酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬醫藥領域，涉及酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用，尤其是在制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物中的應用。本發明經試驗證實，所述的酵母來源的葡聚糖可以調節小鼠脾臟細胞中細胞因子表達，上調IL-12、IL-1、TNF表達，下調抑制性細胞因子IL-10表達；能促進HBV?C57BL/6J-TgN轉基因小鼠mDC的成熟，上調mDC表面協同刺激分子CD80、CD86表；能夠明顯增強HBV感染患者外周血來源PBMC?IFN-γ的生成。所述的酵母來源葡聚糖可以制備治療乙肝病毒感染的藥物，尤其是制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物，以及作為免疫增強劑輔助HBV感染的治療。
【專利說明】酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬醫藥領域，涉及葡聚糖新的藥用用途，具體涉及酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用，尤其是在制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 現有技術公開了酵母來源的葡聚糖(glucan)具有二重螺旋的超微結構，通過與人類單核細胞(monocyte)、巨卩遼細胞(macrophage)、中性粒細胞(neutrophilegranulocyte)、樹突狀細胞(dendritic cell, DC)、自然殺傷細胞(natural killercell, NK cell)等免疫細胞膜表面的CR3、LacCer、Dectin-l、TLR2等受體結合發揮識別、吞噬等生理作用，刺激機體產生抗體，分泌TNF-α、白介素和干擾素等多種細胞因子、調節免疫細胞間的相互作用，加速和放大宿主免疫反應。
[0003]研究顯示，葡聚糖具有強大的抗腫瘤作用，它在解除腫瘤毒素對機體免疫抑制的同時，能快速激活機體自身的免疫監視和識別機制，發現和區分潛在的腫瘤細胞，使吞噬細胞直接殺滅腫瘤細胞。Macrogard、PGG> Glomrellan等葡聚糖類的抗腫瘤藥已先后研發并應用于臨床治療。同時，有報道公開，葡聚糖還作為免疫增強劑與抗腫瘤單克隆抗體聯合應用，發揮抗腫瘤效應。
[0004]除此之外，葡聚糖還具有增強機體抗輻射能力，對化學療法起到協同增強的效果，可以作為治療輻射損傷佐劑，以及，葡聚糖還具有有效抑制血清中膽固醇的升高，降低膽固醇和血脂的作用。但尚未見有葡聚糖在治療病毒感染領域的應用的報道。
[0005]據報道，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染引起的慢性乙型肝炎已成為嚴重危害人類健康的疾病。全球約有3.5億慢性乙型肝炎患者，中國攜帶乙型肝炎病毒人數約8%左右，乙肝病毒攜帶者已超過1.2億人，發病人數超過3000萬人，慢性乙型肝炎患者病程還會進一步發展成為肝硬化和肝癌。實踐顯示，盡管大規模的計劃內疫苗接種已大大降低新生兒感染乙型肝炎病毒的風險，但是對已經感染乙型肝炎病毒的人群而言，仍然缺乏十分有效的藥物以清除病毒。目前臨床上使用α干擾素和核苷酸類似物抑制乙型肝炎病毒復制，但其中僅有不到30%的患者對干擾素治療有較好的應答。而且，長期的干擾素治療有較強的副作用，也給患者及其家庭帶了沉重的經濟負擔，而核苷類似物治療則容易產生病毒的耐藥性。研究認為，慢性乙肝病人相較急性乙肝病人，其不能有效清除HBV的原因與其機體免疫系統耐受有關。為此，尋找到一種可有效提高機體免疫水平，進而打破機體免疫耐受、激活特異性針對HBV的天然免疫及適應性免疫應答的方法具重要的臨床意義。本申請擬研究葡聚糖對HBV感染的免疫調節作用，進一步提供酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供葡聚糖新的藥用用途，具體涉及酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用，尤其是在制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物中的應用。
[0007]本發明采用酵母來源的葡聚糖在HBV轉基因小鼠細胞和臨床HBV感染患者外周血單個核細胞(PBMC)中測試了酵母來源的葡聚糖的免疫調節作用，分別獲得所述葡聚糖調節小鼠脾臟細胞細胞因子表達、上調mDC表面⑶80表達、調mDC表面⑶86表達以及對mDC的形態改變的影響和葡聚糖誘生HBV患者PBMC IFN- Y生成的影響結果，實驗結果顯示，所述的酵母來源葡聚糖可以調節小鼠脾臟細胞中細胞因子表達，上調IL-12、IL-U TNF表達，下調抑制性細胞因子IL-10表達；所述的酵母來源的葡聚糖能促進HBVC57BL/6J-TgN轉基因小鼠mDC的成熟，上調mDC表面協同刺激分子CD80、CD86表達，提示葡聚糖可以促進mDC成熟，且葡聚糖這種上調作用對DC的活化呈劑量依賴方式；所述的酵母來源的葡聚糖(250 μ g/ml，刺激10天)能夠明顯增強HBV感染患者外周血來源PBMC IFN-Y的生成。
[0008]本發明經試驗證實，所述的酵母來源的葡聚糖可以與機體免疫細胞受體結合，迅速激活DC細胞、巨噬細胞、NK細胞，并促進B淋巴細胞產生抗體，T淋巴細胞和巨噬細胞分泌TNF- α、白介素和IFN等具有免疫調節功能的細胞因子；
[0009]本發明所述的酵母來源葡聚糖可以制備治療乙肝病毒感染的藥物，尤其是制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物。
[0010]本發明所述的酵母來源的葡聚糖還可作為免疫增強劑輔助HBV感染的治療。
[0011]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是本發明的葡聚糖調節小鼠脾臟細胞細胞因子表達。
[0013]圖2Α是本發明的葡聚糖上調mDC表面⑶80表達；
[0014]2B是本發明的葡聚糖上調mDC表面⑶86表達；
[0015]2C是本發明的顯微鏡下葡聚糖作用下，mDC的形態改變。
[0016]圖3是本發明的葡聚糖誘生HBV患者PBMC IFN- Y生成。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
[0018](一 )細胞培養、臨床標本干預和指標檢測方案
[0019]分離HBVC57BL/6J_TgN轉基因小鼠(該小鼠從美國Jackson實驗室引進，含有HBVS，PreSland PreS2基因，可在小鼠血清表達HBsAg)單個脾細胞，DMEM培養液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和400 μ g/ml G418)在5%C02飽和水蒸氣環境下37°C恒溫培養。酵母來源葡聚糖250 μ g/ml刺激48h，定量PCR檢測細胞因子表達。
[0020]按常規方法分離HBVC57BL/6J-TgN轉基因小鼠骨髓以100ng/mlIL_4和IOOng/ml GM-CSF誘導分化DC 8天，DMEM培養液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和400 μ g/ml G418)在5%C02飽和水蒸氣環境下37°C恒溫培養。取對數生長期細胞以1*106/孔密度鋪12孔板，酵母來源葡聚糖取250ng/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg(CHO 細胞來源,華北制藥集團提供)、500ng/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 來源)、I μ g/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 來源)、250 μ g/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 來源)4個濃度梯度，對照組僅給2 μ g/ml HBsAg培養基；每組均設3個復孔；刺激48h后收集細胞檢測mDC表面協同刺激分子⑶11C、⑶80、⑶86表達。
[0021]取離體的臨床HBV感染患者外周血分離PBMC，以1*106/孔密度鋪12孔板加HBVoverlap肽、HBV overlap肽+葡聚糖,正常對照組僅給空白培養基；每組均設3個復孔；刺激10天。
[0022]( 二)試驗結果
[0023]I，本發明酵母來源葡聚糖(250 μ g/ml，刺激48hr )可以調節小鼠脾臟細胞中細胞因子表達，上調IL-12、IL-UTNF表達，下調抑制性細胞因子IL-10表達(如圖1所示)。
[0024]2，本發明酵母來源的葡聚糖能促進HBV C57BL/6J_TgN轉基因小鼠mDC的成熟，上調mDC表面協同刺激分子CD80、CD86表達，提示葡聚糖可以促進mDC成熟，且葡聚糖的上調作用對DC的活化呈劑量依賴方式(如圖2A、2B所示)。
[0025]3，本發明的酵母來源的 葡聚糖(250 μ g/ml，刺激10天)能明顯增強HBV感染患者外周血來源PBMC IFN- Y的生成(如圖3所示)。
【權利要求】
1.酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用。
2.酵母來源葡聚糖在制備降低或消除乙型肝炎病毒血清表面抗原的藥物中的應用。
3.按權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血清表面抗原是慢性感染患者的血清表面抗原。
4.按權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母來源葡聚糖上調IL-12、IL-1、TNF表達，下調抑制性細胞因子IL-1O表達。
5.按權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母來源葡聚糖促進HBVC57BL/6J-TgN轉基因小鼠mDC的成熟，上調mDC表面協同刺激分子CD80、CD86表達。
6.按權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母來源的葡聚糖增強HBV感染患者外周血來源PBMC IFN-Y的生成。
7.酵母來源葡聚糖在制備`治療乙肝病毒感染的免疫增強劑中的應用。
【文檔編號】A61P37/04GK103479663SQ201210189690
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月11日 優先權日:2012年6月11日
【發明者】袁正宏, 羽曉瑜, 周曉輝, 任廣旭 申請人:上海市公共衛生臨床中心