專利名稱：Maoa基因在肝癌治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤治療領域，尤其涉及肝癌的治療。
背景技術：
單胺氧化酶A (monoamine oxidase A,以下簡寫為MA0A)是一種黃素蛋白酶，存在于許多組織的細胞線粒體外膜上，催化單胺的氧化脫氨作用。MAOA除了在神經元和星形神經膠質中表達以外，在肝臟、消化管道和胎盤中也有表達。MAOA與神經遞質分子之間有著密不可分的關系，它能使兒茶胺類神經遞質(去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺等)失活，具有抗抑郁的作用u_2]。MAOA與人的情緒和精神有密切關系，有資料表明MAOA基因啟動子區的30bp-VNTR的多態性可能使所編碼的MAO的活性降低，不能充分降解外周組織中存在的5-羥色胺及去甲腎上腺素(Noradrenaline，以下簡寫為NE)，從而使兩種遞質在外周的濃度升高，間接地增加人的沖動性和暴力犯罪傾向[3]。此外MAOA的抑制劑I-異煙酰-2-異丙基肼(iproniazid)、^ -苯基異丙基肼(pheniprazine)等對MAOA的活性有強烈的競爭性阻抑作用，經實驗證明如果給動物，則可提高腦中NE和5-羥色胺等單胺的濃度[4]。肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上發生率和致死率較高的惡性腫瘤之一，具有早期診斷難和復發轉移率高的特點[http://globocan. iarc.fr/]。HCC對于人類的健康危害巨大，我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數的45%[5]。多項流行病學調查結果顯示精神壓力和憂郁對腫瘤發生、發展具有重要影響。這些流行病調查結果提示，神經系統，尤其是神經遞質及其受體可能在腫瘤的發生發展中起著重要的作用_。我們實驗室的研究結果表明在人肝癌組織中，MAOA表達量顯著下降，目前國內外有關MAOA功能的相關報道主要是在神經系統中，而在癌癥中的研究則非常少，尤其是在肝癌中的作用尚無人報道。
發明內容
本發明的發明人發現，肝癌組織中單胺氧化酶A基因(MAOA)的表達，顯著低于周圍的正常組織，提示干預MAOA基因表達可能成為肝癌治療的新途徑。為了驗證這一設想，本發明構建了表達MAOA的慢病毒載體，并轉染肝癌細胞，得到MAOA過表達的肝癌細胞株，用于評價MAOA過表達對肝癌細胞凋亡及侵襲轉移的影響。本發明的第一方面，提供一種增強肝癌組織中單胺氧化酶A基因表達的化合物的用途，用于制備治療肝癌的藥物。所述的增強肝癌組織中單胺氧化酶A基因表達的化合物，可以是DNA、RNA、蛋白質或其他有機、無機化合物，但是不包括單胺氧化酶A基因。對化合物的來源及性質以及增強單胺氧化酶基因表達的機理無特別限制，只要能夠增強肝癌細胞中單胺氧化酶基因的表達即可。本發明的第二方面，提供一種單胺氧化酶A基因的用途，用于制備治療肝癌的基因治療的藥物。所述的單胺氧化酶A基因與適合在人體內表達的載體相連接，并導入患者肝組織病灶部位，增強肝癌組織中單胺氧化酶的表達。所述的單胺氧化酶A基因可選自哺乳動物的單胺氧化酶A基因。優選地，單胺氧化酶A基因選自人、牛、豬、大鼠、小鼠的單胺氧化酶A基因或其重組體；更優選地，單胺氧化酶A基因為人的單胺氧化酶A基因；最優選地，單胺氧化酶A基因具有SEQ NO. I的序列。所述的適合在人體內表達的載體可選自逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體或者非病毒載體；對表達載體沒有特別限制，只要能夠將單胺氧化酶A基因導入肝癌細胞并表達單胺氧化酶A即可。優選地，所述的載體為慢病毒載體。本發明不拘泥于任何現有理論的限制。盡管單胺氧化酶A的功能研究主要集中于神經系統，但本發明的研究者發現在人肝癌組織中，MAOA表達量顯著下降。我們構建了MAOA的過表達慢病毒載體，并選擇MAOA表達背景低的肝癌細胞(如SMMC-7721)作為目的 細胞，用MAOA-慢病毒載體轉染該目的細胞，篩選得到過表達MAOA的SMMC-7721細胞，用于評價MAOA對肝癌細胞的影響。在體外實驗中，過表達MAOA可抑制去甲腎上腺素(NE) /腎上腺素(E)所誘導的肝癌侵襲轉移和抗失巢凋亡；在體內試驗中，過表達MAOA可顯著減少SMMC-7721細胞原位移植形成的病灶數并且減小腫瘤體積；同樣，過表達MAOA也可以顯著抑制靜脈注射SMMC-7721細胞引起的肺部轉移。綜上所述，過表達MAOA可抑制NE/E所誘導的肝癌侵襲轉移和抗失巢凋亡，且過表達MAOA的肝癌細胞在裸鼠體內侵襲轉移能力也顯著降低。以上結果說明上調肝癌組織中MAOA基因的表達，可有效抑制肝癌的侵襲轉移，有希望成為肝癌治療的有效祀標。
圖I. MAOA在肝癌組織中的表達量a~c為肝癌組織200倍顯微切片圖d-f為肝癌組織400倍顯微切片圖其中圖Id為圖Ia中方框部分的放大；圖Ie為Ib中方框部分的放大；圖If為Ic中方框部分的放大。圖2. MAOA在肝癌癌旁組織中的表達量g-i為癌旁組織200倍顯微切片圖j-1為癌旁組織400倍顯微切片圖其中圖2j為圖2g中方框部分的放大；圖2k為a中方框部分的放大；圖21為2i中方框部分的放大。圖3.在肝癌組織、癌旁組織MAOA蛋白表達的Western blotting檢測，共有7對標本，T代表肝癌組織，N代表癌旁組織。MAOA代表單胺氧化酶，7對標本中有6對肝癌組織較癌旁組織下調。G3PDH代表甘油醛-3-磷酸脫氫酶，作為對照，在全部7對標本的肝癌組織和癌旁組織中沒有明顯差異。 圖4. 118對肝癌組織、癌旁組織標本MAOA差異表達的統計結果，肝癌組織MAOA表達低于癌旁組織為下調，反之為上調。圖5. MAOA過表達SMMC-7721細胞失巢凋亡的流式細胞儀檢測圖。5a為IOOnM的E處理SMMC-7721細胞的失巢凋亡的流式細胞儀檢測結果；
5b為IOOnM的E處理MAOA過表達SMMC-7721細胞的失巢凋亡的流式細胞儀檢測
結果;5c為IOOnM的NE處理SMMC-7721細胞的失巢凋亡的流式細胞儀檢測結果；5d為IOOnM的NE處理MAOA過表達SMMC-7721細胞的失巢凋亡的流式細胞儀檢測結果。圖6. MAOA過表達SMMC-7721細胞失巢凋亡統計圖。6a為IOOnM的E處理MAOA過表達SMMC-7721細胞的失巢凋亡統計圖；6b為IOOnM的NE處理MAOA過表達SMMC-7721細胞的失巢凋亡統計圖；圖7. MAOA過表達SMMC-7721細胞體外侵襲轉移檢測圖。7a為IOOnM的E處理SMMC-7721細胞的體外侵襲轉移的檢測結果；7b為IOOnM的E處理MAOA過表達SMMC-7721細胞的體外侵襲轉移的檢 測結果；7c為IOOnM的NE處理SMMC-7721細胞的體外侵襲轉移的結果；7d為IOOnM的NE處理MAOA過表達SMMC-7721細胞的體外侵襲轉移的檢測結果。圖8. MAOA過表達SMMC-7721細胞體外侵襲轉移統計圖。8a為IOOnM的E處理MAOA過表達SMMC-7721細胞的體外侵襲轉移統計圖；8b為IOOnM的NE處理MAOA過表達SMMC-7721細胞的體外侵襲轉移統計圖；圖9. MAOA過表達SMMC-7721細胞裸鼠肝臟原位移植病灶檢測圖。圖10. MAOA過表達SMMC-7721細胞裸鼠肝臟原位移植病灶數統計圖。圖11. MAOA過表達SMMC-7721細胞在裸鼠肝臟原位移植顯微切片圖a、對照組200倍顯微切片圖b、MAOA過表達組200倍顯微切片圖c、對照組400倍顯微切片圖d、MAOA過表達組400倍顯微切片圖其中圖Ilc為圖Ila中方框部分的放大；圖Ild為圖Ilb中方框部分的放大。圖12. MAOA過表達SMMC-7721細胞在裸鼠肝臟原位移植顯微切片病灶統計圖。圖13. MAOA過表達SMMC-7721細胞在裸鼠靜脈注射肺部轉移顯微切片圖e、對照組200倍顯微切片圖f、MAOA過表達組200倍顯微切片圖g、對照組400倍顯微切片圖h、MAOA過表達組400倍顯微切片圖其中圖13g為圖13e中方框部分的放大；圖13h為圖13f中方框部分的放大。圖14. MAOA過表達SMMC-7721細胞在裸鼠肺臟轉移顯微切片病灶統計圖。圖15.慢病毒轉移載體示意圖。圖16.腺病毒表達載體構建不意圖。
具體實施例方式生物標本和組織病理學研究本發明收集了 118位肝癌患者的肝癌組織標本和癌旁組織(正常組織)標本，進行組織病理學研究。其中52對樣本購自上海芯超生物科技有限公司，另外66對樣本由上海交通大學附屬仁濟醫院提供。本發明將肝癌組織和癌旁組織制成石蠟切片，采用單胺氧化酶(MAOA)特異性抗體(一抗)、辣根過氧化物酶標記二抗(HRP- 二抗)、二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine, DAB)顯色底物進行免疫染色。經免疫染色的成對標本切片進行鏡檢，以癌旁組織切片為對照，肝癌組織切片染色較深者為高表達，較淺者為低表達，進行組織病理學研究，并統計研究結果。選取部分標本,采用單胺氧化酶(MAOA)特異性抗體(一抗)、辣根過氧化物酶標記二抗(HRP- 二抗)、二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine, DAB)進行 Western blotting 研究,用于和免疫組化結果進行驗證。 MAOA 基因單胺氧化酶(Monoamine oxidase, MAO;E. C. I. 4. 3. 4)是一類黃素蛋白酶，可降解多種生物活性胺化合物，包括作為神經遞質的去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺。根據分子量、底物親和力、抑制劑敏感性以及免疫特性的不同，單胺氧化酶可以分為MA0-A、MAO-B兩型，兩種類型的酶在人體內具有不同的組織特異性表達。在中樞神經系統，MAO-B主要在星型膠質細胞和5-羥色胺能神經細胞中高水平表達，而MAO-A則主要在兒茶酚胺能神經細胞中高表達。在外周組織中，在培養的皮膚成纖維母細胞和胎盤中檢測到MAO-A的表達，而在血小板和淋巴細胞中檢測到MAO-A表達。編碼人MA0-A、MAO-B的基因定位于人X染色體pll. 23-11. 4區段(Ozelius etal. 1988; Lan et al. 1989; Levy et al. 1989) ,Bach AffJ, et a I 報道了人 MA0_A、MAO-B 全長cDNA克隆以及核酸和氨基酸序列，具體見Proc Natl Acad Sci USA85:4934-4938 (1988)。其他哺乳動物的MAOA基因與人MAOA基因有很高的同源性，比如大鼠與人之間MAOA基因有87. 8%的同源性，小鼠與人之間有87. 5%的同源性，豬與人之間有88. 6%的同源性，牛與人之間有88. 0%的同源性等等。可以考慮將其他動物的MAOA基因替換或者與人MAOA基因重組以用于本發明的基因治療。本發明采用人MAOA cDNA的完整編碼區(開放閱讀框)作為目的基因，用于肝癌的基因治療。序列參見 Bach AffJ, et al, Proc Natl Acad Sci USA85:4934-4938 (1988)，以及序列表I。表達載體基因治療的表達載體包括非病毒載體和病毒載體，其中病毒載體包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體等。慢病毒載體是將HIV-I基因組中的順式作用元件(如包裝信號、長末端重復序列)和編碼反式作用蛋白的序列進行分離而構建的載體系統，包括包裝成分和載體成分包裝成分由HIV-I基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補，含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV-I順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。包裝成分可分別構建在兩個質粒上，即一個表達gag和pol、另一個表達env,與載體質粒構成三質粒表達系統，具體參見Naldini L et al. Science, 1996; 272:263,以及Kafri T et al. Nature Genet, 1997; 17:314的報道。為了進一步降低同源重組形成有復制能力的病毒(RCV)的可能性，Dull etal等人將包裝質粒中的輔助基因去除，將gag-pol的轉運需要的rev構建到另一個質粒上,構建成四質粒表達系統，具體參見JVirol, 1998;72:8463-71 的公開。本發明采用四質粒表達系統，轉移載體pEZ_Lvl05示意圖見圖15，包裝質粒為pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV_G，轉移載體及包裝質粒購于廣州復能基因有限公司。除此之外，本發明也采用了腺病毒 載體，構建了包含MAOA基因的腺病毒表達載體，用于感染目的細胞，構建過程示意圖見圖16。肝癌細胞及MAOA過表達肝癌細胞SMMC-7721細胞是我國學者分離培養得到的原發性肝癌細胞株，參見董榮春、周榮華等，SMMC-7721人體肝癌細胞株的建立及其生物學特性的初步觀察，第二軍醫大學學報，1980年01期，此后被廣泛用于腫瘤癌生物學的研究。SMMC-7721肝癌細胞株MAOA基因背景表達低，本發明將外源MAOA基因表達載體導入SMMC-7721細胞，經篩選得到了過表達MAOA的SMMC-7721肝癌細胞株，用于觀察MAOA基因高表達對SMMC-7721細胞體外癌生物學特性以及體內成瘤、轉移等方面特性的影響。肝癌組織標本和癌旁組織標本由上海芯超生物科技有限公司和上海交通大學附屬仁濟醫院提供。MAOA基因和慢病毒載體系統購自廣州復能基因有限公司，腺病毒載體系統購自上海吉凱基因化學技術有限公司，限制性內切酶及T4連接酶購自NewEngland公司，293T細胞購于美國模式典型物收集中心(ATCC)，上述試劑和293T細胞用于目的基因、慢病毒載體的連接和重組慢病毒載體的包裝。目的細胞肝癌細胞SMMC-7721細胞株由復旦大學附屬中山醫院提供。MAOA—抗購自Protein tech公司，突光二抗購自Biosciences公司，HRP 二抗購自Abmart公司，上述一抗和二抗用于免疫組化以及Western blotting檢測MAOA的表達量。real-time PCR試劑盒購自Takara公司；引物設計采用Primer 3軟件，弓丨物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，MAOA real-time PCR引物序列為Forward:5’-CCTTGACTGCCAAGATTCACTTC-3’Reverse:5，-TGCACTTAATGACAGCTCCCAT-3，上述PCR引物、試劑用于real-time PCR檢測目的細胞轉染后MAOA的表達量。澳洲特級胎牛血清購自Gibco公司；高糖型DMEM和1640購自Gibco公司；質脂體Lipofectamine Reagent 購自 Invitrogen 公司；Transwell 小室(內徑 6. 5mm,孔徑 8. Omm)購自Corning公司；Matrigel 購自Corning公司；其余試劑均為國產分析純。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件和分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I.肝癌組織切片的免疫組化研究標本來源人肝癌組織、癌旁組織樣本共118對，其中52對樣本購自上海芯超生物科技有限公司，另外66對樣本由上海交通大學附屬仁濟醫院提供。免疫染色實驗上述肝癌組織、癌旁組織順序編號，按常規方法制備石蠟切片。將石蠟切片置于60°C烘片機上烘烤20分鐘，然后按二甲苯(10min)x2 —1/2 二甲苯(IOmin) —100% 酒精(IOmin) x2 — 95% 酒精(IOmin) — 85% 酒精(IOmin) — 75% 酒精(IOmin)流程脫蠟。將脫蠟完畢的切片在流水中沖洗10分鐘，然后放置于0. OlM檸檬酸鈉緩沖液中在沸水浴中抗原復活10分鐘。將切片自然冷卻至室溫后，放置于37°C 0. 3%H202中去除內源過氧化物酶。用IxPBS清洗一遍后用10%BSA室溫封閉I小時，然后用1%BSA配置好的MAOA特異性一抗4°C孵育過夜。第二天用IxPBS清洗3遍，用1%BSA配置的HRP 二抗室溫孵育1-2小時。之后用IxPBS清洗3遍，用DAB顯色液進行顯色5_10秒。顯色完畢后用流水沖洗10分鐘以上，然后再用蘇木精染色I分半，在流水中沖洗5分鐘。之后按75%酒精(5min) — 85% 酒精(5min) — 95% 酒精(5min) —100% 酒精(5min) x2 —1/2 二甲苯(5min) 一二甲苯(5min) x2流程進行脫水。最后用中性樹脂封片。·結果用顯微鏡觀察肝癌組織樣本中MAOA的表達的染色情況。以癌旁組織作為對照，按照陽性反應的區域大小以及顏色的強弱將標本分組并進行統計。發現118對標本中，大多數肝癌組織中MAOA表達顯著下調(圖I和2)。用Western blotting檢測7對標本到同樣的結果，7對人肝癌組織蛋白中有6對MAOA表達下調(圖3)。經統計后發現，與癌旁組織相比70. 6%的肝癌組織MAOA的表達量都出現了下調(圖4)，23. 5%保持不變，僅有5. 9%出現了上調。實施例2. MAOA基因-慢病毒表達載體的構建MAOA基因-慢病毒轉移載體的連接MAOA基因合成、MAOA基因與慢病毒轉移載體pEZ_Lvl05的重組均由廣州復能基因有限公司完成，經重組的PEZ-U105-MA0A質粒由廣州復能基因有限公司提供。重組質粒pEZ-Lvl05-MA0A中MAOA基因經測序鑒定,測序結果見序列表SEQ. NO. I。慢病毒包裝重組轉移載體pEZ-Lvl05-MA0A與慢病毒包裝質粒pPACK_GAG、pPACK-REV和pVSV-G按照I ii g :5 ii g(包裝質粒總量)的比例混合，加200 u I無血清無抗生素DMEM 11965培養液后室溫孵育15分鐘；同時將15 ill Lipofectamine2000 與200 U I無血清無抗生素DMEM 11965培養液混合。然后將稀釋的Lipofectamine 2000 試劑緩慢滴注于慢病毒質粒混合液中，室溫孵育15分鐘。之后將準備好的慢病毒質粒混合液加入無血清無抗生素的HEK293T細胞中，待8小時后更換為10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素的DMEM 11965培養液。病毒液分別在24/48/72小時等時間點收集，3000rpm/5min離心，并用0. 22 y m無菌濾器過濾，共收獲每個時間點的病毒液2ml，經檢測滴度為IxlO6IU,儲藏于-80°C冰箱中備用。目的細胞轉染肝癌細胞SMMC-7721細胞培養到60%_70%密度后，加入6 ii g/的polybrene(購自Millipore公司)進行預處理，然后將500 ill收集好的病毒液加入目的細胞中。12小時后撤去含有polybrene的培養液，更換為正常DMEMl 1965培養液。待目的細胞第二個倍數生長期來到后加5 u g/ml嘌呤霉素進行初步篩選，并觀察目的細胞的生長狀態，并采用Western blotting 或 real-time PCR 檢測 MAOA 的表達量。單克隆細胞篩選將待挑選目的細胞計數，按照106/ml—106/100 U I一 1/100 U I的梯度稀釋到理論上每100 u I DMEM 11965培養液中僅含I個細胞，并以每孔100 U I的量接種到96孔板中，在顯微鏡下觀察并標記出僅有I個細胞的孔。待細胞貼壁后進一步加以觀察驗證，確保單克隆細胞的準確性。培養2周后，將標記好的單克隆細胞消化下來并接種到24孔板中，按24孔板-6孔板-6cm培養皿-IOcm培養皿的順序進行擴增。期間采用I U g/ml濃度的嘌呤霉素進行維持篩選，并用Western blotting檢測單克隆細胞的MAOA陽性表達率。共篩選到3株高表達MAOA的SMMC-7721細胞，儲藏于液氮中備用。實施例3.肝癌細胞失巢凋亡實驗為檢測NE/E降解酶MAOA是否能夠抑制NE/E所誘導的肝癌細胞變化，采用流式細胞檢測NE/E作用48h后MAOA過表達SMMC-7721細胞失巢凋亡的變化。將用95%乙醇以20mg/ml濃度配置的poly-HEMA (購自Sigma公司)溶液按每孔800 y I的量加入12孔板中，在超凈臺中晾干過夜。然后將目的細胞按106/ml接種于12孔板中，并分別加入IOOnM 的NE/E，處理48h后用流式細胞儀進行凋亡檢測。結果顯示MAOA過表達加E處理組細胞失巢凋亡比例與對照(SMMC-7721細胞)加E組相比明顯增加(P = 0. 007);另外MAOA過表達加NE處理組細胞失巢凋亡比例也明顯增加(P = 0.011)(圖5和6)。實施例4.肝癌細胞侵襲轉移實驗將matrigel (_20°C 保存)置于 4°C 融化，同時將 24 孔板、Transwell 小室、200
槍頭置于4°C預冷。然后將matrigel以1:4比例稀釋于無血清DMEMl 1965培養液中，在24孔板中的Transwell小室中各加100 U I 1:4的matrigel,置于37°C凝固2小時以上。以上各步驟均在冰上進行。之后消化目的細胞并計數，將5xl04細胞置于Transwell小室中，在小室下面的孔內各加500 u I DMEMl 1965培養液(含5%FBS、1%雙抗)，并分別加入IOOnM的NE/E，置于37°C培養。在48h后觀察目的細胞的膠穿狀態，并終止目的細胞侵襲，吸去Transwell小室中的matrigel后加600 U I戍二醒進行固定。30分鐘后吸去戍二醒并加600 u I結晶紫進行染色。30分鐘后吸去結晶紫，用600 u I IxPBS清洗2-3次，最后上顯微鏡觀察。結果發現MAOA過表達加E組侵襲細胞數明顯減少(P < 0. 001);另外MAOA過表達加NE組侵襲細胞數也明顯減少(P < 0.001)(圖7和8)。以上結果表明MAOA過表達可以抑制NE/E所誘導的肝癌細胞侵襲和抗失巢凋亡。實施例5.動物體內實驗為了進一步驗證MAOA在肝癌侵襲轉移中的作用，采用裸鼠肝原位移植、靜脈注射模型來觀察MAOA過表達SMMC-7721細胞在肝內(近端)、肺部(遠端)的轉移情況。肝原位移植實驗肝原位移植是取2xl06個對照或過表達組肝癌細胞重懸于40 u lDMEM/matrigelI: I的混合液中，將裸鼠深度麻醉后開腹，用微量進樣針將細胞接種于肝左葉上，然后縫合皮膚。6周后深度麻醉裸鼠，開腹觀察肝癌細胞在裸鼠肝內的侵襲轉移情況，心臟取血后將肝臟標本置于10%福爾馬林中，固定1-2天后修剪標本并進行組織脫水[75%酒精(2h)-85% 酒精(2h) — 95% 酒精(2h) —100% 酒精(2h) x2—二甲苯(2h) x3—石蠟(2h) x2]、包埋和切片。肝原位移植實驗的結果顯示7個MAOA過表達細胞移植鼠肝原位病灶和轉移病灶數目(1，病灶總數< 2，瘤體直徑< 0. 4cm ;而7個對照細胞移植鼠肝原位灶數目最多達到4個，轉移灶數目最多達到5個，病灶總數最多達到7個，瘤體直徑最大達到了 0. 8cm。經統計后發現MAOA過表達組病灶數明顯少于對照組(P = 0. 021)(圖9和10)。
HE染色實驗HE染色采用以下流程將石蠟切片置于60°C烘片機上烘烤20分鐘，然后按二甲苯(IOmin) x2—1/2 二甲苯(IOmin) 一 100% 酒精(IOmin) x2 — 95% 酒精(IOmin) 一85% 酒精(IOmin) 一75%酒精(IOmin)流程脫蠟。將脫蠟完畢的切片在流水中沖洗10分鐘，然后用蘇木精染色I分半，在流水中沖洗5分鐘，再用伊紅染色20秒，之后在流水中沖洗不超過5秒。之后按 75% 酒精(5min) — 85% 酒精(5min) — 95% 酒精(5min) —100% 酒精(5min)x2—1/2 二甲苯(5min) —二甲苯(5min) x2流程進行脫水。最后用中性樹脂封片,用顯微鏡觀察MAOA過表達SMMC-7721細胞在肝內的轉移情況。我們的結果發現在肝內MAOA過表達組轉移灶很少，明顯低于對照組(圖11和12)。 靜脈注射實驗靜脈注射實驗是取IxlO6個對照或過表達組肝癌細胞重懸于100 ill DMEM中，用Iml注射器將細胞沿尾靜脈注射到裸鼠體內。6周后深度麻醉裸鼠，開腹觀察肝癌細胞在裸鼠肺部的侵襲轉移情況，心臟取血后將肺臟標本置于10%福爾馬林中，固定1-2天后修剪標本按肝原位移植實驗處理步驟進行組織脫水-包埋-切片-HE染色。結果在肺部MAOA過表達組中沒有發現轉移灶，明顯低于對照組(圖13和14)。以上結果明確顯示了過表達MAOA可有效抑制肝癌細胞在生物體內的近端(肝內)或遠端(肺部)侵襲轉移。這也進一步印證了前面細胞實驗中的結果，確定了 MAOA對于肝癌侵襲轉移的抑制作用。實施例6. MAOA基因-腺病毒表達載體的構建及評價MAOA基因序列同實施例1，腺病毒載體見圖16，購于上海吉凱基因化學技術有限公司。具體操作步驟為可利用Cre-IoxP特異性位點基因重組技術構建MAOA的重組腺病毒。采用高保真PCR得到MA0A，將其克隆到質粒pCR-Blunt II -TOPO中，然后將目的基因片段連接到中間載體質粒pDNR-CMV中，進行測序，隨后在Cre重組酶的作用下，將MAOA cDNA轉移到腺病毒載體pLP-Adeno-X-CMV上。之后在HEK293T細胞中擴增重組腺病毒，經PCR法和限制性內切酶消化法證實了 MAOA重組腺病毒的成功構建。培養轉染的HEK293T細胞，分別在24/48/72小時等時間點收集病毒液，3000rpm/5min離心,并用0. 22 y m無菌濾器過濾,共收獲每個時間點的病毒液2ml,經檢測滴度為IxlO6IU,儲藏于-80°C冰箱中備用。肝癌細胞SMMC-7721細胞培養到60%-70%密度后，用上面的重組腺病毒對其進行轉染，RT-PCR和Western blotting檢測證實該重組腺病毒顯著性增強了 SMMC-7721細胞中MAOA的mRNA和蛋白表達水平。采用MAOA-腺病毒載體轉染的MAOA高表達肝癌細胞SMMC-7721，按照實施例2、3和4中的步驟進行體外、體內評價，得到類似結果。[參考文獻][l]ffhibley A, Urquhart J, Dore J, Willatt L, Parkin G, Gaunt L, Black G,Donnai D，Raymond FL Deletion of MAOA and MAOB in a male patient causes severedevelopmental delay, intermittent hypotonia and stereotypical hand movements.Eur JHum Genet. 2010;18(10):1095-1099.[2] Antoni MHj Lutgendorf SKj Cole S W, Dhabhar FS，Sephton SE, McDonaldPG, Stefanek M，Sood AK.The influence of bio-behavioural factors on tumourbiology:pathways and mechanisms. Nat Rev Cancer.2006;6(3):240-248.[3]劉華鋒，劉麗麗，于婷，劉曉嵐，李波，方芳，王繼萍，劉婭.單胺氧化酶A基因多態性與暴力行為的關聯性分析.中華行為醫學與腦科學雜志.2009:18(11) :1001-1003.[4]Horita A.The influence of drug-tissue interactions on theinhibition of monoamine oxidase by pheniprazine and iproniazid. J Pharmacol ExpTher.1963;142:141-146.
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權利要求
1.增強肝癌組織中單胺氧化酶A基因表達的化合物的用途，用于制備治療肝癌的藥物，所述的化合物是DNA、RNA、蛋白質或其他有機或無機化合物，但是不包括單胺氧化酶A基因。
2.單胺氧化酶A基因在制備治療肝癌的基因治療藥物中的用途。
3.根據權利要求2的單胺氧化酶A基因的用途，其特征在于，所述的單胺氧化酶A基因選自哺乳動物的單胺氧化酶A基因或其重組體。
4.根據權利要求3的單胺氧化酶A基因的用途，其特征在于，所述的單胺氧化酶A基因選自人、牛、豬、大鼠、小鼠的單胺氧化酶A基因或其重組體。
5.根據權利要求4的單胺氧化酶A基因的用途，其特征在于，所述的單胺氧化酶A基因為人的單胺氧化酶A基因。
6.根據權利要求5的單胺氧化酶A基因的用途，其特征在于，所述的單胺氧化酶A基因具有SEQ NO. I的序列。
7.根據權利要求2的單胺氧化酶A基因的用途，其特征在于，所述的基因治療藥物包括與載體連接的單胺氧化酶A基因。
8.根據權利要求7的單胺氧化酶A基因的用途，其特征在于，所述的載體為真核表達載體。
9.根據權利要求8的單胺氧化酶A基因的用途，其特征在于，所述的載體選自逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體或者非病毒載體。
10.根據權利要求9的單胺氧化酶A基因的用途，其特征在于，所述的載體為慢病毒載體。
全文摘要
本發明涉及肝癌治療的新靶標以及單胺氧化酶(MAOA)基因在肝癌治療中的應用。本發明發現MAOA基因在肝癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，提示干預MAOA基因表達可能成為肝癌治療的新途徑。為了驗證這一設想，本發明構建了MAOA的慢病毒表達載體，并轉染一株肝癌細胞，得到MAOA過表達的肝癌細胞株。在體外過表達MAOA可抑制去甲腎上腺素(NE)/腎上腺素(E)所誘導的肝癌侵襲轉移和抗失巢凋亡；在體內過表達MAOA可顯著減少肝癌細胞原位移植形成的病灶數并且減小腫瘤體積，并且顯著抑制肝癌細胞的肺部轉移。
文檔編號A61P35/00GK102772804SQ20121018165
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者張志剛, 李軍, 顧健人 申請人:上海市腫瘤研究所