靶向作為vegfr-2共受體cd146的新功能在抗腫瘤血管新生治療中的應用的制作方法
【專利摘要】靶向作為VEGFR-2共受體CD146的新功能在抗腫瘤血管新生治療中的應用。本發明首次提出細胞黏附分子CD146是VEGFR-2的共受體，抗CD146抗體與抗VEGF抗體聯合應用于抑制腫瘤血管生成可能成為臨床治療癌癥的新策略。與常規治療腫瘤的靶向單一分子的抗體藥物相比，靶向兩種不同分子的抗體聯合能夠更有效地抑制腫瘤生長。CD146作為VEGFR-2的共受體能夠輔助其更有效地傳遞VEGF介導的下游信號進而發揮促進血管生成功能。抗CD146抗體與抗VEGF抗體聯合治療腫瘤的作用機理主要是兩種抗體聯合能夠共同抑制VEGF-VEGFR-2信號通路的活化、內皮細胞的遷移及血管生成等功能，進而更加有效的抑制腫瘤生長(如胰腺癌等)。這兩種抗體聯合應用或與其他臨床治療手段相配合(如臨床放化療)都將成為抑制腫瘤血管新生的新策路，同時可用于腫瘤血管新生機理等基礎研究。
【專利說明】靶向作為VEGFR-2共受體CD146的新功能在抗腫瘤血管新生治療中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于治療腫瘤的組合物。具體地，本發明涉及抗⑶146抗體與抗VEGF抗體的組合物，其可用于治療腫瘤。更具體地，本發明涉及的抗CD146的單克隆抗體AA98或其功能片段與抗VEGF的單克隆抗體貝伐單抗或其功能片段的組合物能夠共同抑制VEGF-VEGFR-2信號通路的活化及其引起的內皮細胞的遷移及血管生成等功能，從而更加有效地抑制腫瘤生長，更具體地抑制胰腺腫瘤。
【背景技術】
[0002]癌癥是當前危害人類生命健康的頭號殺手。我國每年惡性腫瘤的發病人數約260萬。死于癌癥者占死亡總人數的20%以上，居城市居民死亡原因的第一位(根據2005年統計資料)。
[0003]目前，在腫瘤三大常規〈放療，化療和手術> 治療中，藥物治療是一個重要方面。目前影響腫瘤藥物治療效果的因素是多方面的，包括藥物的特異性、運輸方式、滲透性以及誘發腫瘤耐藥性。其中藥物的特異性和耐藥性是腫瘤治療學急需解決的關鍵問題。抗腫瘤血管治療以其腫瘤特異性、廣譜性、無或低耐藥性等優勢已成為腫瘤治療中的一種重要手段。其理論依據主要是上世紀七十年代Folkman提出的血管生成的概念，即新生血管為腫瘤提供營養和氧供應，進而促進腫瘤的生長及轉移。
[0004]大量研究發現，與腫瘤血管生成向關的因子已有30余種，如血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),轉化生長因子(transforming growthfactor-, TNF),成纖維細 胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF),腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF),促血管生成素(angiopoietins)等。其中，VEGF 被證實是最主要的直接作用于血管生 成 的高度特異性的生長因子。腫瘤細胞能合成并周期性分泌VEGF所分泌的VEGF與血管內皮細胞上的VEGF受體(VEGFRs)相結合，從而促進腫瘤血管生成。VEGF促血管生成的信號轉導主要通過其與VEGFR-2的結合來實現的。目前上市的抗血管生成藥物大多都是以這些信號轉導通路中的關鍵信號分子作為藥物靶點而設計的，如抗VEGF的單克隆抗體貝伐單抗(Bevacizumab, Roche公司),抗VEGFR-2的單克隆抗體DC101等。與此同時，研究發現VEGFR-2存在共受體，例如⑶44，它能夠與VEGFR-2相互作用，作為其共受體調節VEGFR-2介導的血管生成過程。因此，靶向此類共受體也能夠有效地抑制腫瘤的血管生成進而抑制腫瘤生長。
[0005]與此同時，靶向腫瘤血管的抗體免疫治療中仍存在一些問題及瓶頸，如抗體治療往往不能徹底殺死全部腫瘤細胞，剩余細胞容易在停藥后復發。并且，單一靶點的抗體治療具有局限性，不能夠達到有效地治療效果。因此尋找新的治療靶標并且發現更有效的治療策略是亟待解決的問題。
【發明內容】
[0006]本發明首次提出⑶146是VEGFR-2的共受體，抗⑶146的單克隆抗體AA98與抗VEGF的單克隆抗體貝伐單抗(Bevacizumab, Roche公司)的組合物可以作為治療腫瘤的
新型靶向藥物。在動物腫瘤模型中(如人胰腺癌)，與單--種抗體藥物治療腫瘤相比較，
AA98與貝伐單抗的組合物可以更加有效地抑制腫瘤血管生成進而抑制腫瘤生長。
[0007]抗CD146抗體AA98與貝伐單抗抗體聯合在抗腫瘤治療中的應用是基于以下重要的科學發現:⑴⑶146與VEGFR-2相互作用，是VEGFR-2的共受體；⑵抗⑶146單克隆抗體AA98能夠阻斷CD146與VEGFR-2之間的相互作用，進而阻斷VEGF刺激引起的VEGFR-2的活化及下游信號(Akt和p38/NF- K B)的激活；(3)抗CD146單克隆抗體AA98抑制由VEGF誘導的內皮細胞的遷移及血管生成；(4)裸鼠荷瘤模型中(人胰腺癌細胞系SW1990)，AA98與貝伐單抗聯合用藥更有效地抑制腫瘤血管生成進而抑制腫瘤生長。
[0008]綜上所述，CD146作為VEGFR-2的共受體能夠調節并輔助VEGF-VEGFR-2信號的傳遞，進而影響內皮細胞的遷移及血管生成。相對于AA98或貝伐單抗單獨用藥，我們自主研制的抗CD146功能性抗體AA98與貝伐單抗聯合用藥在裸鼠荷瘤模型中能夠更加顯著地抑制腫瘤血管生成進而抑制腫瘤生長。因此，我們提出靶向作為VEGFR-2的共受體⑶146能夠更加有效地抑制腫瘤生長，抗CD146的單克隆抗體AA98與貝伐單抗的藥物組合物是治療腫瘤的新型靶向藥物。AA98可以通過抑制VEGFR-2與⑶146之間的相互作用，抑制VEGF引起的信號通路的激活，進而阻斷血管生成，切斷腫瘤的養分供應，從而抑制腫瘤生長。AA98與貝伐單抗聯合能夠更加有效地切斷決定腫瘤生長的信號通路的活化，更加顯著的抑制腫瘤的生長。
[0009]具體地，本發明提供以下各項:
[0010]1.一種包含抗⑶146抗體或所述抗CD146抗體的功能片段和抗VEGF抗體或所述抗VEGF抗體的功能片段的組合物，所述組合物用于抑制腫瘤血管新生，從而抑制腫瘤生長。
[0011]2.根據第1項所述的組合物，其中所述腫瘤是胰腺腫瘤。
[0012]3.根據第1項或第2項所述的組合物，其中所述抗CD146抗體是抗CD146單克隆抗體AA98,而所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
[0013]4.根據第1項所述的組合物在制備用于抑制腫瘤生長的藥物中的用途。
[0014]5.根據第4項所述的用途，其中所述腫瘤是胰腺腫瘤。
[0015]6.根據第4項或第5項所述的用途，其中所述抗CD146抗體是抗CD146單克隆抗體AA98,而所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
[0016]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特征和優點將更明顯，其中:
[0018]圖1?CD146與VEGFR-2在分子水平相互作用。A，人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中，免疫共沉淀方法發現⑶146與VEGFR-2相互作用；B，HEK293T中，免疫共沉淀方法驗證CD146與VEGFR-2之間的相互作用；C，體外pull-down實驗發現CD146的胞外區與VEGFR-2胞外區存在直接相互作用；
[0019]圖2.抗CD146單克隆抗體AA98通過阻斷⑶146與VEGFR-2之間的相互作用(A)，阻斷VEGF誘導的VEGFR-2信號通路的活化(B-F)；
[0020]圖3.在體外水平，AA98抑制VEGF誘導的內皮細胞遷移(A)及血管生成(B)；
[0021]圖4.荷瘤小鼠模型中，與AA98或貝伐單抗單獨給藥組比較，AA98與貝伐單抗聯合用藥能夠更加有效地抑制腫瘤生長。(A)不同給藥組腫瘤大小示意圖；(B)相比較于AA98或貝伐單抗單獨給藥，AA98與貝伐單抗聯合給藥能夠更加有效地抑制腫瘤的大小；(C)相比較于AA98或貝伐單抗單獨給藥，AA98與貝伐單抗聯合給藥能夠更加有效地抑制腫瘤的重量；(D)相比較于AA98或貝伐單抗單獨給藥，AA98與貝伐單抗聯合給藥能夠更加有效地抑制腫瘤血管生成。
【具體實施方式】
[0022]本說明書中使用的抗體AA98(Yan, X 等 A novel ant1-CD146monoc1nalantibody, AA98, inhibits angiogenesis and tumor growth.Blood.2003 ； 102 (I):184-191.)、AAl (本實驗室自主生產，保藏機構:中國普通微生物保藏中心；保藏號=CGMCCN0.2310 ;保藏日期:2007.12.28)等可分別根據中國專利申請號99107586.2 (CN1234405)、中國專利申請號200810057260.7 (CN101245101)的描述獲得。貝伐單抗(Bevacizumab)購自Roche公司。
[0023]實施例一:細胞水平，CD146與VEGFR-2相互作用；
[0024]⑶146與VEGFR-2兩者均是內皮細胞的標志物，并且是血管生成過程中起關鍵作用的分子，但是兩者的聯系并不清楚。為了研究兩者之間的關系，我們在細胞水平，利用免疫共沉淀等方法證實，⑶146與VEGFR-2存在相互作用。抗⑶146單克隆抗體AA98能夠阻斷CD146與VEGFR-2之間的相互作用。
[0025]主要材料:人臍靜脈內皮細胞系(HUVECs) (ATCC，CRL-1730)，穩定轉染CD146cDNA的 HEK293T 細胞系(ATCC，CRL-11268) (HEK293T/CD146)等。
[0026]主要試劑:細胞裂解液，PBS，鼠源抗⑶146單克隆抗體AAl (本實驗室自主生產。保藏機構:中國普通微生物保藏中心；保藏號=CGMCC N0.2310 ;保藏日期:2007.12.28)，兔抗 VEGFR-2 抗體(購自 Cell Signaling Technology 公司，貨號 #2479)，His_sCD146 蛋白(購自 Sino Biological Inc.，貨號50794-M08H)，Fc_VEGFR_2蛋白(購自 Sino BiologicalInc.，貨號 10012-H02H), Fe 蛋白(購自 Sino Biological Inc.，貨號 10702-HNAH)，VEGF蛋白(購自 Upstate Biotechnology 公司，貨號 B500014)。
[0027]主要方法:免疫共沉淀及體外pull-down實驗，具體方法如下:
[0028]免疫共沉淀:
[0029]I)將IXlOVml的人臍靜脈內皮細胞或經過瞬時轉染VEGFR-2質粒(10 y g) (LenaClaesson-Welsh et al.EMBO J.2005 July 6 ；24(13):2342-2353.)的 HEK293T/CD146 接種于IOOmm培養皿中，當細胞密度達到90%后將細胞輕輕刮下，4°C離心5分鐘離心收集于Ep管中。
[0030]2)力卩入 600 ii I 裂解液 RIPA Buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.4，I % NP-40，0.25 % Na-deoxycholate,150mM NaCl,ImM EDTA，ImM Na3V04,ImM NaF，ImM PMSF和 ImM proteinase inhibitors cocktails (蛋白酶抑制劑，購自 Roche 公司，貨號04693116001))，冰上裂解 30 分鐘，4°C離心(12，000g) 15 分鐘。[0031]3)吸取上清為細胞裂解液，經Bradford法測定蛋白濃度之后，將總蛋白濃度稀釋至 lmg/ml0
[0032]4)在裂解液中加入20 ii I protein G_Agarose，4°C孵育I小時，去除與20 ii Iprotein G-Agarose非特異結合的蛋白質。
[0033]5)離心取上清，加入2 ii g的CD146單克隆抗體AAl或兔抗VEGFR-2抗體，4°C孵育2小時。
[0034]6)再次加入 50 U I protein G-Agarose, 4°C孵育 I 小時。
[0035]7)離心棄上清,沉淀的agarose beads用含蛋白酶抑制劑的PBS洗3次,每次5分鐘后加入上樣緩沖液100 U I渦旋2分鐘，100°C煮10分鐘，離心取上清。
[0036]8)處理好的蛋白樣品及全細胞裂解液留樣一起用于Western blot檢測。
[0037]體外pull-down 實驗:
[0038]I)將 Fc-VEGFR-2 蛋白 200ng 或 Fe 蛋白 200ng 與 His_CD146 蛋白 200ng —起融于500 u I PBS的EP管中，4°C孵育I小時。
[0039]2)加入 20 U I protein G beads, 4°C孵育 I 小時。
[0040]3) 4°C離心5分鐘,棄上清,沉淀的agarose beads用含蛋白酶抑制劑的PBS洗3次，每次5分鐘后，加入上樣緩沖液50 u I渦旋2分鐘，100°C煮10分鐘。
[0041]4)處理好的蛋白樣品用于Western blot檢測。
[0042]結果如圖1顯示，在HUVECs (A)中，用抗⑶146抗體AAl捕獲⑶146的同時可以結合VEGFR-2，反之亦然，說明CD146與VEGFR-2存在相互作用。在HEK293T/CD146 (B)中，轉染VEGFR-2的細胞中，兔抗VEGFR-2的抗體可以同時捕獲VEGFR-2與CD146，但在只表達⑶146的細胞中，Western blot的結果中檢測不到⑶146，此結果驗證了 A的結論，即⑶146與VEGFR-2存在相互作用。在體外pull-down實驗中，如(C)所示，CD 146與VEGFR-2之間存在直接相互作用。另外，利用抗CD146單克隆抗體AA98或AAl(100iig/ml)分別孵育HUVECs, 370C I小時后，用細胞培養基清洗三遍，將以上經過處理的細胞用于免疫共沉淀實驗，如(D)所示，在HUVECs中，抗CD146單克隆抗體AA98能夠阻斷內源的CD146與VEGFR-2之間的相互作用。以上結果說明內皮細胞中⑶146與VEGFR-2直接相互作用，抗⑶146單克隆抗體AA98能夠阻斷兩者之間的相互作用。
[0043]實施例二:抗CD146抗體通過阻斷CD146與VEGFR-2之間的相互作用，阻斷VEGF刺激引起的VEGFR-2信號通路的活化；
[0044]粘附分子⑶146在血管生成過程中具有關鍵作用。作為VEGFR-2的共受體，⑶146調節VEGFR-2信號通路。抗CD146單克隆抗體AA98能夠阻斷CD146與VEGFR-2之間的相互作用，進而阻斷VEGF刺激引起的VEGFR-2信號通路的活化。
[0045]利用抗CD146單克隆抗體AA98或AAl (100 u g/ml)分別孵育HUVECs，37°C I小時后，用細胞培養基清洗三遍后，再用VEGF(50ng/ml)刺激后裂解細胞用于生化分析信號通路。如圖2(A)所示，在HUVECs中，AA98能夠阻斷內源的⑶146與VEGFR-2之間的相互作用。如(B-F)所示，VEGF刺激(5分鐘)能夠引起VEGFR-2的磷酸化，以及下游信號分子，如Akt (15分鐘)，p38(15分鐘)，NF-kB(10小時)的活化。AA98能夠阻斷由VEGF刺激引起的VEGFR-2及下游分子Akt，p38，NF-kB的活化。說明CD146能夠參與并調節VEGF-VEGFR-2信號通路活化。[0046]實施例三:抗⑶146抗體抑制VEGF刺激引起的內皮細胞的遷移及血管生成能力；
[0047]血管生成主要為腫瘤提供養分，并為腫瘤細胞轉移的提供途徑，因此對于腫瘤的生長起到至關重要的作用。抑制血管生成就能夠很大程度的抑制腫瘤的生長。VEGF是腫瘤細胞分泌的主要細胞因子，其介導的信號通路最終決定腫瘤血管生成。CD146參與并調節VEGF-VEGFR-2信號通路，抗⑶146的抗體抑制VEGF刺激引起的內皮細胞的遷移及血管生成。
[0048]主要材料:人臍靜脈內皮細胞系，96孔Transwell板(Corning HTS Transwell-96Cell Migration Products)等。
[0049]主要試劑:VEGF(購自Upstate Biotechnology 公司，貨號 B500014),抗 CD146 抗體 AA98、AAl,鼠 IgG (mlgG,購自 Sigma-Aldrich 公司，貨號 15381)，Matrigel (不含生長因子，BD Biosciences，貨號 354234)。
[0050]主要方法:細胞遷移實驗，內皮細胞成血管實驗。具體方法如下:
[0051]細胞遷移實驗:
[0052]l)HUVECs細胞以完全培養基重懸，制成單細胞懸液(lX105/ml)。
[0053]2) Transwell下室加入含10 %胎牛血清的RPM1-1640培養基(購自Gibco，貨號31800-022) (200 yl/孔)，上室加入細胞懸液(100 U I/孔，每種處理設三個平行孔)，
[0054]3)向上室的細胞中加入抗體AA98或AAl (IOOii g/ml)與刺激劑VEGF (100ng/ml)。在37°C二氧化碳培養箱中孵育過夜。
[0055]4)將膜上層的細胞用棉簽擦掉，用鑷子將96孔transwell板的膜揭下，膜下層朝上放于載玻片上。
[0056]5)下層細胞以4%多聚甲醛室溫固定15分鐘后，用1%結晶紫染色15分鐘，鏡檢記錄每個視野下的細胞數量。
[0057]內皮細胞成血管實驗是在Nagata等人建立的實驗方法的基礎上改進而來，具體操作如下:
[0058]l)HUVECs細胞以完全培養基重懸，制成單細胞懸液(lX105/ml)。
[0059]2)在96孔板中包被冰浴的Matrigel (50 yl/孔)，37°C固化30分鐘。
[0060]3)向每個孔中加入100 U I細胞懸液，同時相應地加入刺激劑VEGF(100ng/ml)及抗體 AA98 或 AAl (100 u g/ml)。
[0061]4) 37°C培養箱中孵育過夜，之后在倒置顯微鏡下觀察，拍照。
[0062]實驗結果如圖3(A)所示，VEGF能夠增加內皮細胞的遷移能力及，與AAl對照組相比，抗CD146抗體AA98能明顯降低VEGF刺激所引起的內皮細胞的遷移力，抑制率約為53%。同樣的，用VEGF刺激HUVECs可以促進HUVECs形成血管樣結構。然而，相對于AAl處理組，AA98明顯地抑制VEGF刺激所引起的內皮細胞的血管生成能力。以上結果證實，⑶146對于VEGFR-2所介導的血管生成過程是必須的。
[0063]實施例四:在裸鼠荷瘤模型中，與單獨的AA98或貝伐單抗相比較，AA98與貝伐單抗的組合物能夠更加顯著地抑制人胰腺癌腫瘤血管生成進而抑制腫瘤生長。
[0064]在腫瘤的發生發展過程中，血管生成為腫瘤提供養分，并為腫瘤細胞轉移的提供途徑。目前靶向腫瘤血管生成已經成為臨床上治療腫瘤的主要策略之一。動物實驗證實，AA98與貝伐單抗聯合用藥能夠更加有效地抑制腫瘤生長。[0065]實驗方法:選擇60只4周大小雌性的BalB/C裸鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，隨機分為6組以分別給予不同的抗體進行治療，每組10只。分別在背部皮下注射I X IO7個人胰腺癌細胞系SW1990細胞(ATCC，CRL-2172)(重懸在100 u I PBS中)。待腫瘤體積達到0.06cm3,開始腹腔注射抗體,分別為mIgG(購自Sigma-Aldrich公司，貨號 15381 ;200iig/只)，hIgG(購自中杉金橋，貨號 ZDR-5001 ;200iig/只)，AAl (200 u g/只)，AA98 (200 u g/只)，貝伐單抗(購自Roche公司；200 u g/只)，AA98+貝伐單抗(AA98和貝伐單抗分別200 u g/只，共計400 u g/只)，每周2次，測量腫瘤的長、寬，以便計算腫瘤體積。4周后脫頸法處死所有小鼠,剝離腫瘤。將腫瘤稱重后，用4% PFA固定24小時,石蠟包埋，切片，免疫組化分析。以下為石蠟切片的免疫組化過程:
[0066]I)取出片子，入二甲苯溶液37°C脫蠟兩次，每次30分鐘；
[0067]2)入無水乙醇X2-95% -80% -70% -50% _30%和蒸餾水中水化，室溫每次5分鐘；
[0068]3) 0.3%過氧化氫/甲醇溶液37°C避光處理30分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性，PBS洗三次；
[0069]4)pH6.0檸檬酸修復液100°C水浴30分鐘抗原熱修復，自然冷卻；
[0070]5) 5%的正常羊血清(購自中杉金橋公司，貨號ZLI_9021)37°C封閉I小時；
[0071]6)加入PBS稀釋的一抗(兔抗CD31多抗，購自Abcam公司，貨號ab28364 ;1: 50稀釋)，4°C孵育過夜；
[0072]7)PBS洗三次；山羊抗-兔-生物素(購自中杉金橋公司，貨號ZB-2010 ;1: 1000稀釋)在37°C孵育I小時，PBS洗三次；
[0073]8)親和素-HRP(購自 Hyclone-pierce 公司，貨號 NlOO ;1: 1000)在 37°C孵育 45分鐘；
[0074]9)現配的DAB(購自中杉金橋公司，貨號ZL1-9032 ;1: 1000稀釋)避光顯色2_7
分鐘，蘇木素復染。
[0075]10)逐級脫水:50-70-80-90-100-100%乙醇-二甲苯，晾干，中性樹脂封片。
[0076]11)顯微成像系統中拍片。
[0077]結果顯示，如圖4所示，AA98與貝伐單抗組合物實驗組中，組合物對于腫瘤生長的抑制效果更明顯。與對照組(mlgG或hlgG組)相比較，組合物對于腫瘤體積的抑制百分比為70 %，而單獨的AA98或貝伐單抗的抑制率只有46 %或48 %。經過AA98與貝伐單抗的組合物處理的腫瘤的血管密度更少，分別為AA98或貝伐單抗單獨用藥組的血管密度的40%或30%。以上結果說明，AA98與貝伐單抗的組合物能夠更有效地抑制腫瘤血管生成進而抑制腫瘤生長。
【權利要求】
1.一種包含抗CD146抗體或所述抗CD146抗體的功能片段和抗VEGF抗體或所述抗VEGF抗體的功能片段的組合物，所述組合物用于抑制腫瘤血管新生，從而抑制腫瘤生長。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述腫瘤是胰腺腫瘤。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其中所述抗CD146抗體是抗CD146單克隆抗體AA98,而所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
4.根據權利要求1所述的組合物在制備用于抑制腫瘤生長的藥物中的用途。
5.根據權利要求4所述的用途，其中所述腫瘤是胰腺腫瘤。
6.根據權利要求4或權利要求5所述的用途，其中所述抗CD146抗體是抗CD146單克隆抗體AA98,而所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
【文檔編號】A61K39/395GK103505727SQ201210223311
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月28日 優先權日:2012年6月28日
【發明者】閻錫蘊, 姜天霞, 羅永挺, 段紅霞, 盧迪, 楊東玲, 馮靜 申請人:中國科學院生物物理研究所