專利名稱：丁香葉或其提取物在制備抗豬流感病毒藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及丁香葉提取物的的一種新的藥理用途，尤其涉及丁香葉或其提取物在制備抗豬流感病毒(Swine influenza virus, SIV)藥物中的用途,屬于丁香葉或其提取物的藥理用途領域。
背景技術：
豬流感(Swineinfluenza, SI)是由 A 型流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的一種豬的急性呼吸道傳染病。SIV不僅危害豬的健康和養豬業，而且在流感病毒的遺傳進化和生態分布中占有重要地位，特別是對人類健康具有極大威脅。
丁香葉為木犀科丁香屬植物紫丁香Syringa oblata Lindl、朝鮮丁香Syringadiatata Nakai或洋丁香Syringa vulgaris L的干燥葉。丁香葉性寒、味苦，歸肺、胃經，具有清熱解毒，消炎止痢之功效，用于急性菌痢，腸炎及上呼吸道感染，咽喉腫痛，急慢性扁桃體炎等細菌感染性疾病。迄今為止，尚未見有關丁香葉對流感病毒有預防或治療作用的研究報道。
發明內容
本發明的主要目的是提供丁香葉或其提取物的一種新的藥理用途。本發明通過體外和體內抗抗豬流感病毒實驗發現，丁香葉或其提取物對豬流感病毒具有顯著的預防及治療作用，能將其制備成預防或治療豬流感病毒的藥物。本發明首先測定了丁香葉提取物體外抗豬流感病毒的作用，實驗結果表明，不同濃度的丁香葉提取物對于豬流感病毒均有顯著的預防作用、治療作用、抗吸附作用及直接滅活作用，隨著丁香葉提取物濃度的提高，其抗豬流感病毒的作用也隨之增強。在體外抗病毒實驗的基礎上，本發明進行了丁香葉提取物體內抗豬流感病毒實驗。肺臟病毒滴定結果表明，丁香葉提取物高劑量組的病毒滴度與陽性藥物對照(鹽酸金剛烷胺)的病毒滴度相比，差異不顯著。丁香葉提取物對小鼠肺炎的抑制作用顯示，丁香葉提取物的高、中劑量組的肺指數及肺指數抑制率與陽性藥物(鹽酸金剛烷胺)組相比差異不顯著，而且這三組與正常對照組相比，差異也不顯著。肺病變程度的結果表明(表3)，丁香葉乙醇提取物的高、中劑量組與陽性藥物(鹽酸金剛烷胺)組相比差異不顯著，說明丁香葉提取物可減輕小鼠流感病毒所致肺炎的病變程度。本發明中所述的“丁香葉”可以是將丁香葉粉碎研細后所得到的丁香葉細粉；本發明中所述的“丁香葉提取物”可以是按照文獻中報道的各種提取方法所制備得到的提取物，包括丁香葉的水提取物或醇提取物，優選為醇提取物；作為參考，本發明所述的“丁香葉提取物”可以是將丁香葉用水或醇類物質進行回流后得到提取物，將提取物過濾、濃縮即得；為了達到更好的效果，進一步，還可以將濃縮液中加入蒸餾水，靜置，離心，取上清液用大孔吸附樹脂柱色譜進行吸附，水洗后，先后用0 50%乙醇洗脫和50 90%乙醇進行洗脫，收集50 90%乙醇洗脫液，濃縮，即得丁香葉醇提取物。其中，所述的大孔吸附樹脂優選為HP-20大孔吸附樹脂；所述的醇類物質優選為乙醇或甲醇。由此，本發明還提供了一種預防或治療豬流感的藥物組合物，由由有效量的丁香葉細粉或丁香葉提取物與藥學上可接受的載體或輔料組成。本發明所述的“丁香葉細粉或丁香葉提取物”可以加入制備不同劑型時所需的各種輔料和藥學上可接受的賦形劑或載體后，以常規的中藥制劑方法制備成任何一種適宜的臨床制劑，例如可以是注射劑、口服液、散劑等；其中，所述的輔料可以是抗氧絡合劑、填充劑等；所述的藥學上可接受的載體是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化鈉、葡萄糖酸鈣或磷酸鈣中的一種或幾種。
圖I小鼠每天平均體重變化。圖2 丁香葉乙醇提取物對感染小鼠肺臟病毒含量影響。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。I.材料與試劑I. I病毒及細胞HlNl亞型豬流感病毒(有關HINI亞型的豬流感病毒的實驗需要在國家流感參考實驗室完成，本領域普通技術人員在經過領導的批準后均能夠在該實驗室獲得相應的HINI亞型的豬流感病毒并需要在該實驗室完成有關的實驗)、MDCK細胞購自上海研晶生物科技有限公司。I. 2細胞培養液和維持液細胞培養液為含100U/mL的青霉素100g/mL的鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培
養液；細胞維持液除含2%胎牛血清外，其它成分同細胞培養液。病毒稀釋液為不含血清，含終濃度為2 U g/mL的TPCK-胰酶，其它成分同細胞培養液。I. 3 藥物供試藥物(I) 丁香葉乙醇提取物(2) 丁香葉水提取物；陽性藥物對照鹽酸金剛烷胺。I. 4 試劑MTT (3-(4，5_ 二甲基噻唑_2)_2，5_ 二苯基四氮唑溴鹽)，MTT以不含血清的DMEM培養基配制成5mg/mL溶液，過濾除菌，-20°C保存；二甲基亞砜(DMSO) ;1%雞血。I. 5 儀器
超凈工作臺，超低溫冰箱，冷凍離心機，電子分析天平，乙醚，灌胃針，平皿，解剖剪，眼科鑷，一次性注射器等。實施例I 丁香葉醇提物的制備將丁香葉粉碎用百分比濃度為50-95%的乙醇進行進行回流提取1-3次，將提取液過濾并濃縮；將濃縮液中加入蒸餾水，靜置，離心，取上清液大孔吸附樹脂柱色譜進行吸附，水洗后，先后用0 50%乙醇洗脫和50 90%乙醇，收集50 90%乙醇洗脫液，濃縮，即得。實施例2 丁香葉水提物的制備將丁香葉粉碎用水煎煮提取1-3次，將煎煮液過濾，濃縮，即得。
實驗例I豬流感病毒感染性的測定實驗I、實驗方法用病毒稀釋液對豬流感病毒進行連續10倍遞次稀釋，將各稀釋度的病毒液接種于單層的MDCK細胞中，IOOii L/孔，每個稀釋度平行做8個復孔，同時設正常細胞對照，細胞對照孔不加病毒，只加稀釋液，37°C吸附2h后，小心吸棄各孔病毒液換用維持液繼續培養，72h后，做血凝試驗并記錄結果，按Reed-Muench法計算病毒的半數細胞感染量(TCID50)。2、實驗結果根據按Reed-Muench法，計算豬流感病毒的TCID50為10-7. 2/0. lmL。實驗例2 丁香葉醇提取物對細胞毒性實驗I、實驗方法將MDCK細胞懸液按100 U L/孔接種于96孔培養板中，放入37°C，5%C02溫箱中培養24h，待細胞長滿單層后，棄去原培養液。丁香葉醇提取物用細胞維持液2倍連續稀釋，濃度分別為 2000 u g/mL, 1000 u g/mL, 500 u g/mL, 250 u g/mL, 125 u g/mL, 63 u g/mL, 32 u g/mL。將不同稀釋倍數的丁香葉醇提取物加入細胞培養孔中，每孔100 y L每個濃度重復4孔，同時設細胞對照孔(不加藥，只加培養液)，置37°C，5%C O2培養箱內培養72h，每日觀察細胞病變并記錄。2、實驗結果丁香醇提取物對的MDCK細胞的最大無毒濃度為250 U g/mL,在此濃度范圍以上時細胞萎縮、空泡或脫落。實驗例3 丁香葉水提取物對細胞毒性實驗I、實驗方法將MDCK細胞懸液按100 U L/孔接種于96孔培養板中，放入37°C，5%C02溫箱中培養24h，待細胞長滿單層后，棄去原培養液。丁香葉水提取物用細胞維持液2倍連續稀釋，濃度分別為 2000 u g/mL, 1000 u g/mL, 500 u g/mL, 250 u g/mL, 125 u g/mL, 63 u g/mL, 32 u g/mL。將不同稀釋倍數的丁香葉水提取物加入細胞培養孔中，每孔100 y L每個濃度重復4孔，同時設細胞對照孔(不加藥，只加培養液)，置37°C，5%C02培養箱內培養72h，每日觀察細胞病變并記錄。2、實驗結果丁香葉水提物對MDCK細胞的毒性實驗結果見表I。表I 丁香葉水提物對MDCK細胞的毒性實驗結果
權利要求
1.丁香葉用于制備抗豬流感病毒的藥物中的用途。
2.按照權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的丁香葉包括丁香葉細粉或丁香葉提取物。
3.按照權利要求2所述的用途，其特征在于所述的丁香葉提取物包括丁香葉水提取物或丁香葉醇提取物。
4.按照權利要求3所述的用途，其特征在于所述丁香葉醇提取物的制備方法包括丁香葉用醇類物質進行加熱回流后所提取得到醇提取物。
5.按照權利要求2或4所述的用途，其特征在于所述醇類物質是甲醇或乙醇。
6.按照權利要求4所述的用途，其特征在于，還包括以下步驟將醇提取物過濾、濃縮，得到濃縮液。
7.按照權利要求6所述的用途，其特征在于，還包括以下步驟將濃縮液中加入蒸餾水，靜置，離心，取上清液用大孔吸附樹脂柱色譜進行吸附，水洗后，先用O 50 %乙醇洗脫，再用50 90%乙醇，收集50 90%乙醇洗脫液，濃縮，即得。
8.一種預防或治療豬流感的藥物組合物，由有效量的丁香葉細粉或丁香葉提取物與藥學上可接受的載體或輔料組成。
9.按照權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的丁香葉提取物是丁香葉醇提取物。
10.按照權利要求8或9所述的藥物組合物，其特征在于將其制備成口服制劑或注射制劑。
全文摘要
本發明公開了丁香葉或其提取物在制備抗豬流感病毒藥物中的用途。本發明通過體外和體內抗豬流感病毒實驗發現，丁香葉或其提取物對豬流感病毒具有顯著的預防或治療作用，能將其制備成預防或治療豬流感病毒的藥物。
文檔編號A61K36/61GK102697858SQ201210186698
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者劉靜, 吳悅, 李艷華, 李賢賢, 李鶴, 董秀梅, 趙玉蓮, 陳雪英, 黃全勇 申請人:東北農業大學