專利名稱：一種制備酵母β- 1,3- D-葡聚糖衍生物的制備方法
技術領域：
本發明屬于生化制備領域。涉及到利用膨化技術與酸堿溶液處理相結合制備酵母β- 1,3- D-葡聚糖生物的エ藝。
背景技術：
酵母是ー種重要的食品エ業微生物，其細胞壁從外向內分三層，分別為甘露聚糖、蛋白質和葡聚糖。最里層的葡聚糖有三類堿溶性葡聚糖，堿不溶、酸可溶性葡聚糖，酸堿不溶性葡聚糖，其中酸堿不溶性葡聚糖即為活性多糖，除含有少量的β- 1，6鍵外，幾乎都是β _ 1，3鍵，因此也稱(I, 3)-匍聚糖。酵母β _1，3- D-匍聚糖能增強哺乳動物的免疫力、抗癌、抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、降低膽固醇和血脂、促進傷ロ愈合等，是ー種良好的生物效應調節劑。酵母β -I, 3-D-葡聚糖因其難溶性在抗腫瘤等的臨床應用上受到限制，其高度的粘性、持水性和熱穩定性以及制備エ藝簡單等優點，在食品、醫藥、化妝品、農業、造紙和建筑材料等行業中廣泛應用。從酵母細胞中提取β_1，3- D-葡聚糖就是要從細胞壁中去除甘露聚糖和蛋白質。酵母細胞壁是β -I, 3-D-葡聚糖的ー個主要來源，早在1939年人們就提出啤酒酵母具有免疫增強特性，但直到I960年才研究發現提供免疫特性的主要因素是存在于酵母細胞壁的葡聚糖成分，約占啤酒酵母干重的15%。葡聚糖構象對其活性的影響并非主要的，β -I, 3-糖苷鍵才是其具有抗腫瘤活性的關鍵。堿不溶性葡聚糖的低水溶性限制了它在臨床上的應用。雖然ロ服通常不會產生毒副作用，但靜脈注射就可能產生ー些無法估計的毒副作用，例如肝脾腫大，微血栓形成，循環系統崩潰、炎性肉芽腫形成等。因此需要對β-l，3-D-葡聚糖進行衍生化改性，獲得水溶 性良好且具有免疫活性的羧甲基葡聚糖。β -I, 3-D-葡聚糖的衍生化就是在分子表面取代一定的親水基團，增加水溶性并且保持或加強其免疫活性。目前所應用的衍生化手段很多，主要有羧甲基化，羧こ基化，乙基化，磺基化，羧基化等。其方法是選擇不同的底物，在一定的介質中，控制一定的反應條件使葡萄糖基上的羥基被底物基團所取代。難點是控制得到一定取代度葡聚糖，使該衍生物能夠溶于水而且不破壞它原來的螺旋結構，正是這種構型，使得它具有特殊的活性。比較各種衍生化方法，羧甲基化條件比較容易控制。羧甲基化衍生物在取代度DS=O. 75時，顯示出最高的活性，當DS>1.0或分子量較低時，則沒有活性。羧甲基葡聚糖與葡聚糖相比具有更強的溶解性和免疫激活效應，能夠加強機體的非特異性防御功能如巨噬細胞活化功能，促進TNF-α合成，同時對動物機體也顯示了潛在的抗病毒，防輻射和抗突變的能力，能保護大鼠肝細胞免受氧化損傷。葡聚糖水溶性衍生物同時具有顯著的抗腫瘤活性。羧甲基葡聚糖可以使內毒素血癥動物腫瘤壞死因子水平顯著降低，能夠抑制小鼠肉瘤細胞的轉移。目前國內外采取的提取方法主要有酸法、堿法、酸堿綜合法等，這些方法的提取條件一般都比較劇烈，酸堿試劑容易腐蝕儀器設備、對環境污染嚴重，得到的葡聚糖成品純度不高，需要進ー步純化。堿破壁法構成酵母細胞壁的葡聚糖有兩層一層是可以被堿水解的，另ー層則不溶于堿。當利用堿溶液對酵母進行破壁吋，堿可以溶解掉酵母細胞壁中的堿可溶性葡聚糖層，同時溶解部分脂類，從而使酵母細胞壁的通透性變大，胞內物質容易析出。本實驗采用自溶后的酵母殘渣，外加膨化解除去大量的蛋白質及其它雜質，降低后續堿處理工序中堿液濃度和用量，以便在較溫和的條件下盡量保持葡聚糖的分子結構完整，提高堿不溶性葡聚糖成品的得率及純度，為啤酒廢酵母的綜合利用提供理論依據。在國內外報道中，關于β- 1，3- D-葡聚糖的制備，多采用酸、堿或與有機溶劑相結合的方法。曾有人分別用Sevage法、酸法和堿法進行對比、測試，發現用Sevage法難以從啤酒酵母中提取i3-l，3_D-葡聚糖；酸法浸提所得的粗多糖得率高，但含大量甘露聚糖及蛋白質，純度不高，エ藝過于復雜，且酸法腐蝕設備，危害工人健康；堿法浸提エ藝簡單，產品為較高純度的β_1，3-D-葡聚糖，是從廢酵母中有效β- 1,3- D-葡聚糖的理想途徑。
發明內容
本發明的目的正是為了提供一種制備酵母β- 1,3- D-葡聚糖的方法，本發明的方法利用膨化技術與酸堿溶液處理相結合制備酵母β -I, 3-D-葡聚糖生物，不僅可大大節約制備1，3- D-葡聚糖的時間，而且降低提取成本。本發明的目的可通過下述技術措施來實現
本發明的方法是通過以下步驟來實現的
Α、采用下列(a)或(b)方法進行堿處理和膨化；
a、堿處理取啤酒酵母IOOg加入200-300ml的IM氫氧化鈉，在溫度80_100°C條件下作,2h后,在3000r/min的速度下離心15min,水洗2遍,過濾離心,收集沉淀物；膨化將所述沉淀物放入微波爐中膨化，微波處理火力為高火，微波處理時間為10分鐘；
b、雙螺桿膨化機膨化以啤酒酵母為原料，按每IOOg啤酒酵母加1-1.5M氫氧化鈉15—20ml，在拌勻條件下緩緩加入膨化機，螺桿轉速30HZ，膨化溫度120_130°C;所述膨化機為雙螺桿膨化機；
B、中和處理將步驟I所得膨化進行降溫處理，當其溫度低于50°C吋，緩慢加入體積分數為20%的こ酸進行中和，こ酸加入量為使提取物的pH值降低至7.0時為止。C、分離將步驟2所得中和液在轉速4 000 r/min下進行離心分離，收集、合并離心液；加熱真空濃縮至原體積的一半，然后加入2倍體積的體積分數為95%的こ醇；
D、羧甲基化制備將步驟3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氫氧化鈉混合均勻，35°C下攪拌O. 5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C條件下攪拌反應3 h，反應產物用95%こ醇洗滌，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
E、按質量質量體積=1:1.25:1. 25取葡聚糖、氫氧化鈉、ー氯こ酸，，放入2倍體積的體積分數為95%的こ醇溶液中，在醚化溫度50°C、醚化時間3h、堿化溫度35°C、堿化時間
O.5 h條件下進行反應；在此エ藝條件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度為O. 79。本發明的有益效果
本發明的方法采用膨化輔助提取明顯地縮短了提取時間，并且提高了多糖的提取率，優于其它提取方法；采用輔助法提取多糖產量較其他エ藝高，優化工藝科學可行，這樣加快了羧甲基葡聚糖的制備速度，為啤酒廢酵母多糖的藥物開發和保健品的應用提供幫助；不僅可大大節約制備1，3- D-葡聚糖的時間，而且可降低提取成本。
具體實施例方式本發明以下將結合實施例作進ー步描述
本發明的エ藝如下
啤酒廢酵母堿溶解一微波破碎(或雙螺桿膨化機膨化破碎)一離心一上清液濃縮一加醇沉淀一羧甲基化一真空干燥一羧甲基葡聚糖。實施例I :
1、堿處理取IOOg酵母加IM氫氧化鈉200-300ml，在溫度80_100°C條件下作用2h后， 在3000r/min的速度下離心15min,水洗2遍,過濾離心,收集沉淀；
2、微波膨化將沉淀收集的堿處理過的酵母放入微波爐中膨化，微波處理火力為高火，微波處理時間為8分鐘；注意控制微波處理火力和時間，膨化期間，用微波專用勺翻動酵母，使其受熱均勻；
3、中和處理將步驟2所得膨化進行降溫處理，當其溫度低于50°C吋，緩慢加入體積分數為20%的こ酸進行中和，こ酸加入量為使提取物的pH值降低至7.0吋；
4、分離將中和液在轉速4000 r/min下進行離心分離，收集、合并離心液，加熱真空濃縮至原體積的一半,然后加入其2倍體積的體積分數為95%的こ醇；
5、羧甲基化制備將步驟3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氫氧化鈉混合均勻，35で下攪拌0.5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C條件下攪拌反應3 h，反應產物用95%こ醇洗滌，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
6、取葡聚糖、氫氧化鈉、ー氯こ酸投料比為I:I. 25:1. 25 (質量/質量/體積)，放入2倍體積的體積分數為95%的こ醇溶液中，在醚化溫度50°C、醚化時間3 h、堿化溫度35°C、堿化時間O. 5 h條件下進行反應；在此エ藝條件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度為O. 79。實施例2:
1、堿處理100g酵母加IM氫氧化鈉200-300ml，溫度80-100°C，作用2h后3000r/min離心15min,水洗2遍,過濾離心,收集沉淀；
2、雙螺桿膨化機膨化沉淀收集的酵母，緩緩加入膨化機膨化，螺桿轉速30HZ，膨化溫度120-130°C。膨化機為雙螺桿膨化機，螺桿轉速30HZ，膨化溫度可控；
3、中和處理將1，2上述提取物進行降溫處理，當其溫度低于50°C吋，緩慢加入體積分數為20%的こ酸進行中和，こ酸加入量為使提取物的pH值降低至7.0時為止；
4、分離將中和液在轉速4000 r/min下進行離心分離，收集、合并離心液，加熱真空濃縮至原體積的一半,然后加入其2倍體積的體積分數為95%的こ醇；
5、羧甲基化制備將步驟3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氫氧化鈉混合均勻，35°C下攪拌O. 5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C條件下攪拌反應3 h，反應產物用95%こ醇洗滌，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
6、取葡聚糖、氫氧化鈉、ー氯こ酸投料比為I:1.25 1.25 (質量/質量/體積)，放入2倍體積的體積分數為95%的こ醇溶液中，在醚化溫度50°C、醚化時間3h、堿化溫度35°C、堿化時間O. 5 h條件下進行反應；在此エ藝條件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度為O. 79。
權利要求
1.一種制備酵母β- 1,3- D-葡聚糖衍生物的制備方法，其特征在干所述方法是通過以下步驟來實現的 Α、采用下列(a)或(b)方法進行堿處理和膨化； a、堿處理取啤酒酵母IOOg加入200-300ml的IM氫氧化鈉，在溫度80_100°C條件下作用2h后,在3000r/min的速度下離心15min,水洗2遍,過濾離心,收集沉淀物；膨化將所述沉淀物放入微波爐中膨化，微波處理火力為高火，微波處理時間為10分鐘； b、雙螺桿膨化機膨化以啤酒酵母為原料，按每IOOg啤酒酵母加1-1.5M氫氧化鈉15-20ml，在拌勻條件下緩緩加入膨化機，螺桿轉速30HZ，膨化溫度120_130°C ； B、中和處理將步驟I所得膨化進行降溫處理，當其溫度低于50°C吋，緩慢加入體積分數為20%的こ酸進行中和，こ酸加入量為使提取物的pH值降低至7.0時為止； C、分離將步驟2所得中和液在轉速4000 r/min下進行離心分離，收集、合并離心液；加熱真空濃縮至原體積的一半，然后加入2倍體積的體積分數為95%的こ醇； D、羧甲基化制備將步驟3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氫氧化鈉混合均勻，35で下攪拌0.5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C條件下攪拌反應3 h，反應產物用95%こ醇洗滌，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥； E、按質量質量體積=1:1. 25:1. 25取葡聚糖、氫氧化鈉、ー氯こ酸，放入2倍體積的體積分數為95%的こ醇溶液中，在醚化溫度50°C、醚化時間3h、堿化溫度35°C、堿化時間O.5 h條件下進行反應；在此エ藝條件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度為O. 79。
全文摘要
本發明公開了一種制備酵母β-1,3-D-葡聚糖衍生物的制備方法，所述方法利用膨化技術與酸堿溶液處理相結合制備酵母β-1,3-D-葡聚糖生物，不僅可大大節約制備β-1,3-D-葡聚糖的時間，而且降低提取成本。
文檔編號A61P31/12GK102690368SQ201210199499
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者郭宏昌 申請人:郭宏昌