胞表型中均存在缺陷，其中*表示該數據結果經過統計學分析具有意義，P值〈0.05。
[0047]圖4siRNA脂質體轉染法轉染效率的流式檢測結果
[0048]圖5 六條 siRNA 干擾效果的 real-time PCR (RT-PCR)結果(η=3)
[0049]圖63種siRNA轉染DC s后A20mRNA的表達(PCR的電泳結果)
[0050]M:DNA marker ；1:Si_l 轉染的 DC ；2:Si_2 轉染的 DC ；3:Si_3 轉染的 DC ；4:無關siRNA轉染的DC ；5:空白對照組
[0051]圖73種siRNA轉染后DCs中A20蛋白的表達(Western blot)
[0052]M:marker ；1:Si_l 轉染的 DC ；2:Si_2 轉染的 DC ；3:Si_3 轉染的 DC ；4:無關 siRNA轉染的DC ；5:空白對照組
[0053]圖8TNF- α刺激后不同時間點收獲的DC中A20mRNA的表達(RT-PCR)
[0054]圖9TNF- α刺激后不同時間點DC中A20mRNA的表達(PCR的電泳結果)
[0055]M:DNA marker ；1:TNF- α 刺激后 Oh ；2:TNF- α 刺激后 6h ；3:TNF- α 刺激后 24h ；
4:TNF-α 刺激后 48h
[0056]圖10TNF-a刺激后不同時間點DC中A20蛋白的表達(Western blot)
[0057]M:marker ； 1:TNF_ α 刺激后 Oh ;2 =TNF- α 刺激后 6h ;3 =TNF- α 刺激后 24h ；4:TNF- α刺激后48h
[0058]圖1 IAML-DCs成熟的細胞表型分析(n=4)(流式細胞分析結果)
[0059]其中縱坐標表示帶有每種表型的細胞占全部細胞的百分比。結果表明A20經過siRNA干擾后的AML-DC同A20正常表達的AML-DC相比較，細胞表型的表達上均有很大提高。其中*表示該數據經過統計學分析，具有統計學意義。P〈0.05)。
[0060]圖12尼龍毛柱純化后T細胞表型流式檢測結果
[0061]圖13T細胞活化過程中細胞因子分泌的量的柱狀分析圖(n=4)(流式細胞分析結果)
[0062]A20被siRNA下調表達的AML_DCs，在刺激T細胞活化過程中細胞因子分泌的量比A20正常表達的AML-DCs要多，表明A20被siRNA下調表達的AML-DCs能更好的刺激T細胞活化。其中*表示數據經過統計學分析后，具有統計學意義，P〈0.05。縱坐標為細胞因子分泌的量，單位是經過流式分析后的百分比數。
[0063]圖14AML-DCS介導的特異性CTL殺傷效率(n=4)(流式細胞分析結果)[0064]Control (空白對照)組:2±0.283，normal A20 (正常 A20)組:16.65± 1.517，siRNA組:22.65± 1.548，normal A20組與siRNA組比較P=0.0015，縱坐標為殺傷百分比。
【具體實施方式】
[0065]本發明中，我們采用了三種來源的DC，分別為正常供者DC，病人緩解期DC和AML-DC0前兩者因為均來自于正常造血狀態下的細胞，因此統稱為正常細胞來源的DC。我們利用設計的小干擾RNA (Small interfering RNA，siRNA)下調A20表達后，DC的成熟度明顯提高；我們將這種DC與病人的T細胞共同培養后，通過胞內染色的方法檢測發現T細胞活化過程中細胞因子分泌的量有所增加；于是我們將這種DC刺激培養出來的CTL細胞和病人的AML腫瘤細胞共同孵育，通過流式的方法檢測AML腫瘤細胞的死亡情況，結果發現A20下調后的DC所誘導的CTL細胞殺傷AML腫瘤細胞的能力增強，其數據結果具有統計學意義。 [0066]在本發明中，誘導RNA干擾的小干擾RNA分子在細胞或機體內被轉換為實施抑制基因表達的效應siRNA分子。
[0067]siRNA分子包括正義鏈和反義鏈，適用于本發明的siRNA分子可以通過本領域常用的方法制備。可以在體外制備siRNA，然后將其直接導入細胞中(例如通過轉染)。更具體地，例如可以通過化學合成、體外轉錄或由siRNA表達質粒或病毒載體在細胞中表達，來制備本發明的的siRNA分子。
[0068]在本發明的實施方案中，根據抑制效果，挑選出抑制效果較好的，例如為S1-1、S1-2、S1-3、S1-4、S1-5 和 S1-6，其分別為 SEQ ID NO:1 和 SEQ IDNO:2 退火后形成的 siRNA序列，SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 退火后形成的 siRNA 序列，SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6退火后形成的siRNA序列，以此類推；并進一步挑選出抑制效果最好的siRNA分子,例如為 S1-1。
[0069]在本發明中，術語“可操作地連接”是指將核酸與另外的核酸序列置于在功能上具有關系的狀態。這可以是相互連接的基因和控制序列以這樣的方式連接，使得當適當的分子被結合到控制序列時，該基因的表達變得可行。例如，如果啟動子控制編碼序列的轉錄，那么該啟動子將可操作性地與該序列結合。通常，術語“可操作地連接”是指被連接的DNA序列是相鄰的，并且在分泌性前導序列的情況中，是相鄰的且在閱讀框內。所述序列的連接是通過在適當的限制酶位點上進行連接來實施的。如果所述位點不存在，可以使用根據常規方法合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。
[0070]在本發明中，小干擾RNA (siRNA)指包括約10_60個核苷酸(或核苷酸類似物)，能夠指引或介導RNA干擾的RNA (或RNA類似物)。siRNA包括雙鏈siRNA和單鏈siRNA，在本發明中一般是指雙鏈siRNA，包括正義鏈和反義鏈。
[0071]在本發明中，所述同一性是指在比較的兩條序列的對應窗口中相同核苷酸所占的比例，所述窗口的大小是指15個以上核苷酸組成的窗口，優選至少17，更優選至少約18或19至21-23或24-29個核苷酸的窗口，所述同一性至少70%，是指在對應窗口中至少70%的核苷酸相同，優選至少80%，更優選至少84%，更優選至少89%，更優選至少94%，例如95%，96%，97%，98%，99%或100%。其中不同的核苷酸優選位于序列的5'和/或3'端，例如位于距5'和/或3'端1-4個核苷酸序列內。[0072]在本發明中，當鋅指蛋白A20的核苷酸序列與本發明不同時，用于下調鋅指蛋白A20的誘導RNA干擾分子的序列也隨著序列的不同在對應位置上做相應的改變，以達到能夠下調或沉默鋅指蛋白A20表達的效果。
[0073]在本發明中，所述下調或沉默鋅指蛋白A20的表達，是指在DC細胞中，鋅指蛋白A20的蛋白、DNAJP /或RNA水平可觀察到的降低或消失，例如減少至少約50%，60%，70%，80%，90%,95%，99%或更多的表達。抑制的結果可通過檢測細胞或機體的表型或生化技術而證實，所述生化技術例如為Northern雜交，基因芯片，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，WesternBlot，熒光激活細胞分選(FACS)或放射免疫試驗(RIA)等。
[0074]在本發明中，所述促進DC成熟是指DC成熟度較前提高，更有利于抗原的提呈，具體表現為通過流式檢測DC成熟的表面標記較前有提高，如⑶80、⑶83、⑶86、HLA-DR、⑶54、HCCR7等。DC的成熟度越高，對于T細胞的刺激能力就越強，在T細胞活化過程中細胞因子分泌量會更多，同時T細胞活化的過程越好，所誘導的CTL細胞殺傷腫瘤細胞的能力也會更強。
[0075]在本發明的一個實施方案中，所述促進DC成熟是指DC誘導的T細胞的細胞因子分泌量增加，同時DC所誘導的CTL細胞殺傷AML腫瘤細胞的能力增強。
[0076]在本發明中，所述DC包括正常供者DC，病人緩解期DC和AML-DC，優選為AML-DC。由于AML-DC表面遞呈有來自AML患者的抗原，因此其能夠更好地誘導T細胞和CTL細胞的激活，增強對AML腫瘤細胞的殺傷作用。
[0077]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0078]在以下實施例中，如未特別說明，均同時采用三種DC細胞，即正常人DC細胞，AML緩解期DC細胞或AML-DC細胞進行實驗，實驗結果相似時只列出其中一種細胞的檢測結果，例如僅列出正常人DC細胞的結果。
[0079]實施例1:DC細胞培養
[0080]正常細胞來源的DC培養:正常供者或者緩解期正常造血狀態下的AML病人，經過費森尤斯血細胞分離機分離白細胞層(根據病人的血小板、白細胞、紅細胞壓積等指標來設定循環血量及采集時間)，然后利用Ficoll淋巴細胞分離液2000r/min離心20分鐘，收獲單個核細胞(PBMC)，370C 5%C02孵箱中孵育2小時，輕搖培養瓶，收集懸浮細胞，通過尼龍毛柱分選T淋巴細胞以備用；剩余貼壁細胞加入含有人GM-CSF1000U/ml，人IL-4800U/ml的DC培養基，在37°C 5%C02孵箱中孵育4天，誘導生成未成熟DC。并通過顯微鏡和流式細胞儀(采用DC單抗)監測和鑒定。第6天加入人TNF- a 1000U/ml刺激DC成熟后收獲DC細胞，DC的流式檢測及免疫組織化學染色確定其特征性免疫表型。
[0081]AML-DC培養:分離單核細胞的過程與前相同，PBMC在37°C 5%C02孵箱中孵育6小時，然后收集懸浮細胞計數后備用；其余與正常DC細胞培養方法相同。
[0082]A20下調表達的DC制備:將培養至第6天的DC細胞，在加入TNF- α后24h后按照脂質體轉染法的說明(見實施例3脂質體轉染法)，將siRNA轉染入DC細胞，6h后換成DC培養基。第7天收獲DC，此為制備好的A20下調表達的DC細胞。[0083]圖2顯示的是所培養的不同類型的AML患者的DC細胞和正常人的DC細胞，能夠從細胞形態中判斷出DC細胞，證明DC培養是成功的。圖3表示的AML-DC和正常人DC在成熟度上的區別，統計學分析結果表明AML-DC成熟度較低。DC細胞只有成熟度越高，才能更好的刺激T細胞活化，實現其免疫上的相關功能。而AML-DC的成熟度較低，因此存在免疫缺陷，需要進行siRNA干擾等方法進行修飾后，才能應用于臨床實踐中并發揮作用。
[0084]實施例2siRNA制備:
[0085]根據GenBank A20mRNA 序列(NM006290.2),用 Ambion 公司的 siRNA 在線設計工具siRNA Target Finder，找到以AA起始，GC含量低于50%，長度在21bp的候選序列(其中Y端的2個堿基為懸頭序列，其余19個堿基為靶序列)；根據Reynolds等關于siRNA自身序列特征的研究，按照其總結的siRNA設計規則評分，選擇評分在6分以上的siRNA ;將得到的序列在人基因庫中進行Blast同源性比對，以排除RNAi脫靶效應；用RNA Structured O軟件預測A20RNA 二級結構，根據預測的結果選取了 9條靶序列，分別位于A20的羧基末端和氨基末端兩個功能區域。設計合成的siRNA序列為以下SEQ ID NO:1~18所示的序列，其中3丨端的2個堿基為懸頭序列，其可以增加穩定性、提高轉染效率，其余序列為靶序列或靶序列的反向互補序列。
[0086]siRNAl (S1-1，位于 Zif-5 區):
[0087]F:5 ; -GCACCAUGUUUGAAGGAUATT-3 ; (SEQ ID NO:1，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為 SEQ ID NO:27)
[0088]R:5 ; -UAUCCUUCA AACAUGGUGCTT-3 ; (SEQ ID NO:2)退火后為:
[0089]
GCACCAUGUUUGAAGGAUATT

N N N N N Π.MN
TTCGUGGUACAAACUUCCUAU
[0090]siRNA2 (S1-2，位于 Zif-2 區):
[0091]F:5 ; -CACUGAAUGUGCAGCACAATT-3 ; (SEQ ID NO:3，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為 SEQ ID NO:28)
[0092]R:5 ; -UUGUGCUGCACAUUCAGUGTG-3 ; (SEQ ID NO:4)退火后為:
[0093]
CACUGAAUGUGCAGCACAATT
…丨 M M MIllI
GTGUGACUUACACGUCGUGUU
[0094]siRNA3 (S1-3，位于氨基末端):
[0095]F:5 ; -GGUAGAUGAUUACUUUGAATT-3 ; (SEQ ID NO:5，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為 SEQ ID NO:29)
[0096]R:5 ; -UUCAAAGUAAUCAUCUACCAG-3 ; (SEQ ID NO:6)退火后為:
[0097]
GGUAGAUGAUUACUUUGAATT:1 * I t I I ! ! t I I: I i r
GACCAUCUACUAAUGAAACUU
[0098]siRNA4 (Si_4，位于氨基末端):[0099]F:5 ; -UCUGGUAGAUGAUUACUUUTT-3 ; (SEQ ID NO:7，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為 SEQ ID NO:30)
[0100]R:5 ; -AAAGUAAUCAUCUACCAGATT-3 ; (SEQ ID NO:8)退火后為:
[0101]
UCUGGUAGAUGAUUACUUUTT

TTAGACCAUCUACUAAUGAAA
[0102]siRNA5 (S1-5，位于 Zif-1 區):
[0103]F:5 ; -AAUGUGAAACGCCCAACUGTT-3 ; (SEQ ID NO:9，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為 SEQ ID NO:31)
[0104]R:5 ; -CAGUUGGGCGUUUCACAUUTT-3 ; (SEQ ID NO: 10)退火后為:
[0105]
AAUGUGAAACGCCCAACUGTT
N mIMmmIMIII
TTU UACAOJU UGCGGG U UGAC
[0106]siRNA6 (S1-6，位于 Zif-4 區):
[0107]F:5 ; -AAGCCGGCUGCGUGUAUUUTT-3 ; (SEQ ID NO: 11，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為SEQ ID NO:32)
[0108]R:5 ; -AAAUACACGCAGCCGGCUUTT-3 ; (SEQ ID NO: 12)退火后為:
[0109]
AAGCCGGCUGCGUGUAUUUTT
IfMM i MN 丨 M

TTUUCGGCCGACGCACAUAAA
[0110]siRNA-7 (S1-7，位于 Zif-2 區):
[0111]F:5 ; -UGUGCAGCACAACGGAUUUTT-3 ; (SEQ ID NO: 13，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為SEQ ID NO:33)
[0112]R:5 ; -AAAUCCGUUGUGCUGCACATT-3 ; (SEQ ID NO: 14)
[0113]siRNA-8 (S1-8，位于 Zif-3 區):
[0114]F:5 ; -CGGAUUUUGUGAACGUUGCTT-3 ; (SEQ ID NO: 15，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為SEQ ID NO:34)
[0115]R:5 ; -GCAACGUUCACAAAAUCCGTT-3 ; (SEQ ID NO: 16)
[0116]siRNA-9 (S1-9，位于 Zif-6 區):
[0117]F:5 ; -GCUCAGAAUCAGAGAUUUCTT-3 ' (SEQ ID NO: 17，去掉 3 '末端兩個堿基后的序列為SEQ ID NO:35)
[0118]R:5 ; -GAAAUCUCUGAUUCUGAGCTT-3 ; (SEQ ID NO:18)熒光標記的 siRNA(FAM-siRNA):
[0119]F:5 ; -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ' (SEQ ID NO: 19)
[0120]R:5 ; -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 ; (SEQ ID NO:20)陰性對照的 siRNA: [0121]F:5 ; -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ' (SEQ ID NO:21)
[0122]R:5 ; -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 ; (SEQ ID NO:22)
[0123]實施例3siRNA轉染效率的檢測:[0124]轉染效率的高低可以通過熒光標記的siRNA (FAM-siRNA)監測。FAM-siRNA轉染細胞后，可以用流式細胞儀等檢測，確定是否有效轉染和優化轉染條件。
[0125]可以采用瞬時轉染或穩定轉染的方法，在本發明中采用了瞬時轉染的方法。當采用穩定轉染方法時，可以利用小干擾RNA序列制備AD5/F35腺病毒載體，例如質粒為PDC316，啟動子為U6。
[0126]轉染:
[0127]①以24孔板為例，在轉染前保證細胞密度達到30%_80%，每孔中加入約500 μ I的無抗生素培養基。取 I y I/ 孔的 Lipofectamine2000,用 50 μ IOpt1-MEMI Reduced SerumMedium稀釋。輕輕混合后在室溫孵育5min。
[0128]②取2 μ I FAM-siRNA,用 50 μ I Opt1-MEMI Reduced Serum Medium 稀釋，輕輕混合均勻。稀釋的Lipofectamine2000經過5min的孵育后，與稀釋的FAM-siRNA輕輕混合，室溫靜置20min，以形成FAM-siRNA-轉染試劑混合物。
[0129]③將FAM-s iRNA-轉染試劑的混合液加入含有細胞及培養液的孔中，每孔約400 μ 1，輕輕搖晃孔板使其混合。在37°C 5%C02培養箱中培養。
[0130]④轉染6h后可上機檢測FAM-siRNA，即檢測轉染效率。
[0131]⑤FAM是一種綠色的熒光基團，由藍光激發，激發波長為480nm，發射波長為520nm，可在流式細胞儀的FITC通道檢測，結果見圖4。
[0132]實驗結果表明轉染是成功的，并且確定了轉染量(2 μ I)。
[0133]實施例4siRNA轉染·后檢測沉默下調鋅指蛋白A20表達的效果
[0134]提取DC細胞總RNA，加入20 μ I DEPC水溶解。取11 μ I RNA按照Fermentas逆轉錄試劑盒的說明逆轉錄出cDNA，進行實時定量PCR。
[0135]PCR 的反應條件是:94°C，5min，(94°C，30s ;60°C，lmin) X45 個循環，40°C，IOs 降溫。
[0136]PCR的反應體系是:
[0137]
【權利要求】
1.下調A20表達的小干擾RNA分子，其包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈或反義鏈包含選自以下(I) - (5)中任一項的至少一種序列: (1)SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:35中的任一序列或與其互補的序列； (2)與SEQID N0:27~SEQ ID NO:35中任一序列的同一性至少為70%的序列，優選至少80%，更優選至少84%，更優選至少89%，更優選至少94%，并具有下調A20表達的能力； (3)經過改造的選自(I)或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和/或3’方向上添加有至多30個核苷酸的序列，優選至多20個，更優選至多10個，更優選至多5個，并具有下調A20表達的能力； (4)經過改造的選自(I)或(2)中的序列，其是在所述序列的基礎上經一個或者幾個(例如I 一 5個、I 一 10個)核苷酸的截短和/或替換，并具有下調A20表達的能力； (5)與上述(I)~(4)中任一序列對應的DNA序列。
2.重組載體，其可操作地連接有權利要求1的小干擾RNA分子。
3.組合物，其含有權利要求1所述的小干擾RNA分子或者權利要求2的重組載體，以及藥學上可接受的載體。
4.重組細胞，其包含有權利要求1所述的小干擾RNA分子或者權利要求2的重組載體。
5.權利要求1的小干擾RNA分子或者權利要求2的重組載體用于下調細胞中鋅指蛋白A20表達的用途。
6.權利要求5的用途，其中所述的細胞為樹突狀細胞前體細胞、樹突狀細胞以及其它具有抗原遞呈能力的細胞。
7.權利要求1的小干擾RNA分子或者權利要求2的重組載體用于促進樹突狀細胞成熟的用途；例如，所述樹突狀細胞為正常人的樹突狀細胞，AML緩解期正常造血狀態下的樹突狀細胞或者AML腫瘤細胞誘導產生的樹突狀細胞(AML-DC)。
8.權利要求1的小干擾RNA分子或者權利要求2的重組載體用于制備治療炎癥、惡性腫瘤或白血病的藥物中的用途；例如，其中所述白血病為急性髓性白血病。
9.將鋅指蛋白A20的表達下調或沉默后得到的樹突狀細胞；例如，所述樹突狀細胞為正常人的樹突狀細胞，AML緩解期正常造血狀態下的樹突狀細胞或者AML腫瘤細胞誘導產生的樹突狀細胞(AML-DC )。
10.權利要求9的樹突狀細胞，其中所述將鋅指蛋白A20的表達下調或沉默的方法為，通過RNA干擾或微小RNA調控的方式下調或沉默樹突狀細胞中鋅指蛋白A20的表達；優選地，所述RNA干擾的方式為將權利要求1的小干擾RNA分子或權利要求2的重組載體導入樹突狀細胞中。
11.權利要求9或10的樹突狀細胞用于激活CTL和/或T細胞的用途；例如，所述CTL和/或T細胞來自AML患者。
12.權利要求9或10的樹突狀細胞用于制備治療炎癥、惡性腫瘤或白血病的藥物中的用途；例如，其中所述白血病為急性髓性白血病。
13.下調A20表達的SiRNA分子所針對的靶序列，所述靶序列選自以下序列中的至少一種: (1)SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:35中的任一序列或與其互補的序列； (2)與SEQID NO:27~SEQ ID NO:35中的任一序列的同一性至少為70%的序列，優選至少80%，更優選至少84%，更優選至少89%，更優選至少94% ； (3)與(1)或(2)中任一序列對應的DNA序列。
【文檔編號】A61P29/00GK103540591SQ201210241285
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月12日 優先權日:2012年7月12日
【發明者】陳虎, 張曉穎, 張斌 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院附屬醫院