專(zhuān)利名稱(chēng)：一種家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于增強(qiáng)家禽免疫力的中藥復(fù)方制劑。
背景技術(shù)：
免疫增強(qiáng)劑是一類(lèi)通過(guò)提高和促進(jìn)動(dòng)物體非特異性或特異性免疫功能來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)免疫功能，以達(dá)到防治疾病目的的物質(zhì)。近年來(lái)，一些家禽由病毒感染所引發(fā)的免疫抑制日趨嚴(yán)重，呈擴(kuò)散蔓延趨勢(shì)，因多 以亞臨床感染的形式出現(xiàn)而易被忽視。在我國(guó)雞群中免疫抑制性病毒的二重或多重感染存在一定的普遍性，降低雞群的免疫力，使一些過(guò)去容易控制的疾病變得難以控制。這些免疫抑制性病毒主要包括雞馬立克氏病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性貧血病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒和禽白血病病毒等。在我國(guó)雞群中，免疫抑制性病毒的二重及多重感染具有普遍性。單一的免疫抑制性病毒感染往往不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，使機(jī)體的免疫狀態(tài)受到抑制但不很?chē)?yán)重，但當(dāng)有兩種或兩種以上病毒同時(shí)感染同一個(gè)體時(shí)，則會(huì)使機(jī)體處于嚴(yán)重的免疫抑制狀態(tài)。崔治中等對(duì)從全國(guó)各地隨機(jī)收集到的疑似IBDV感染的60多個(gè)法氏囊樣品進(jìn)行檢查發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)高比例的樣品中分別存在著對(duì)雞馬立克氏病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性貧血病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒不同組合的二重感染和多重感染，其中5個(gè)樣品中同時(shí)存在著以上4種病毒的感染。免疫抑制性病毒的二重或多重感染，因?yàn)楣哺腥静《鹃g的相互協(xié)同作用而使機(jī)體處于嚴(yán)重的免疫抑制狀態(tài)，對(duì)新城疫(ND)等的疫苗接種不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)性免疫應(yīng)答，所以盡管在我國(guó)雞群中對(duì)ND采取高強(qiáng)度免疫，仍不能有效控制ND的流行，使一些病原難以從我國(guó)雞群中清除。另外，病毒的二重或多重感染可能引起病毒間基因發(fā)生重組，從而為產(chǎn)生新的病毒創(chuàng)造了條件。第三，處于免疫抑制狀態(tài)的雞群，感染細(xì)菌性疾病的幾率明顯增加，并對(duì)細(xì)菌具有多重耐藥性。排除雞群免疫抑制，提高雞群疫苗免疫成功率，增加雞群抗病力已是目前養(yǎng)雞生產(chǎn)中急需解決的問(wèn)題。隨著生物科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和中藥免疫藥理學(xué)研究的不斷深入，具有我國(guó)傳統(tǒng)特色的中醫(yī)藥在畜禽疫病防治中顯示了無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，中藥不僅可以促進(jìn)疫苗的免疫效果(如王關(guān)林報(bào)道莪術(shù)多糖對(duì)雛雞抗氧化能力和免疫功能的影響等)，還在預(yù)防和治療病毒性和細(xì)菌性疾病及排除免疫抑制方面均有明顯的作用(如劉家國(guó)報(bào)道中藥制劑抑制大腸桿菌生長(zhǎng)和繁殖及陳德坤報(bào)道中藥提高對(duì)新城疫病毒的保護(hù)率等)。尤其是有關(guān)調(diào)節(jié)畜禽機(jī)體抵抗力的中藥，已顯示出了強(qiáng)大的生命力。補(bǔ)益類(lèi)中藥一般都有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，而對(duì)正常細(xì)胞毒副作用不明顯，是良好的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。但這些研究尚屬初步，總的來(lái)說(shuō)仍處于探索階段，存在一些缺陷。如許多研究都是只停留在對(duì)一般性指標(biāo)粗淺的觀(guān)察上，過(guò)分重視對(duì)單味藥物的藥效研究，忽視機(jī)體免疫是復(fù)雜的作用過(guò)程和運(yùn)用中醫(yī)理論進(jìn)行中藥復(fù)方調(diào)節(jié)免疫的探索。如果能利用中藥復(fù)方作用多樣性的特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出激發(fā)免疫效果的有效方劑，那么不僅在中醫(yī)藥調(diào)節(jié)免疫方面將產(chǎn)生突破性進(jìn)展，而且對(duì)于深入闡明中醫(yī)辯證施治及整體觀(guān)理論乃至促進(jìn)中醫(yī)藥理論的發(fā)展都具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，能夠?qū)仪萦绕涫请u的免疫力產(chǎn)生優(yōu)良的促進(jìn)作用，對(duì)機(jī)體黏膜免疫功能的影響尤為明顯。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。一種家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，其按重量份數(shù)比包含黃芪30-45、女貞子30-40、黨參20-30、紅花8-12、白術(shù)10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首烏10-15、麥冬10-12、當(dāng)歸15-20、茯苓 15-20，刺五加 10-15。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，上述家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑按重量份數(shù)比包含黃芪38、女貞子35、黨參25、紅花10、白術(shù)12，肉桂11、熟地 18、何首烏13、麥冬11、當(dāng)歸17、茯苓18，刺五加12。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，上述家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑按重量份數(shù)比包含黃芪32、女貞子40、黨參21、紅花8、白術(shù)15，肉桂10、熟地20、何首烏15、麥冬12、當(dāng)歸15、茯苓20，刺五加10。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，上述家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑按重量份數(shù)比包含黃芪44、女貞子31、黨參29、紅花12、白術(shù)11，肉桂12、熟地15、何首烏11、麥冬10、當(dāng)歸20、茯苓15，刺五加15。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，上述家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑按重量份數(shù)比包含黃芪35、女貞子37、黨參25、紅花12、白術(shù)12，肉桂10、熟地15、何首烏13、麥冬11、當(dāng)歸18、茯苓18，刺五加12。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，上述家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑按重量份數(shù)比包含黃芪38、女貞子35、黨參29、紅花10、白術(shù)10，肉桂10、熟地15、何首烏13、麥冬11、當(dāng)歸18、茯苓15，刺五加10。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于①本發(fā)明按照〃扶正固本，補(bǔ)氣健脾，活血化淤〃的中獸醫(yī)理論，篩選出了提高禽類(lèi)免疫力的免疫增強(qiáng)劑；試驗(yàn)顯示(具體的試驗(yàn)方法詳見(jiàn)下文)本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)雞T淋巴細(xì)胞亞群分類(lèi)、淋巴細(xì)胞增殖、淋巴因子、漿細(xì)胞及其分泌SIgA含量、血細(xì)胞吞噬能力等均具有一定的促進(jìn)作用，對(duì)家禽尤其是雞的免疫力具有優(yōu)良的促進(jìn)作用，對(duì)機(jī)體黏膜免疫功能的影響尤為明顯。②本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑能夠提高吞噬細(xì)胞能力0.26 (0D)、溶菌酶分泌水平13ii g/ml、腸道和氣管SIgA分泌水平0. 2以上(0D)、脾淋巴細(xì)胞誘生因子分泌水平3 (OD)(上述數(shù)值均為與空白對(duì)照相比的增高值)；雛雞飼喂本發(fā)明的本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑5d后，環(huán)磷酸銨所引起的免疫抑制被排除，細(xì)胞免疫、體液免疫和粘膜免疫功能恢復(fù)正常。③對(duì)本發(fā)明藥品的驗(yàn)證試驗(yàn)一、材料與方法I.材料I. I.本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑的制備配方I (本發(fā)明配方)本課題組篩選黃芪38、女貞子35、黨參25、紅花10、白術(shù)12，肉桂11、熟地18、何首烏13、麥冬11、當(dāng)歸17、茯苓18，刺五加12，共12種市銷(xiāo)中藥組方，80目粉碎，在20-30°C、相對(duì)濕度70%左右的環(huán)境中存放。配方2 (對(duì)比配方)本課題組篩選野菊花10、黃芪25、山豆根20、桔梗15、車(chē)前子10、板藍(lán)根10、牛黃5、甘草5，共8種市銷(xiāo)中藥組方，80目粉碎，在20-30 V、相對(duì)濕度70%左右的環(huán)境中存放。I. 2傳染性法氏囊病毒(IBDV)制備將采用自然發(fā)生傳染性法氏囊病病雞法氏囊和脾臟按照李銀聚介紹的方法處理，制成IBD野毒。將其接種雞胚，測(cè)定IBD野毒的EID5Q。I. 3疫苗增效劑(中成藥)由河北省神康獸藥有限公司生產(chǎn)。I. 4環(huán)磷酸胺邯鄲市醫(yī)院惠贈(zèng)。I. 5^3+、CT4+和⑶/單克隆抗體購(gòu)于石家莊開(kāi)創(chuàng)生化試劑銷(xiāo)售公司I. 610%犢牛血清購(gòu)于石家莊生創(chuàng)生化試劑銷(xiāo)售公司 I. 7黃芪多糖購(gòu)于重慶泰通動(dòng)物藥業(yè)有限公司。I. 8葡萄糖試劑盒購(gòu)于上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司I. 9膽堿酯酶試劑盒購(gòu)于中生北控生物科技股份有限公司
I. 10飼料購(gòu)于石家莊市正大集團(tuán)2試驗(yàn)設(shè)計(jì)2. I本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑配方的篩選從石家莊市某雞場(chǎng)購(gòu)I日齡雛雞80只，雌雄各半。隨機(jī)將80只I日齡肉雞分成I、II、III、IV共4組，每組20只。試驗(yàn)期間，每組隔離飼養(yǎng)，雞只自由采食相同日糧，自由飲水，給予24h光照。20日齡時(shí)，按0. 1%劑量分別給III、IV組肉雞日糧中添加本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑或?qū)Ρ扰浞降闹兴?見(jiàn)表1)，連用5天。然后給采用點(diǎn)眼、滴鼻、肌注方法給II、III、IV組肉雞用500 EID50 IBDV進(jìn)行攻毒。攻毒前I天和攻毒后5天每組隨機(jī)選擇5只雞，各采血5ml，按血漿糖皮質(zhì)激素試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行處理，然后進(jìn)行檢測(cè)；結(jié)果參見(jiàn)表I。2. 2本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑劑量的篩選研究從石家莊市某雞場(chǎng)購(gòu)I日齡雛雞120只，雌雄各半。在7日齡進(jìn)行2羽份新支120凍干苗點(diǎn)眼；分別在10日齡、17日齡進(jìn)行2羽份傳染性法氏囊疫苗滴嘴。按常規(guī)方法喂養(yǎng)和管理。隨機(jī)將120只I日齡肉雞分成I、II、III、IV、VI、V共6組，每組20只。I組作為正常對(duì)照組；II組作為免疫抑制對(duì)照組，只進(jìn)行肌肉注射環(huán)磷酸胺；III、IV、V、VI組肉雞自7日齡至12日齡，向日糧中添加本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑或者疫苗增效劑(中成藥，由河北省神康獸藥有限公司生產(chǎn))，同時(shí)于10日齡時(shí)腹部肌肉注射環(huán)磷酸胺80mg/kg體重，連用5天；試驗(yàn)期為21d。于21日齡，每組隨機(jī)抽取5只雛雞，空腹稱(chēng)量體重后，無(wú)菌取其法氏囊，生理鹽水沖洗，無(wú)菌濾紙吸干表面水分后稱(chēng)重，并計(jì)算法氏囊免疫指數(shù)(法氏囊免疫指數(shù)=法氏囊/體重比)；結(jié)果參見(jiàn)表2。2. 3本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能影響2. 3. I本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群分類(lèi)影響從河北某雞場(chǎng)購(gòu)I日齡AA肉雞60只，雌雄各半，隨機(jī)將其分為I、11二組，每組30只。按AA肉雞飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理和常規(guī)免疫外，于20日齡時(shí)II組按0. lg/kg體重/天向雞飼料中添加本發(fā)明的免疫增強(qiáng)齊U，連用5天。I組作為對(duì)照組，除不添加中藥外，其它條件與均I組相同。25日齡時(shí)，每組隨機(jī)選擇5只雞，從雞的心臟采血各5ml，制成抗凝血，將抗凝血按常規(guī)方法分離出淋巴細(xì)胞后，按說(shuō)明加入ra3+、CD:和⑶/單克隆抗體，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血液ra3+、CD:和⑶/比例；結(jié)果參見(jiàn)表3。
2. 3. 2.本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑對(duì)脾淋巴細(xì)胞誘生因子的影響從石家莊市某雞場(chǎng)購(gòu)I日齡雛雞200只，雌雄各半。隨機(jī)將200只I日齡肉雞分成I、II、III、IV四組，每組50只。試驗(yàn)期間，每組隔離飼養(yǎng)，雞只自由采食相同日糧，自由飲水，給予24h光照。各組嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)。3日齡時(shí)，按使用說(shuō)明給III組肉雞日糧中添加黃芪多糖；按0. 1%劑量分別給IV組肉雞日糧中添加本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑，連用5天。6日齡時(shí)，給II、III、IV組雞經(jīng)口人工感染IBDV。8日齡、15日齡時(shí)，每組隨機(jī)選擇5只雞，無(wú)菌采取脾臟，制成單細(xì)胞懸液(IXlO6個(gè)/ml)。加入100 u L RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%犢牛血清、20 u g/mLConA和青、鏈霉素各100U/mL)，將細(xì)胞置于40°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)42h。最后收集細(xì)胞培養(yǎng)液于3000r/min離心20min，吸取上清液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中的IL-2含量；結(jié)果參見(jiàn)表4。2. 3. 3本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑對(duì)腸道和氣管SigA分泌量的影響從石家莊市某雞場(chǎng)購(gòu)I日齡雛雞90只，雌雄各半。在7日齡進(jìn)行2羽份新支120凍干苗點(diǎn)眼；分別在10日齡、17日齡進(jìn)行2羽份傳染性法氏囊疫苗滴嘴。按常規(guī)方法喂養(yǎng)和管理。隨機(jī)將90只I日齡肉雞分成I、II二組，每組30只。I組作為正常對(duì)照組；II組作為用藥對(duì)照組，自8日齡至13日齡按黃芪多糖使用說(shuō)明給雞飲水；111組自8日齡至13日齡，按0. 1%的劑量向其日糧中添 加本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑。其他條件均相同。分別于14、21日齡，每組隨機(jī)抽取5只雛雞，屠宰后，收集雞氣管液、腸液，然后利用間接ELISAL法檢測(cè)其IgA抗體；結(jié)果參見(jiàn)表5。2.4.本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑對(duì)肉雞巨噬細(xì)胞吞噬功能和血清溶菌酶影響2.4. I中藥對(duì)細(xì)胞無(wú)毒濃度的測(cè)定無(wú)菌操作取9-10日齡健康雞胚，置滅菌培養(yǎng)皿中除去頭、爪、內(nèi)臟,并剪成塊,用Hanks’液充分沖洗后移入廣口瓶中，加入約4倍量的
0.25%的胰酶，調(diào)節(jié)pH值到7-7. 8，振蕩混勻后置37°C水浴中感作40min，每Imin輕搖一次。消化液過(guò)濾后加入營(yíng)養(yǎng)液，用7. 5%NaHC03調(diào)pH到7. 2-7. 4。分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C溫箱中培養(yǎng)24h-48h細(xì)胞長(zhǎng)成單層。將維持液中的中藥濃度分別調(diào)制成Iml相當(dāng)于
0.017g、0. 025g、0. 033g、0. 066g生藥，然后接種于生長(zhǎng)良好的細(xì)胞單層上，每個(gè)稀釋度接種二瓶細(xì)胞，以不加藥液的正常細(xì)胞作對(duì)照。連續(xù)觀(guān)察6d，以出現(xiàn)細(xì)胞退變的最小稀釋倍數(shù)作為該藥對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度，即為試驗(yàn)中藥藥液濃度；結(jié)果參見(jiàn)表6。2. 4. 2中性紅吞噬試驗(yàn)參照崔東安測(cè)定小鼠吞噬細(xì)胞功能的方法，利用96孔酶標(biāo)板，設(shè)I、II、III、IV、V、VI6個(gè)組，每組8個(gè)孔。III、IV、V、VI為試驗(yàn)組，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)用PAP至中藥濃度為100 u g/ml、200 u g/ml、400 u g/ml ; I、II 二組為對(duì)照組，I組加入等體積的RPMI1640液，作為空白對(duì)照；II組加入細(xì)胞培養(yǎng)用PAP至黃芪多糖濃度為200 ii g/ml。在37°C 5% CO2感作48h后，棄上清液，用PBS清洗二次，加入0. 075%中性紅溶液100 u L，培養(yǎng)2h，棄上清液，用PBS清洗三次，加入120 u L酸性異丙醇，搖勻溶解后，于595nm處檢測(cè)吸光度值；結(jié)果參見(jiàn)表7。2. 4. 3血清溶菌酶水平測(cè)定將120只I日齡健康艾維茵肉雞隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，自7日齡至14日齡，III、IV、V、VI三組肉雞分別按0. 06%,0. 08%,0. 1%、0. 14%的劑量
向試驗(yàn)組肉仔雞日糧中添加本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑，自15日齡后常規(guī)飼養(yǎng)。I組作為正常對(duì)照組，除不喂本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑物外，其它均和對(duì)照組相同。II組作為藥物處理對(duì)照組，該組肉雞按黃芪多糖使用說(shuō)明使用(按0. 01%向日糧中添加);試驗(yàn)期為28d。17日齡時(shí)，對(duì)每組肉雞進(jìn)行心臟采血，常溫下保持30min，經(jīng)離心分離出血清后，按溶菌酶測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定其含量；結(jié)果參見(jiàn)表8。
2.5.本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑對(duì)環(huán)磷酸胺致免疫低下肉雞的免疫影響2. 5. I免疫器官指數(shù)的測(cè)定從石家莊市某雞場(chǎng)購(gòu)I日齡雛雞80只，雌雄各半。在7日齡進(jìn)行2羽份新支120凍干苗點(diǎn)眼；分別在10日齡、17日齡進(jìn)行2羽份傳染性法氏囊疫苗滴嘴。按常規(guī)方法喂養(yǎng)和管理。隨機(jī)將80只I日齡肉雞分成I、II、III、IV共4組，每組20只。I組作為正常對(duì)照組；II組作為免疫抑制對(duì)照組，只進(jìn)行肌肉注射環(huán)磷酸胺JII組肉雞自7日齡至12日齡，按0. 1%的劑量向其日糧中添加本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑；IV組肉雞自7日齡至12日齡，按0. 1%的劑量向日 糧中添加本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑，同時(shí)于10日齡時(shí)肌肉注射環(huán)磷酸胺；試驗(yàn)期為21d。分別于14、21日齡，每組隨機(jī)抽取5只雛雞，無(wú)菌取其法氏囊、胸腺和脾臟，生理鹽水沖洗，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后稱(chēng)重，并計(jì)算法氏囊、胸腺及脾臟免疫器官管指數(shù)；結(jié)果參見(jiàn)表9。2. 5. 2脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定將上述稱(chēng)量完畢的脾臟除去外膜，用生理鹽水沖洗數(shù)次，加平衡鹽水，剪刀剪碎，200目銅網(wǎng)過(guò)濾，分離單個(gè)脾細(xì)胞。分離的脾臟淋巴細(xì)胞樣品用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為IXlO6Ail ;取脾細(xì)胞懸液50iil，加入IOiil標(biāo)記抗體，混勻，4°C孵育40min ;加入PBS，8000rpm，5min洗滌細(xì)胞3次；細(xì)胞沉淀中加入200 ill I %多聚甲醛4°C過(guò)夜。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組脾細(xì)胞中⑶/、⑶/構(gòu)成比情況；結(jié)果參見(jiàn)表10。2. 5. 3ND抗體水平的測(cè)定在上述測(cè)定免疫器官指數(shù)的試驗(yàn)過(guò)程中，屠宰雞之前，對(duì)每只雞進(jìn)行心臟采血5ml，待析出血清后，利用微量血凝抑制法測(cè)定其N(xiāo)D抗體水平；結(jié)果參見(jiàn)表11。2. 5. 4氣管和腸道IgA抗體的檢測(cè)在上述測(cè)定免疫器官指數(shù)的試驗(yàn)過(guò)程中，屠宰雞時(shí)收集雞氣管液、腸液，然后利用間接ELISAL法檢測(cè)其SIgA抗體；結(jié)果參見(jiàn)表12。3.本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑對(duì)肉雞血液指標(biāo)和飼料轉(zhuǎn)化率影響將7日齡AA肉雞60只隨機(jī)分成I、II兩組，每組30只。II組按0. 5%的劑量向飼料中添加本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑，連用14天，I組為空白對(duì)照組。其它條件兩組均相同。將7日齡AA肉雞60只隨機(jī)分成I、II兩組，每組30只。I組按0. 1%的劑量向飼料中添加本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑，連用14天，II組為空白對(duì)照組。給藥后第15天，每組隨機(jī)選擇5只肉雞，空腹稱(chēng)重；心臟采血10mL，靜置20min,于3000r / min離心IOmin制備血清。屠宰后,立即剖殺,取十二指腸食糜3_5g。整個(gè)過(guò)程中記錄肉雞米食量。3. I血清膽堿酯酶(CHE)檢測(cè)按照血清膽堿酯酶試劑盒說(shuō)明書(shū)，將上述處理血清利用比色法檢測(cè)肉雞血清膽堿酯酶含量；結(jié)果參見(jiàn)表13。3. 2血糖檢測(cè)將上述處理血清采用試劑盒并結(jié)合全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定葡萄糖濃度；結(jié)果參見(jiàn)表13。3. 3.淀粉酶檢測(cè)按I :51的食糜水質(zhì)量比，稱(chēng)取0. 5g食糜，加入4°C雙蒸水后，迅速轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中，勻漿管置于400ml燒杯內(nèi)，其中放有冰水，溫度保持在4°C以下，勻漿30s。在4°C條件下再用冰凍離心機(jī)離心,于12000r/min離心15min。取部分上清液,采用碘一淀粉比色法測(cè)定；結(jié)果參見(jiàn)表13。3. 4飼料轉(zhuǎn)化率測(cè)定飼料轉(zhuǎn)化率為肉雞平均體重與整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中肉雞平均采食量的比值；結(jié)果參見(jiàn)表13。4.本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑生物安全性試驗(yàn)
4. I小白鼠急性中毒試驗(yàn)河北醫(yī)科大學(xué)提供的小白鼠40只，雌、雄各半，體重在18-22g之間，平均體重19. 5g。要求飼養(yǎng)室的室溫為(23±1)°C，相對(duì)濕度為(55±5)%，12h光照。按霍恩氏法共分五個(gè)劑量級(jí)，每級(jí)為一個(gè)試驗(yàn)組，共5組；另設(shè)對(duì)照組一個(gè)。給藥途徑和方法采取一次性灌胃法，即將本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑添加劑按改良寇氏法進(jìn)行劑量分級(jí)稱(chēng)取，向各分級(jí)劑量加入生理鹽水配成混懸液，用注射器吸混懸液，將混懸液緩緩灌入小白鼠胃內(nèi)。灌藥后，每隔30min檢查一次小白鼠活動(dòng)情況；灌藥2h后，每2h檢查一次；灌藥12h后,每日上、下午各檢查一次。檢查要點(diǎn)為小白鼠的精神狀態(tài)、飲欲、食欲、排便有無(wú)異常，是否有中毒或死亡現(xiàn)象；試驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)剖檢小白鼠，對(duì)其臟器組織進(jìn)行H. E染色、光鏡觀(guān)察；于第7天統(tǒng)計(jì)LD5tl ;結(jié)果參見(jiàn)表14。4. 2小白鼠亞慢性中毒試驗(yàn)隨機(jī)篩選同批次小白鼠10只分為二組，一組為試驗(yàn)組，另一組為對(duì)照組。將本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑添加劑按小白鼠飼料量的10% (肉雞用量的10倍)添加于鼠飼料中，混合均勻后制成餅狀自然風(fēng)干；對(duì)照組的小白鼠飼料中不添加本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑添加劑。其它條件均相同，連續(xù)飼喂60天，進(jìn)行詳盡觀(guān)察，判斷有無(wú)慢性中毒現(xiàn)象，同時(shí)剖檢試驗(yàn)鼠，并對(duì)臟器組織進(jìn)行a E染色、光鏡觀(guān)察。試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)均稱(chēng)重，并求其平均值。二、試驗(yàn)結(jié)果I.不同配方免疫增強(qiáng)劑防治肉雞腹水綜合征的研究表I本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑對(duì)肉雞血漿糖皮質(zhì)激素濃度影響
權(quán)利要求
1.一種家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于按重量份數(shù)比包含黃芪30-45、女貞子30-40、黨參20-30、紅花8-12、白術(shù)10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首烏10-15、麥冬10-12、當(dāng)歸 15-20、茯苓 15-20，刺五加 10-15。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于按重量份數(shù)比包含黃芪38、女貞子35、黨參25、紅花10、白術(shù)12，肉桂11、熟地18、何首烏13、麥冬11、當(dāng)歸17、茯苓18，刺五加12。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于按重量份數(shù)比包含黃芪32、女貞子40、黨參21、紅花8、白術(shù)15，肉桂10、熟地20、何首烏15、麥冬12、當(dāng)歸15、茯苓20，刺五加10。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于按重量份數(shù)比包含黃芪44、女貞子31、黨參29、紅花12、白術(shù)11，肉桂12、熟地15、何首烏11、麥冬10、當(dāng)歸20、獲茶15,刺五加15。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于按重量份數(shù)比包含黃芪35、女貞子37、黨參25、紅花12、白術(shù)12，肉桂10、熟地15、何首烏13、麥冬11、當(dāng)歸18、茯苓18，刺五加12。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于按重量份數(shù)比包含黃芪38、女貞子35、黨參29、紅花10、白術(shù)10，肉桂10、熟地15、何首烏13、麥冬11、當(dāng)歸18、獲茶15,刺五加10。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種家禽飼養(yǎng)用免疫增強(qiáng)劑，其按重量份數(shù)比包含黃芪30-45、女貞子30-40、黨參20-30、紅花8-12、白術(shù)10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首烏10-15、麥冬10-12、當(dāng)歸15-20、茯苓15-20，刺五加10-15。本發(fā)明能夠?qū)仪萦绕涫请u的免疫力產(chǎn)生優(yōu)良的促進(jìn)作用，對(duì)機(jī)體黏膜免疫功能的影響尤為明顯。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102716327SQ20121023072
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者張永英, 張登榮, 強(qiáng)慧芹, 王斌, 石玉祥, 裴艷濤, 趙兵令, 趙洪明, 鐘翠紅 申請(qǐng)人:河北工程大學(xué)