專利名稱：一種寡核苷酸及其制備在防治心肌肥大與心力衰竭藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程及生物醫藥技術領域，涉及了一種寡核苷酸及其用于制備預防及治療病理性心肌肥大及心力衰竭藥物的用途。
背景技術：
慢性心力衰竭又稱充血性心力衰竭是指由于心肌收縮カ降低，在有充分靜脈回流的前提下，心臟排出血量絕對或相對減少，不能滿足全身組織器官代謝需要的ー種病理狀態，是多種病因造成的心臟疾病的終末階段。隨著人民生活水平和生活方式的改變，加上競爭的加劇和社會的老齡化，心カ衰竭的發病率呈逐年増加的趨勢。因此，如何預防及治療心力衰竭愈發顯得重要和緊迫。
近些年的臨床資料總結顯示，病理性心肌肥大、心室重構是心カ衰竭的特征，同時也是決定心力衰竭發病率，病程發展和死亡率的關鍵因素。導致病理性心肌肥大的典型疾病包括高血壓，心肌梗死、心肌病及瓣膜病等。心肌肥大通常伴隨著多種基因的改變，研究顯示，ANF和belta-MHC是最典型的心肌肥大的標志性蛋白，同時，伴隨著心肌肥大的發展，心肌的間質細胞如成纖維細胞增殖，心臟纖維化，進而心臟的順應性降低，射血功能也受到明顯的影響，并最終使心律失常、心衰及猝死的發生率増加。因此，心肌肥大是慢性心力衰竭的病理變化的核心步驟，使用藥物干預和逆轉心肌肥大是防治慢性心カ衰竭的有效手段。目前，在心肌肥大及心力衰竭的防治方面，常用的主要有受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE I)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)、利尿剤、醛固酮受體拮抗劑及洋地黃類制劑。然而，長期應用利尿劑可引起藥物抵抗和腎的再灌注損傷，應用ACE I、ARB和β-受體阻滯劑則會引發高血壓、腎功能的惡化及高鉀血癥，因此，迫切需要尋找新的治療方法來用于心肌肥大及心力衰竭的治療。寡核苷酸是含ー類含有非甲基化胞嘧啶一鳥嘌呤二核苷酸基序的單鏈DNA序列，其主要通過與Toll樣受體9 (Toll-like receptor9, TLR9)的結合發揮刺激作用。研究顯示，寡核苷酸能直接活化機體的天然免疫系統，誘導產生以Thl型為主的免疫應答，間接活化獲得性免疫。因此，寡核苷酸被廣泛的應用于腫瘤、病毒感染及過敏性疾病的治療中，并在臨床前及臨床實驗研究中取得了可喜的成果。有趣的是，許多TLR受體激活后導致ΡΙ3Κα信號通路激活，后者能夠有效防止病理性心肌肥大，但至今，未見寡核苷酸有改善心室重構、心肌肥大作用的報道。本發明提供一種新穎有效的抗心肌肥大及心力衰竭的方法，將為臨床治療心カ裳竭提供新的選擇。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸及其功能類似物在制備防治心肌肥大、心力衰竭藥物中的應用，達到防治心カ衰竭等心臟疾病的目的。本發明首先提供了ー種能夠有效抑制心肌肥大和慢性心力衰竭的發生發展的含有序列片段5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸。本發明同時給出了含有以上所述的序列片段且能夠有效抑制病理性心肌肥大和慢性心力衰竭的發生與發展的寡核苷酸序列及其功能類似物。本發明同時提供了以上所述的寡核苷酸序列片段5’-AACGTT_3’、以及含有該序列片段5’ -AACGTT-3的寡核苷酸序列及其功能類似物在制備治療心、腦血管疾病(包括心肌肥大、心室重構；急、慢性心力衰竭；及心肌肥大和心衰相關的心律失常或猝死)的藥物制劑中的用途。同時還提供了以上所述的寡核苷酸序列及其功能類似物在制備治療高血壓、冠心病、瓣膜病、心肌病的藥物制劑中的用途。所述的寡核苷酸序列及其功能類似物可以單獨應用，或自身聯合應用，或與ー種或幾種其他的治療心血管疾病的藥物聯合應用。所述的治療心血管疾病的藥物可以是β_受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE I)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)、利尿劑、醛固酮受體拮抗劑及洋地黃類制劑。
本發明所述的寡核苷酸序列及其功能類似物在給予個體時可以單獨應用或做為藥物組合中的有效成分與藥物學可接受的載體一起應用。所述的寡核苷酸序列及其功能類似物在應用個體時可經腸道、非腸道(如皮下注射、靜脈注射和肌肉注射等)和外用及吸入等給藥途徑實施。所述的寡核苷酸序列及其功能類似物的應用劑量為治療的有效劑量。本發明中的術語除非特別強調，本發明中的術語具有可以被本發明所屬領域內技術人員所理解的通常意義。若出現含義上的沖突，應遵從本發明中的解釋、界定或說明。“病理性心肌肥大及慢性心力衰竭”本發明中的“病理性心肌肥大”和“慢性心力衰竭”即現代醫學定義的病理性心肌肥大和慢性心カ衰竭，其中病理性心肌肥大是心肌細胞在各種病理性刺激下所產生的ー種以心肌細胞增大為主要特征的代償性改變，慢性心力衰竭是指由于心肌收縮カ降低，在有充分靜脈回流的前提下，心臟排出血量絕對或相對減少，不能滿足全身組織器官代謝需要的ー種病理狀態。研究表明，包括冠心病、瓣膜病、高血壓及先天性心臟病等多種心血管疾病的發生與發展過程中均伴隨著病理性心肌肥大的出現，而多種心血管疾病的終末階段均表現為心力衰竭。因此，本研究所涉及的病理性心肌肥大和心カ衰竭的治療包括但不限于冠心病、瓣膜病、高血壓及先天性心臟病等多種心血管疾病的治療。“個體”個體是指應用本發明寡核苷酸的人類個體和非人類脊椎動物個體。非人類脊椎動物個體包括非人類靈長類動物，畜牧動物和寵物動物。“抗病理性心肌肥大及心力衰竭藥物”抗病理性心肌肥大及心力衰竭藥物是指個體用于治療病理性心肌肥大及心力衰竭的藥物，包括但不限于β_受體阻滯劑，血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE I)，血管緊張素受體拮抗劑(ARB)，利尿剤，醛固酮受體拮抗劑及洋地黃類制劑。本發明中的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物可以單獨應用，或幾種聯合應用，或應用藥物可接受的載體，或和ー種或幾種其他的抗病理性心肌肥大藥物聯合應用。本發明提供的5’-AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物可以和其他的抗病理性心肌肥大藥物同時應用，或按先后次序應用。“寡核苷酸”寡核苷酸是由糖(如脫氧核糖或核糖)，磷酸基團和堿基組成的單核苷酸連接而形成的分子，其中糖分子和堿基連接成核苷(nucleoside),核苷由磷酸基團連接形成核苷酸(nucleotide),形成核苷的堿基有喃唳和嘌呤，喃唳有胸腺喃唳(thymine,縮寫為T或t)和胞喃唳(cytosine,縮寫為C或c),嘌呤有腺嘌呤(adenine,縮寫為A或a)和鳥嘌呤(guanine，縮寫為G或g)。寡核苷酸可以是單鏈的也可以是雙鏈的。在本發明中，“寡核苷酸”(Oligodeoxynucleotide, 0DN)可以用它的英文縮寫ODN代替。“化學修飾”與自然的DNA相比，本發明中的寡核苷酸可以經各種化學修飾，修飾的部位可發生在核苷之間的磷酸ニ酯鍵，核糖単位或/和有機堿基(A、T、C、G，尿嘧啶，uridine，縮寫為U或U)。在寡核苷酸的合成期間或合成后都可以進行修飾。在合成期間的化學修飾可以在 寡核苷酸的內部或5'端進行修飾。合成后的寡核苷酸可以但不限于在活性基團(如5'或3'端的磷酸或羥基)進行化學修飾。專業人員可以了解這些化學修飾具體方式。本發明中的化學修飾包括寡核苷酸的骨架修飾。其中，至少ー個核苷酸間鍵合中的非橋性磷酸氧原子被硫原子取代。寡核苷酸的骨架也可發生非離子DNA類似物，如烷基、芳香-碳磷酸鹽化合物(帶電荷的碳磷酸鹽化合物氧原子被烷基、芳香基取代)修飾，再如磷酸ニ酯和烷基磷酸三酯中的氧原子部分被烷基化修飾。寡核苷酸還可以是磷硫酰和磷酸ニ酯的嵌合體。化學修飾還包括堿基替代，如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代嘌呤替代。化學修飾還包括堿基修飾。修飾的堿基在化學上不同于典型的自然中的堿基，但具有它們基本的化學結構。本發明中的寡核苷酸還可以用胞嘧啶衍生物或胸腺嘧啶核苷衍生物修飾。這里胞嘧啶衍生物是指胞嘧啶樣核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧樣核苷(不包括胸腺嘧啶)。另外，本發明中的寡核苷酸的修飾可以是在寡核苷酸的兩個或ー個末端連接ー個ニ元醇，如四こニ醇或六こニ醇。“治療有效劑量”為了治療病理性心肌肥大，給個體應用的劑量是治療有效劑量。該治療的有效劑量是指在治療病理性心肌肥大的過程中，給予個體后可產生理想的預防或治療效果的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物的劑量。本發明中的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物可以直接或放到藥物學上可接受的載體中應用。這個“劑量”的多少決定于本領域技術熟練人員應知的標準技術，還要參考其他因素，包括并不限于個體的體重、年齡、健康狀況和疾病的嚴重程度。本發明中的寡核苷酸可以用作単獨治療或多次治療。本發明中的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物每次應用到個體的劑量范圍從I μ g到100mg。為了達到理想的治療效果，本領域技術熟練人員可以對應用的劑量作調整，如主治醫師在可靠的醫療判斷的基礎上，做出的劑量調整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍。“藥物組合物”藥物組合物指的是治療有效劑量的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸及其功能類似物與藥物學上可接受的載體組成的混合物。藥物組合物可以包含一個或多個本發明中的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸及其功能類似物。藥物組合物可以但不限于水溶液、鹽溶液、顆粒、氣溶膠、片劑、粉劑、膠囊劑、栓劑、乳劑、滴劑和其他合適的物質。在各種情況下，藥物組合物必須是無菌和穩定的。“藥物學可接受的載體”藥物學可接受的載體是指ー種或多種固體或液體的填充劑、稀釋劑或包封物質，此載體適合將本發明中的寡核苷酸應用于個體。該載體可以是有機的、無機的、天然的或合成的。該載體包括各種溶液、稀釋劑、溶剤、分散劑、脂質體、乳劑、糖衣、抗菌劑、抗真菌劑、和其他的適合本發明中的寡核苷酸的載體。藥物學可接受的載體的選擇決定于本發明中含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物的應用方式。可注射用的載體包括水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖溶液、甘油等。本發明的優點和有益效果本發明提供了含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物，以及應用該寡核苷酸或其功能類似物用于制備治療心肌肥大藥物的用途。本發明提供的含5’-AACGTT-3’的 寡核苷酸或其功能類似物含有5’ -AACGTT-3’序列。本發明提供的含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物在細胞及動物實驗中均可以抑制心肌肥大的發生與發展。同時，含5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸或其功能類似物為免疫調節劑，對人體未見明顯的毒副作用。
圖I是寡核苷酸(ODN)對新生大鼠心肌細胞肥大過程中的ANF和β -MHC的mRNA表達的抑制作用4是各寡核苷酸對ANF表達的抑制作用，B是各寡核苷酸對β-MHC表達的抑制作用；對照組溶媒對照組；模型組異丙腎上腺素刺激后的心肌肥大模型組。圖2是寡核苷酸(ODN)對心肌肥大過程中ANF蛋白表達的抑制作用；Α是間接免疫熒光法檢測寡核苷酸(ODN)對心肌肥大過程中ANF蛋白表達的抑制作用，對照組溶媒對照組；模型組異丙腎上腺素刺激后的心肌肥大模型組；RJL01組寡核苷酸RJLOl加上異丙腎上腺素刺激組是對A圖的統計學處理；圖3是寡核苷酸(ODN)抑制心肌肥大過程中ANF和β -MHC的表達的劑量曲線；Α是不同濃度寡核苷酸RJLOl對ANF表達的抑制作用，B是不同濃度寡核苷酸RJLOl對β -MHC表達的抑制作用；圖4是寡核苷酸(ODN)抑制心肌肥大過程中ANF和β -MHC的表達的時間曲線；A是不同時間點加入寡核苷酸RJLOl對ANF表達的抑制作用，B是不同時間點加入寡核苷酸RJLOl對β -MHC表達的抑制作用；圖5是寡核苷酸(ODN)對心肌肥大過程中的心肌細胞表面積增大的抑制作用；Α是間接免疫熒光法檢測寡核苷酸(ODN)對心肌肥大過程中的心肌細胞表面積增大的抑制作用，對照組溶媒對照組；模型組異丙腎上腺素刺激的心肌肥大模型組；RJL01組寡核苷酸R幾01加上異丙腎上腺素刺激組；B是對A圖的統計學處理；圖6是寡核苷酸(ODN)對小鼠心肌肥大模型的抑制作用；A寡核苷酸對心室肥厚的抑制作用，B是寡核苷酸對心臟重量的抑制作用；(是寡核苷酸對心體比的抑制作用山是寡核苷酸對心肌細胞壞死的保護作用，對照組溶媒對照組；模型組異丙腎上腺素刺激的小鼠心肌肥大模型組；RJL01組注射寡核苷酸RJLOl后在注射異丙腎上腺素的模型組。
具體實施例方式實施例中的寡核苷酸由TAKARA公司合成，并經無熱源處理。以下是在實施例中應用的寡核苷酸(ODN)的序列和名稱RJL-I(SEQ ID NO:I):5， -tcgtcgttaa cgttaacgct tag-3J (23bp)RJL-2(SEQ ID NO:2):5， -tcttcgttaa cgttaacgat gacgta-3， (26bp)RJL-3(SEQ ID NO:3):5， -taaacgaacg ttttaacgtt cgttta-3， (26bp)RJL-4(SEQ ID NO:4):5， -tcgtcgttaa cgttaagacg taggg-3， (25bp)RJL-5(SEQ ID NO:5):5， -tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcggg-3， (30bp)實施例I寡核苷酸(ODN)對新生大鼠心肌細胞肥大過程中的ANF和β -MHC的mRNA表達的抑制作用I新生大鼠心肌細胞的分離、心肌肥大模型的誘導和寡核苷酸的處理(I)儀器設備、器材、試劑和材料低溫冰箱，ニ氧化碳孵箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，細胞培養瓶，水平離心機，加樣器，各種規格的滴管等。ODN :均由Takara公司合成，OPC級別，其磷酸骨架除特殊標明外均為全硫代修飾。以PBS (配方參考《分子克隆實驗指南(第三版)》)溶解，紫外分光光度計定量。異丙腎上腺素(異丙腎上腺素)，胰酶，II型膠原酶，ITS和Laminin均購于Sigma公司。HBSS, DMEM,雙抗(PS)和FBS購于Gibco公司。(2)方法斷頭處死新生大鼠，打開其胸腔，取出心臟，修剪掉主動脈，把心室放至含有HBSS的小皿中，將其剪成四小塊；把切好的心室轉移至含有1%胰酶溶液的培養瓶中，放入冰箱4°C保存10-12h ;向培養瓶中加入IOml新生大鼠心肌細胞的分離I液(DMEM+7%FBS+1%PS)，37°C水浴3min ;吸出瓶中液體，加入IOmlII型膠原酶溶液(lmg/ml )，37°C水浴輕搖2min ；吸出液體，再加入IOmlII型膠原酶溶液，37°C水浴搖6_10min ;收集膠原酶/細胞懸液于50ml離心管中，井置于冰上；向剩下的心室組織中繼續加入II型膠原酶溶液，重復步驟，直至看不到心室肌小塊；用100目尼龍網過濾收集到的細胞懸液,500rpm離心5min ;用新生大鼠心肌細胞的分離I液懸浮細胞沉淀；將懸浮好的細胞懸液轉移至培養瓶中，置于培養箱中培養75min ;將細胞懸液吸出，轉移至另ー培養瓶中，置于ニ氧化碳培養箱中培養24h ；將分離I液吸出更換為新生大鼠心肌細胞分離II液(DMEM+1%ITS+1%PS)繼續培養12h后，加入0DNRJL01，RJL02, RJL03, RJL04, RJL05至終濃度10mg/ml，作用12h后，加入異丙腎上腺素至終濃度1(^11101/1111，繼續孵育4811后，進行后續實驗；其中的對照組為溶媒對照組，實驗過程中只加入PBS的溶媒對照；模型組為異丙腎上腺素刺激后的心肌肥大模型組，不進行ODN的刺激，只加入異丙腎上腺素作用48h。2、總RNA的提取、逆轉錄及實時定量PCR(I)儀器設備、器材、試劑和材料低溫冰箱，實時定量PCR R(Eppendorf),紫外分光光度計，低溫離心機，各種滴
管，離心管等。Trizol 購于 Takara,逆轉錄酶，Oligo dT, dNTPs, SYBR-green 等均購于invitrogen。
(2)方法總RNA的提取PBS洗滌經處理的細胞3次，加入Trizollml，吹打10次后，收集到離心管中，靜置5min ;加入氯仿200 μ I,振蕩混勻2min,靜置15min, 12000轉離心15min,取上清約500 μ I到一新的離心管中，加入異丙醇500 μ I,靜置15min, 12000轉離心IOmin,棄上清，加入75%こ醇1ml，12000轉離心5min，棄上清，室溫下干燥lOmin，以20 μ I無酶水溶解沉淀，做為模板進行后續實驗。RT-PCR
I)將下列成分加入置于冰上的PCR管中Oligo dTI μ I模板RNAI μ g無酶水補足至10 μ I2)輕輕混勻，70°C孵育6min，置于冰上5min;3)將下列成份加入該管中
S^RT buffer5 μ
MLVI μ
RNA Enzvme inhibitor 0.5 μ dNTPs μ
無酶水7.5 μ 4) 42°C 60min,70°C IOmin終止反應，即為cDNA，置于4°C保存進行后續實驗。實時定量PCR反應體系
SYBR GreenER qPCR SuperMix for iCycler10 μ
上游引物，10 μΜ0.5 μ
下游引物，10 μΜ0.5 μ
cDNAI μ
DEPC 水8.0 μ I反應程序①50 °C 2 分鐘②95 °C 2 分鐘③％でI5秒④60 °C I 分鐘⑤返回步驟③，重復③和④29次⑥溶解曲線引物序列ANF: 5'端引物gggggtagga ttgacaggat3，端引物ctccaggagg gtattcaccaβ -MHC: 5'端引物cctcgcaata tcaagggaaa
3’ 端引物tacaggtgca tcagctccagl8s:5，端引物accgcagcta ggaataatgga3’端引物 gcctcagttc cgaaaacca3、實驗結果結果顯示，在新生大鼠心肌細胞肥大模型中，經異丙腎上腺素處理48h后，與對照組相比，ANF和β -MHC的mRNA表達顯著上調，其中ANF的表達上調約7倍，β -MHC的表達上調約3倍。經各個寡核苷酸處理12h后，ANF和β -MHC的表達顯著下降，與模型組相比，兩者的Ρ〈0. 001，具有統計學差異(圖I)。結論寡核苷酸可以顯著抑制心肌細胞肥大模型中ANF和β -MHC的mRNA表達上 調。實施例2寡核苷酸(ODN)對心肌肥大過程中ANF蛋白表達的抑制作用I、新生大鼠心肌細胞的分離和心肌肥大的誘導方法同實施例1，注意把細胞接種到鋪有20mm蓋玻片的培養皿中。2、間接免疫熒光檢測ANF蛋白的表達(I)儀器設備、器材、試劑和材料PI (sigma), ANF單克隆抗體(小鼠)購于Santa Cruz, FITC-突光二抗購于Invitrogen,共聚焦顯微鏡(Leica, Germany)。(2)方法吸去培養液，加入適量PBS清洗3次；加入4%甲醛溶液，室溫固定20min ;加入適量 PBS 充分清洗，加入 O. 5%Tritonl00，-20°C通透 IOmin ;2%BSA 封閉 Ih ;加入 ANF—抗(I 200稀釋)400 μ 1，室溫孵育lh，PBS清洗3次;加入熒光ニ抗(I :200稀釋)400 μ 1，室溫孵育lh，PBS清洗3次；PI復染2min，PBS清洗2次。80%甘油封片，使用共聚焦熒光顯微鏡拍照、分析。3、實驗結果結果顯示，新生大鼠心肌細胞肥大模型中，與對照組相比，心肌細胞的ANF表達顯著上調，ANF陽性表達的細胞可達到全部細胞的40%以上。經寡核苷酸RJLOl處理12h后，ANF的表達顯著下降，ANF陽性表達的細胞只達到全部細胞的10%，與模型組相比，兩者的P〈0. 001，具有統計學差異(圖2)。結論寡核苷酸RJLOl可以顯著心肌細胞肥大模型中的ANF的表達上調。實施例3寡核苷酸(ODN)抑制心肌肥大模型中的ANF和β -MHC表達的劑量曲線I、新生大鼠心肌細胞的分離和心肌肥大的誘導方法同實施例I。在劑量曲線的實驗中，分別以終濃度20、10、5、2、1、0· 5μ g/ml的RJLOl刺激新生大鼠心肌細胞，對照組和模型組加入PBS，作用12h后，加入異丙腎上腺素至終濃度10 μ mol/ml，繼續孵育48h后，進行后續實驗。2、總RNA的提取、逆轉錄及實時定量PCR :方法同實施例I。3、實驗結果結果顯示，濃度為I μ g/ml的ODN RJLOl即可以有效的抑制心肌肥大過程中的ANF和β -MHC的表達上調，并且隨著ODN濃度的増加，對該兩種基因的抑制作用逐漸增強(*，與模型組相比，Ρ〈0· 05 ;**，與模型組相比，Ρ〈0· 001，圖3)。結論RJL01對于心肌肥大過程中ANF和β -MHC的表達上調的抑制作用呈劑量依
賴關系。實施例4寡核苷酸(ODN)抑制心肌肥大模型中的ANF和β -MHC表達的時間曲線4、新生大鼠心肌細胞的分離和心肌肥大的誘導方法同實施例I。在時間曲線的實驗中，分別在加入異丙腎上腺素之前12，3和Ih及加入異丙腎上腺素之后的1，3和12h加入終濃度為5 μ g/ml的R幾01刺激進行刺激，再異丙腎上腺素作用48h后,進行后續實驗。 5、總RNA的提取、逆轉錄及實時定量PCR :方法同實施例I。6、實驗結果結果顯示，在加入異丙腎上腺素的之前12，3和Ih及加入異丙腎上腺素之后的1，3h加入ODN RJLOl均可以有效的抑制心肌肥大過程中ANF和β-MHC的表達上調(*，與模型組相比，Ρ〈0. 05 ;**，與模型組相比，Ρ〈0. 001，圖4)。結論RJL01的這種對心肌肥大作用過程中ANF和β -MHC的表達上調有預防和治療性作用。實施例5寡核苷酸(ODN)對心肌肥大過程中的心肌細胞表面積增大的抑制作用I、新生大鼠心肌細胞的分離和心肌肥大的誘導方法同實施例I。2、間接免疫熒光法檢測α-actin的表達PI (sigma), ANF單克隆抗體(小鼠)購于Santa Cruz, FITC-突光二抗購于invitrogen。(2)方法:吸去培養液，加入適量PBS清洗3次；加入4%甲醛溶液，室溫固定20min ;加入適量 PBS 充分清洗，加入 O. 5%Tritonl00，-20°C通透 IOmin ;2%BSA 封閉 Ih ;加入 ANF—抗(I 200稀釋)400 μ 1，室溫孵育lh，PBS清洗3次;加入熒光ニ抗(I :200稀釋)400 μ 1，室溫孵育lh，PBS清洗3次；PI復染2min，PBS清洗2次。80%甘油封片，使用共聚焦熒光顯微鏡拍照，應用Image J軟件對細胞表面積進行測量。3、實驗結果心肌細胞肥大模型組與對照組相比，心肌細胞的表面積增大了 3倍。再經ODNRJLOl處理12h后，心肌細胞的表面積未出現明顯的増大，與模型組相比，兩者的P〈0. 001，具有統計學差異(圖5)。結論RJL01可以顯著抑制心肌肥大過程中心肌細胞表面積的增加。實施例6寡核苷酸(ODN)對小鼠心肌肥大模型的抑制作用I、小鼠心肌肥大模型的建立及ODN的注射將6 8周齡，18 22g C57BL/6小鼠分為4組，每組8只，每天下午3點背部皮下注射濃度為5mg/ml的異丙腎上腺素200 μ 1，連續注射6天，即可形成小鼠心肌肥大模型。ODN的于注射異丙腎上腺素的前一天開始腹腔注射，時間為早上8點，連續注射6天，濃度為250 μ g/ml ο對照組注射PBS。具體的分組如下實驗分組對照組，背部皮下注射200 μ I PB,連續6天；模型組，背部皮下注射200 μ I濃度為5mg/ml的異丙腎上腺素，連續6天；ODN組，腹腔注射200 μ I 濃度為250 μ g/ml的RJLOl，連續6天；再從第二天開始背部皮下注射200 μ I濃度為5mg/ml的異丙腎上腺素6天。2、實驗結果在最后一次注射的24h后，苯巴比妥注射麻酔小鼠，稱重；進而打開胸腔，獲取心臟后拍照、稱重。心臟進行多聚甲醛固定，切片，HE染色。結果表明，與對照組相比，模型組小鼠的心臟重量明顯增大，心臟重量和小鼠體重的比例(心體比)増大，HE染色顯示心臟中出現大面積組織壞死。在注射ODN RJLOl之后，與模型組相比，ODN組的心臟重量下降，心體比下降，組織的壞死面積明顯減小，兩者的P〈0. 05,具有統計學差異(圖6)。結論注射RJLOl對小鼠的心肌細胞肥大模型有明顯的減輕作用。
權利要求
1.ー種能夠有效抑制心肌肥大和慢性心力衰竭發生發展的含有序列片段5’ -AACGTT-3’的寡核苷酸。
2.ー種含有權利要求I所述的序列且能夠有效抑制心肌肥大和慢性心カ衰竭的發生與發展的功能類似物。
3.根據權利要求2所述的寡核苷酸序列及其功能類似物，其特征在于序列5’ -AACGTT-3’的兩個末端可以添加其他任意的由4種核苷酸A、T、C和G組成的核苷酸序列。
4.根據權利要求2所述的寡核苷酸序列及其功能類似物，其特征在于序列5’ -AACGTT-3’可以經化學修飾，化學修飾的部位可以是核苷間的磷酸ニ酯鍵和/或核糖和/或堿基；經化學修飾的寡核苷酸序列中任一的寡核苷酸被界定為相應的相應寡核苷酸的功能類似物。
5.權利要求I所述的含有序列片段5’-AACGTT-3’的寡核苷酸在制備預防及治療心肌肥大、心室重構藥物制劑中的用途。
6.權利要求I所述的含有序列片段5’-AACGTT-3’的寡核苷酸在制備預防及治療急、慢性心力衰竭的藥物制劑中的用途。
7.權利要求I所述的含有序列片段5’-AACGTT-3’的寡核苷酸在制備預防及治療心肌肥大和心衰相關的心律失常或猝死的藥物制劑中的用途。
8.權利要求2至4中任一項所述的寡核苷酸序列及其功能類似物在制備預防及治療心肌肥大、心室重構藥物制劑中的用途。
9.權利要求2至4中任一項所述的寡核苷酸序列及其功能類似物在制備預防及治療急、慢性心力衰竭的藥物制劑中的用途。
10.權利要求2至4中任一項所述的寡核苷酸序列及其功能類似物在制備預防及治療心肌肥大和心衰相關的心律失常或猝死的藥物制劑中的用途。
全文摘要
本發明屬醫藥技術領域，具體涉及含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸及其功能類似物，以及應用該寡核苷酸或其功能類似物用于預防及治療心肌肥大及慢性心力衰竭的用途。本發明采用國內外學術界公認的心肌細胞及動物的肥大模型對含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸的作用進行研究。實驗結果顯示，含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸具有明顯的抑制心肌肥大的標志性蛋白ANF、β-MHC基因的表達，并抑制心肌細胞表面積的增加，寡核苷酸的這種抑制作用同其劑量呈依賴關系。在整體實驗中，含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸能顯著的抑制心肌肥厚及心體比的增加，并減少心肌壞死的發生。本發明的實驗結果提示含5’-AACGTT-3’的寡核苷酸為有效治療心肌肥大乃至心力衰竭的藥物。
文檔編號A61P9/04GK102719436SQ20121021501
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月27日 優先權日2012年6月27日
發明者唐向東, 李靜, 楊亮 申請人:南開大學