一種短肽、載銅納米生物材料及在制備治療腦梗死的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】一種自組裝短肽，它的氨基酸序列為序列表中SEQ?ID?NO：1所述。一種載銅納米生物材料，為RP自組裝短肽、RAD16-II自組裝短肽、CuSO4和滅菌去離子水配制成的混合溶液所形成的凝膠狀物質，所述混合溶液中，RP短肽的濃度為0.1mM～4mM，RAD16-II自組裝短肽的濃度為2mM～8mM、CuSO4的濃度為10μM～100μM，所述RP短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ?ID?NO：1所述，所述RAD16-II自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ?ID?NO：2所述。實驗表明，所述載銅納米生物材料可在制備治療腦梗死的藥物中應用。
【專利說明】一種短肽、載銅納米生物材料及在制備治療腦梗死的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物材料領域，特別涉及自組裝短肽、含自組裝短肽的載銅納米生物材料及其在制備治療腦梗死的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]自組裝短肽是一種新型的納米生物材料，自20世紀90年代問世以來，受到了人們的廣泛重視，得到了快速的發展，并在細胞三維培養及制備疏水藥物載體、止血藥物、燒傷治療藥物、抑菌藥物、白血病治療或預防藥物等方面應用。但是，制備出更多的自組裝短肽、擴大自組裝短肽的應用范圍仍然是科技工作者關注的問題。
[0003]腦卒中是世界上第三大致死性的疾病，是導致人死亡和殘疾的主要原因之一。腦梗死(cerebral infarction, Cl)又稱缺血性腦卒中，是由于血管狹窄或閉塞所致腦部血液供應障礙，引起相應部位腦組織缺血、缺氧而壞死、軟化的疾病，約占全部腦卒中的80%。目前，對腦梗死的治療措施主要是超早期的溶栓治療，盡早恢復缺血組織的血液循環。然而溶栓治療有嚴格時間窗的限制(<3h)，臨床上只有不到5%的腦梗死患者能夠得到溶栓治療。如果溶栓治療超過了時間窗，則會導致缺血再灌注損傷，使得病情進一步加重。目前基礎實驗證明有效的各種神經保護藥物，一旦應用到臨床上，效果甚微。因此對于缺血性腦卒中，如何采取有效的治療措施減少神經功能缺損，提高患者生存質量，這就成了當務之急。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種自組裝短肽和含自組裝短肽的載銅納米生物材料，本發明的再一目的是證明載銅納 米生物材料對梗死的腦組織有明顯的神經血管再生功能，以便開發出一類治療腦梗死的新型藥物。
[0005]本發明所述自組裝短肽，命名為RP，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所述，其理論分子量為3066.15道爾頓。本發明所述載銅納米生物材料，為上述RP自組裝短肽、RAD16-1I自組裝短肽、CuSO4和滅菌去離子水配制成的混合溶液所形成的凝膠狀物質，所述混合溶液中，RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM，RAD16-1I自組裝短肽的濃度為2mM~~8mM、CuSO4的濃度為ΙΟμΜ~100 μ Μ，所述RAD16-1I自組裝短肽已公開[見ShuguangZhang.Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cellcultures.Seminars in Cancer Biology 15 (2005) 413 - 420]，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:2所述。本發明所述載銅納米生物材料，其制備方法如下:
[0006](I)去離子水的滅菌處理
[0007]將去離子水在蒸汽壓103.4kPa、溫度121.3°C下處理至少30分鐘，然后冷卻至室溫;
[0008](2)原料溶液的配制
[0009]在室溫、常壓下將CuSO4用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成CuSO4溶液，然后在超凈臺的無菌環境中將CuSO4溶液用0.22 μ m的一次性濾器過濾除菌，所述CuSO4溶液中，CuSO4的濃度是上述形成凝膠狀物質的混合液中的CuSO4濃度的2倍倍；
[0010]在超凈臺的無菌環境中于室溫、常壓下將RP自組裝短肽用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成RP自組裝短肽溶液，所述RP自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ IDNO:1所述，所述RP自組裝短肽溶液中，RP自組裝短肽的濃度是上述形成凝膠狀物質的混合液中的RP自組裝短肽濃度的2倍倍；
[0011]在超凈臺的無菌環境中于室溫、常壓下將RAD16-1I自組裝短肽用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成RAD16-1I自組裝短肽溶液，所述RAD16-1I自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO:2所述，所述RAD16-1I自組裝短肽溶液中，RAD16-1I自組裝短肽的濃度是上述形成凝膠狀物質的混合液中的RAD16-1I自組裝短肽濃度的2倍倍；
[0012](3)混合液的配制
[0013]所述混合液由步驟(2)配制的CuSO4溶液、RP自組裝短肽溶液和RAD16-1I自組裝短肽溶液組成，CuSO4溶液的量按混合液中CuSO4的濃度為10 μ M~100 μ M計量，RP自組裝短肽溶液的量按混合液中RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM計量，RAD16-1I自組裝短肽溶液的量按按混合液中RAD16-1I自組裝短肽的濃度為2mM~8mM計量，
[0014]在超凈臺的無菌環境中于室溫、常壓下將計量好的CuSO4溶液、RP自組裝短肽溶液和RAD16-1I自組裝短肽溶液加入反應容器中，并混合均勻；
[0015](4)成膠
[0016]將步驟(3)所配制的混合液在 室溫、常壓下超聲20mirT40min，然后在常壓、4°C的環境中放置12~24小時，即形成的凝膠狀的載銅納米生物材料。
[0017]上述方法中，超聲反應的超聲功率為160W~200W。
[0018]動物實驗表明，用本發明所述載銅納米生物材料對腦梗動物模型干預治療，可促進缺血腦組織血管新生和改善缺血腦組織血供，腦萎縮現象得到明顯改善，腦梗面積與對照組相比較減少60%左右，腦神經功能獲得顯著修復(見實施例5、實施例6)。
[0019]本發明所述載銅納米生物材料可以通過添加藥學上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床使用的治療腦梗死的藥物。
[0020]本發明具有以下有益效果:
[0021]1、本發明提供了一種新型自組裝短肽，增加了自組裝短肽的種類。
[0022]2、實驗表明，本發明所述載銅納米生物材料可促進缺血腦組織血管新生和改善缺血腦組織血供，使腦萎縮現象得到明顯改善，與對照組相比較，腦梗面積減少60%，神經功能得到顯著修復，對腦梗動物模型取得了顯著的治療效果。
[0023]3、本發明可為腦梗死的治療提供一種有效的新藥品，具有明顯的社會效益和經濟效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1是本發明所述方法制備的自組裝短肽RP純化后的高效液相色譜圖(HPLC)；
[0025]圖2是本發明所述自組裝短肽RP的質譜圖；
[0026]圖3是實施例2所制備的RAD16-1I自組裝短肽純化后的高效液相色譜圖(HPLC);
[0027]圖4是實施例2所制備的RAD16-1I自組裝短肽的質譜圖；[0028]圖5是原子力顯微鏡(AFM)圖，圖中，Cu-NM代表本發明所述載銅納米生物材料；
[0029]圖6是實驗大鼠神經功能的評分圖，圖中，sham代表假手術組，IR代表手術腦梗組，IR+Cu代表手術腦梗后采用CuSO4溶液治療的治療組，IR+Cu-NM代表手術腦梗后采用本發明所述載銅納米生物材料治療的治療組，IR+NM代表手術腦梗后采用未含銅離子的納米生物材料治療的治療組，所述未含銅離子的納米生物材料為RP自組裝短肽、RAD16-1I自組裝短肽和滅菌去離子水配制成的混合溶液所形成的凝膠狀物質，其RP自組裝短肽、RAD16-1I自組裝短肽的濃度與本發明所述載銅納米生物材料的濃度相同，下述所涉及的“未含銅離子的納米生物材料”與該定義相同；神經功能評分顯示，IR+Cu-NM組在手術腦梗后14天，與IR組、IR+Cu組、IR+NM組相比，神經功能得到顯著修復，#:1R+Cu-NM組與IR組、IR+Cu 組、IR+NM 組相比，P〈0.05 (n=18)；
[0030]圖7是實驗大鼠腦梗死面積比較照片，其中，sham代表假手術組，IR代表手術腦梗組，IR+Cu代表手術腦梗后采用CuSO4溶液治療的治療組，IR +Cu-NM代表手術腦梗后采用本發明所述載銅納米生物材料治療的治療組，IR+ΝΜ代表手術腦梗后采用未含銅離子的納米生物材料治療的治療組；
[0031]圖8是實驗大鼠腦梗死面積比較圖，圖中，sham代表假手術組，IR代表手術腦梗組，IR+Cu代表手術腦梗后采用CuSO4溶液治療的治療組，IR+Cu-NM代表手術腦梗后采用本發明所述載銅納米生物材料的治療組，IR+ΝΜ代表手術腦梗后采用未含銅離子的納米生物材料治療的治療組；IR+Cu-NM組在手術腦梗后14天，與IR組、IR+Cu組、IR+ΝΜ組相比，腦梗死面積得到顯著減小，*:IR+Cu-NM組與IR組、IR+Cu組、IR+ΝΜ組相比，P〈0.05 (n=18)；
[0032]圖9是實驗大鼠腦萎縮程度比較照片，其中，sham代表假手術組，IR代表手術腦梗組，IR+Cu代表手術腦梗后采用CuSO4溶液治療的治療組，IR+Cu-NM代表手術腦梗后采用本發明所述載銅納米生物材料治療的治療組，IR+ΝΜ代表手術腦梗后采用未含銅離子的納米生物材料治療的治療組；
[0033]圖10是實驗大鼠腦萎縮程度比較圖，其中，sham代表假手術組，IR代表手術腦梗組，IR+Cu代表手術腦梗后采用CuSO4溶液治療的治療組，IR+Cu-NM代表手術腦梗后采用本發明所述載銅納米生物材料治療的治療組，IR+ΝΜ代表手術腦梗后采用未含銅離子的納米生物材料治療的治療組；IR+Cu-NM組在手術腦梗后14天，與IR組、IR+Cu組、IR+NM組相t匕，腦萎縮程度得到顯著改善，#:1R+Cu-NM組與IR組、IR+Cu組、IR+ΝΜ組相比，P〈0.05(n=18)。
【具體實施方式】
[0034]實施例1:自組裝短肽RP的合成
[0035]1、材料及設備
[0036]1.1 試劑
[0037]芴甲氧羰基(Fmoc)- 氨基酸為美國SIAM公司產品；PyBOP、Boc-His-Merrifield resin樹脂、六氫吡唳、二甲基吡唳為Merck公司產品；二甲基甲酰胺(DMF)為日本三星公司產品(使用前先經茚三酮浸泡和3A分子篩脫水，并測定無游離氨基);二氯甲烷(DCM)，為中國醫藥(集團)上海化學試劑公司產品(使用前用無水碳酸鉀浸泡處理)；三氟乙酸(TFA)為GEEL BELGIUM公司產品；甲醇為上海振興化工一廠產品；HPLC甲醇為Merck公司產品；四氫呋喃為上海化學試劑站中心化工廠產品。
[0038]1.2 儀器
[0039]431A型多肽合成儀為Applied biosystems產品，高效液相色譜儀為安捷倫1100色譜儀，制備色譜儀為WATERS600E ;冷凍干燥機(FREEZE DRYER 18)為LABC0NC0產品；質譜儀為 Finnigan LCQ。
[0040]2、制備方法
[0041]2.1肽鏈的合成:
[0042]肽鏈的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc保護基團的脫除用30%六氫吡啶的DMF溶液；肽鏈從樹脂上的切落用切肽試劑(三氟乙酸/結晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚=81.5/5/5/2.5/1)。
[0043]接肽前樹脂處理:
[0044]①稱取100毫克Boc- His -Merrifield resin到砂芯過濾反應器中；
[0045]②加入二氯甲烷浸泡洗滌6次，每次5毫升，過濾除去洗滌的二氯甲烷；
[0046]③加入10%的TFA (二氯甲烷作溶劑)5毫升，室溫反應2小時，以除去樹脂上氨基酸N端的BOC保護基；
[0047]④加入二氯甲烷浸 泡洗滌3次，每次5毫升，然后加入5%的三乙胺(二氯甲烷作溶劑) 5毫升，2次中和PH值后再用二氯甲烷洗滌6次，DMF洗滌5次即可放入儀器反應器中進行接肽反應。
[0048]接肽在431 A多肽合成儀上進行,稱取IOOmg His -Merrifield resin放入反應器中，然后按下列量在合成儀中依次加入各種Fmoc-氨基酸(反應過程中加入的FMOC-氨基酸并不是一次全部加入反應容器，而是按照多肽的序列順序從C端逐漸加入，每一個氨基酸反應周期時間為40分鐘，在加入氨基酸的同時要加入相同摩爾的PYBOP試劑和HOBT試劑)
[0049]以下是序列中需要加入氨基酸的量:
[0050]Resin
Resin substitution: 0.600[inmol/g]
Resin quantity100[mg]
Free peptide173.28[mg]
Amino acid station ( Excess 5.0 fold ): 300.00[micro-mol]Mwt[mg]
1: Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31 ---- 89.20
2: Fmoc-Gly-OH-----------------------297.3 I ——89.20
3: Fmoc-Gly-OH----------------------- 297.3 丨---- 89.20
4: Fmoc-His(Trt)-OH------------------619.72 — 185.92
5: Fmoc-Gly-OH-----------------------297.3 丨---- 89.20
6: Fmoc-His(Trt)-OH------------------619.72 — 185.92
7: Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31 ---- 89.20
8: Fmoc-Gly-OH-----------------------297.3 1---- 89.20
9: Fmoc-Gly-OH-----------------------297.3 丨一--89.20
10: Fmoc-His(Trt)-OH------------------619.72 …185.92
11: Fmoc-Gly-OH-----------------------297.3 1---- 89.20
12: Fmoc-Pro-OH----------------------- 337.38 …101.22
13: Fmoc-Pro-OH----------------------- 337.38 — 101.22
14: Frnoc-Pro-OH----------------------- 337.38 — 101.22
15: Fmoc-Gly-OH-----------------------297.31 —- 89.20
16: Frnoc-Ala-OH-----------------------311.34 ---- 93.41
17: Fmoc-Asp(OtBu)-OH---------------411.45 …123.44
18: Fmoc-Ala-OH-----------------------3 11.34 ---- 93.41
19: Fmoc-Asp(OtBu)-OH--------------411.45 …123.44
20: Fmoc-Ala-OH-----------------------3 11 34 ---- 93.41 21: Finoc-Arg(Piric)-OH.1PE--------------764.99 …229.50
22: Fmoc-Ala-OH--------------------------3 丨 1.34 ---- 93.41
23: Fmoc-Arg(Pmc)-OH.1PE--------------764.99 …229.50
24: Fmoc-Ala-OH--------------------------3 11.34 ---- 93.41
[0051]
【權利要求】
1.一種自組裝短肽，其特征在于它的氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:1所述。
2.一種載銅納米生物材料，其特征在于該材料為RP自組裝短肽、RAD16-1I自組裝短肽、CuSO4和滅菌去離子水配制成的混合溶液所形成的凝膠狀物質，所述混合溶液中，RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM，RAD16-1I自組裝短肽的濃度為2mM~8mM、CuSO4的濃度為10 μ M~100 μ M，所述RP自組裝短肽為權利要求1所述自組裝短肽，所述RAD16-1I自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID Ν0:2所述。
3.權利要求2所述載銅納米生物材料的制備方法，其特征在于工藝步驟如下: (1)去離子水的滅菌處理 將去離子水在蒸汽壓103.4kPa、溫度121.3°C下處理至少30分鐘，然后冷卻至室溫； (2)原料溶液的配制 在室溫、常壓下將CuSO4用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成CuSO4溶液，然后在超凈臺的無菌環境中將CuSO4溶液用0.22 μ m的一次性濾器過濾除菌，所述CuSO4溶液中，CuSO4的濃度是權利要求2所述混合液中的CuSO4濃度的2倍~4倍； 在超凈臺的無菌環境中于室溫、常壓下將RP自組裝短肽用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成RP自組裝短肽溶液，所述RP自組裝短肽為權利要求1所述自組裝短肽，所述RP自組裝短肽溶液中，RP自組裝短肽的濃度是權利要求2所述混合液中的RP自組裝短肽濃度的2倍4倍； 在超凈臺的無菌環境中于室溫、常壓下將RAD16-1I自組裝短肽用步驟(I)滅菌處理的去離子水配制成RAD16-1I自組裝短肽溶液，所述RAD16-1I自組裝短肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:2所 述，所述RAD16-1I自組裝短肽溶液中，RAD16-1I自組裝短肽的濃度是權利要求2所述混合液中的RAD16-1I自組裝短肽濃度的2倍倍； (3)混合液的配制 所述混合液由步驟(2)配制的CuSO4溶液、RP自組裝短肽溶液和RAD16-1I自組裝短肽溶液組成，CuSO4溶液的量按混合液中CuSO4的濃度為10 μ M~100 μ M計量，RP自組裝短肽溶液的量按混合液中RP自組裝短肽的濃度為0.1mM~4mM計量，RAD16-1I自組裝短肽溶液的量按混合液中RAD16-1I自組裝短肽的濃度為2mM~8mM計量， 在超凈臺的無菌環境中于室溫、常壓下將計量好的CuSO4溶液、RP自組裝短肽溶液和RAD16-1I自組裝短肽溶液加入反應容器中，并混合均勻； (4)成膠 將步驟(3)所配制的混合液在室溫、常壓下超聲20 min~40min，然后在常壓、4°C的環境中放置12小時~24小時，即形成凝膠狀的載銅納米生物材料。
4.權利要求2所述載銅納米生物材料在制備治療腦梗死的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K33/34GK103467578SQ201210188935
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月8日 優先權日:2012年6月8日
【發明者】唐成康, 康裕建, 李進 申請人:四川大學華西醫院