一種腫瘤疫苗及其制備方法

一種腫瘤疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種腫瘤疫苗及其制備方法。所述腫瘤疫苗包括源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡和佐劑。本發明還提供一種腫瘤疫苗的制備方法，包括：使用紫外線照射腫瘤細胞，使腫瘤細胞凋亡，收集凋亡腫瘤細胞所釋放的細胞囊泡，然后將所述細胞囊泡與所述佐劑混合形成所述腫瘤疫苗。本發明提供的腫瘤疫苗包含的腫瘤抗原譜廣泛、全面，克服了現有的腫瘤疫苗不能對廣泛的腫瘤細胞具有殺傷能力的缺陷，同時具有良好的使用安全性以及免疫的靶向性。
【專利說明】一種腫瘤疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種疫苗，尤其涉及一種腫瘤疫苗。
【背景技術】
[0002]近年來，腫瘤作為一種嚴重威脅人們生命的疾病，其治療方法已成為眾多科研工作者致力于研究的課題，除了人們通常所知的化療、手術切除等治療方法，腫瘤疫苗作為一種新型治療手段已引起越來越多的關注。
[0003]腫瘤疫苗主要通過激活患者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發，以達到清除或控制腫瘤的目的。腫瘤疫苗根據其來源可分為腫瘤細胞疫苗、基因疫苗和多肽疫苗等。腫瘤細胞疫苗是從機體腫瘤組織中提取腫瘤細胞，滅活處理后使腫瘤細胞喪失致瘤性，但仍保持其免疫原性，然后對機體進行免疫；基因疫苗主要是將腫瘤抗原的基因裝入DNA表達載體(通常是病毒DNA)，將重組的載體注射機體后，表達腫瘤抗原蛋白對機體進行免疫；多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預測的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學合成技術制備成疫苗,然后注射機體進行免疫。
[0004]然而上述疫苗多數僅進入臨床試驗階段，而沒有進入臨床使用階段，存在的主要問題有:將DNA導入到特定細胞進行表達這一技術尚不成熟，并且使用外源DNA的安全性問題尚未解決；由于腫瘤細胞呈現高度異質性，屬于同一類型腫瘤的多個瘤細胞上可以表達不同的抗原，由一種腫瘤抗原(例如:多肽疫苗所使用的抗原)所激活的T細胞只能殺傷一部分的腫瘤細胞，不表達該抗原的瘤細胞則不能被殺傷；腫瘤細胞疫苗雖然可以包含幾乎全部的腫瘤抗原，但目前的研究表明其激活T細胞的作用有限，將其作為疫苗的效果并不
理相
[0005]因此，如何提供一種腫瘤疫苗，不存在使用安全性問題并且能對幾乎全部的腫瘤抗原有效，成為有待解決的問題。

【發明內容】

[0006]本發明提供了一種細胞囊泡在制備腫瘤疫苗中的應用，將源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡作為腫瘤疫苗的抗原，從而利于解決腫瘤疫苗不能對全部的腫瘤抗原有效，靶向性差以及使用安全性的問題。
[0007]本發明還提供一種腫瘤疫苗，采用源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡提供抗原，所得到的腫瘤疫苗包含的腫瘤抗原譜廣泛、全面，也利于提高臨床治療的靶向性和安全性。
[0008]本發明還提供了一種腫瘤疫苗的制備方法，實現了將源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡作為疫苗實體制備腫瘤疫苗。
[0009]本發明提供一種細胞囊泡在制備腫瘤疫苗中的應用，所述細胞囊泡為源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡。
[0010]作為本領域的基礎知識，細胞是由細胞膜包裹細胞內容物構成，而細胞膜是由磷脂雙分子層中間鑲嵌蛋白質分子所組成，其球狀結構則通過細胞內被稱為細胞骨架的蛋白纖維絲所形成的向心牽拉力得以維持。當細胞受到外界因素(例如:紫外線等)刺激細胞發生凋亡時，細胞骨架附著細胞膜部位的部分蛋白纖維絲斷裂或失去附著，向心牽拉力突然消失，使得局部細胞膜結構在外向拉力作用下，向外膨脹、突出并包裹細胞內容物以囊泡形式釋放到細胞外的介于細胞和分子之間的亞層次結構中，可以形成一種基本呈納米級的微顆粒，即本發明所述的“細胞囊泡”。
[0011]腫瘤疫苗在基體內的主要作用是誘導腫瘤特異性的T細胞的產生和活化，實現上述作用的基本過程包括:抗原提呈細胞(如:樹突狀細胞)攝取并加工腫瘤抗原，然后將該腫瘤抗原提呈給腫瘤特異性的T細胞，后者在識別腫瘤抗原后被激活并擴增，達到腫瘤部位，對基體的腫瘤細胞進行特異性殺傷。其中抗原提呈細胞對腫瘤抗原的有效攝取是完成上述過程的前提，由于抗原提呈細胞(如:樹突狀細胞)在攝取外來物時，對體積大小有嚴格要求，體積較小的多肽分子，以及體積較大的整個腫瘤細胞都難以被抗原提呈細胞攝取。細胞囊泡通常可以界于100-1000納米，非常適合被抗原提呈細胞(如:樹突狀細胞)攝取，利用這樣的細胞囊泡制成腫瘤疫苗，進入機體后，能夠容易地被抗原提呈細胞捕獲，使得腫瘤抗原能夠被有效提呈給腫瘤特異性T細胞，并激活這些T細胞，同時由于本發明使用的細胞囊泡可以包含其腫瘤細胞源的幾乎全部的腫瘤抗原(所述“全部的腫瘤抗原”指一種類型腫瘤中所有腫瘤細胞的抗原)，從而能對患有癌癥個體的所有腫瘤細胞進行廣泛的殺傷，同時也能對有腫瘤發生趨勢的個體進行免疫，使對所有腫瘤抗原具有抵抗力，預防腫瘤的發生。
[0012]本發明采用源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡作為腫瘤疫苗的抗原，所述細胞囊泡推薦的是源自于與所要殺傷或預防的腫瘤細胞同種類型的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞例如可以是商購可獲得的腫瘤細胞系。使用細胞囊泡的腫瘤疫苗相比于使用外源性DNA載體或氨基酸序列的腫瘤疫苗，能降低對機體的毒副作用。
[0013]在本發明的方案中，所述細胞囊泡的獲得是通過外界條件的刺激使腫瘤細胞凋亡，例如，使用紫外線照射腫瘤細胞，使腫瘤細胞凋亡后收集得到所述細胞囊泡。本領域技術人員也可根據所要治療的腫瘤類型的不同，選擇適合的腫瘤細胞的凋亡方法，為保全細胞中的腫瘤抗原，選擇不使細胞發生化學變化的凋亡方法是有利的，同時本發明所述誘導腫瘤細胞凋亡，可以按照本領域技術人員公知的判斷標準，例如觀察腫瘤細胞縮小、變暗，即可認為其已經凋亡。
[0014]進一步的，對于凋亡腫瘤細胞所釋放的細胞囊泡的收集可使用超速離心機在低溫條件下或室溫條件下進行分離。優選的，通過離心機，以100-100000g的離心力，收集細胞囊泡。收集過程的溫度沒有特殊的限制，只要能保證細胞囊泡不被降解即可，一般的可在低溫條件下(4°c左右)進行收集。
[0015]在本發明方案中，在使用紫外線照射腫瘤細胞使腫瘤細胞凋亡之前，還包括對腫瘤細胞進行培養，所述培養指在含有滿足正常腫瘤細胞生長所需物質的培養基(例如DMEM培養液)中對腫瘤細胞進行的培養。[0016]進一步的，所述細胞囊泡的粒徑為100-1000納米。
[0017]進一步的，所述腫瘤疫苗為用于卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、白血病或膠質瘤等其他類型腫瘤的腫瘤疫苗。[0018]本發明還提供了一種腫瘤疫苗，包括源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡和佐劑。
[0019]進一步的，所述佐劑為鋁佐劑。
[0020]進一步的，所述腫瘤疫苗的劑型包括注射劑。
[0021]進一步的，所述腫瘤細胞包括卵巢癌細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、白血病細胞或膠質瘤細胞。
[0022]在本發明的一個具體實施方案中，所述細胞囊泡通過使用紫外線照射腫瘤細胞，使腫瘤細胞凋亡后收集獲得。
[0023]本發明還提供了所述的腫瘤疫苗的制備方法，包括:制取所述細胞囊泡，并與佐劑制成所述腫瘤疫苗的過程。
[0024]進一步的，所述的腫瘤疫苗的制備方法，包括使用紫外線照射腫瘤細胞，使腫瘤細胞凋亡，收集凋亡腫瘤細胞所釋放的細胞囊泡，然后將所述細胞囊泡與所述佐劑混合形成所述腫瘤疫苗。
[0025]在本發明的具體方案 中，優選通過可行的方法使所收集的細胞囊泡的粒徑基本為100-1000納米的微顆粒。例如,對于凋亡腫瘤細胞所釋放的細胞囊泡的收集可使用超速離心機在低溫條件下或室溫條件下進行分離。優選的，通過離心機，以100-100000g的離心力，收集細胞囊泡。收集過程的溫度沒有特殊的限制，只要能保證細胞囊泡不被降解即可，一般的可在低溫條件下(4°C左右)進行收集。
[0026]在使用紫外線照射腫瘤細胞使腫瘤細胞凋亡之前，還可以對腫瘤細胞先進行培養(孵育)，所述培養指在含有滿足正常腫瘤細胞生長所需物質的培養基(例如DMEM培養液)中對腫瘤細胞進行的培養。
[0027]本發明提供的腫瘤疫苗可以是任何適于臨床應用的劑型和用藥規格，例如，可以是注射劑。所述腫瘤疫苗的制備方法還包括按照常規的疫苗制備方法制成所需要的劑型，例如制成注射劑，可以是通過加入生理鹽水制成注射針劑，也可以制成粉針劑等。
[0028]本發明提供的腫瘤疫苗可以通過皮下或肌肉注射給藥，對個體進行免疫，以抑制腫瘤發生或殺傷腫瘤細胞。
[0029]本發明提供的方案具有以下優點:
[0030](I)本發明提供的腫瘤疫苗，其細胞囊泡大小可達到100-1000納米，非常適合樹突狀細胞攝取，利于提高抗原提呈細胞向T細胞提呈抗原的效率，并增強腫瘤特異性T細胞對腫瘤細胞靶向殺傷力。
[0031](2)本發明提供的腫瘤疫苗，其細胞囊泡包含的腫瘤抗原譜廣泛、全面，能實現對幾乎所有腫瘤細胞的有效殺傷。
[0032](3)本發明提供的腫瘤疫苗，能對多種腫瘤細胞有效殺傷,并且對機體的毒副作用小，使用安全。
[0033](5)本發明提供的腫瘤疫苗，可以作為治療性疫苗也可以作為預防性疫苗，在不同的腫瘤治療階段使用，通過激活機體免疫系統，預防腫瘤的發生或對已有腫瘤細胞進行有效殺傷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1A顯示了腫瘤細胞沒有經凋亡處理產生的細胞囊泡圖片，圖1B顯示了腫瘤細胞經凋亡處理產生的細胞囊泡圖片。
[0035]圖2顯示了細胞囊泡可被樹突狀細胞攝取。
[0036]圖3顯示樹突狀細胞攝取細胞囊泡后，上調表達共刺激信號分子。
[0037]圖4A和圖4B顯示了樹突狀細胞攝取細胞囊泡后誘導腫瘤特異性T細胞活化、增殖。
[0038]圖5顯示活化的腫瘤特異性T細胞對腫瘤細胞進行殺傷。
[0039]圖6顯示腫瘤細胞囊泡免疫小鼠，誘導小鼠產生強烈免疫反應。
[0040]圖7A和圖7B顯示腫瘤細胞囊泡免疫荷瘤小鼠，抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠的存活時間。
[0041]圖8顯示了本發明方案的實施對肝腎功能無影響。
[0042]圖9顯示了本發明腫瘤疫苗的抗瘤效應。
[0043]圖10顯示了腫瘤細胞囊泡免疫荷有不同腫瘤的小鼠，均可抑制腫瘤生長。
【具體實施方式】
[0044]本發明使用的術語“細胞囊泡”是指由腫瘤細胞凋亡后所形成、呈現為一種微顆粒囊狀形態。`
[0045]下述實施例中使用的各種腫瘤細胞、藥物及實驗動物:
[0046]李斯特菌、小鼠肝癌細胞系H22(BALB/c遺傳背景)、小鼠黑色素瘤細胞系B16(C57BL/6遺傳背景)、小鼠乳腺癌細胞系4T1 (BALB/c遺傳背景)、小鼠結腸癌細胞系MC26(BALB/c遺傳背景)、小鼠骨髓細胞均可從美國ATCC公司或中國典型物保藏中心CCTCC購買。
[0047]BALB/c小鼠，C57BL/6小鼠，購自武漢大學醫學實驗動物中心，體重18克左右；
[0048]羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)、PKH26、抗小鼠⑶80、⑶86、MHC II的抗體購自Sigma公司，細胞因子GM-CSF和IL-4購自PeproTech公司，T細胞分離試劑盒購自R&D Systems公司、伽馬干擾素檢測試劑盒、腫瘤細胞殺傷檢測試劑盒購自Abcam公司。
[0049]實施例1:腫瘤細胞經凋亡處理后產生了細胞囊泡。
[0050]1、實驗材料和試劑
[0051]H22小鼠肝癌細胞，熒光染料:羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(可商購獲得，帶有綠色熒光)，紫外線裝置為常規細胞超凈工作臺所有。
[0052]2、實驗步驟
[0053]I)在DMEM細胞培養液中培養H22小鼠肝癌細胞，使細胞量達到2X IO7 ;
[0054]2)將上述H22小鼠肝癌細胞進行羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂熒光染料染色后，加入新鮮培養液，然后將上述H22小鼠肝癌細胞分為兩組(H22-1組、H22-2組)，其中一組H22-1使用紫外線照射60分鐘，另一組H22-2不做處理，在培養液中正常培養；
[0055]3)在紫外線照射后的48小時，所有的H22-1組H22小鼠肝癌細胞出現明顯變小、暗淡的狀態，確認這些腫瘤細胞已經被紫外線誘導凋亡，收集上述凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡:包括分離取上清后進行逐步離心，即先以500rpm、1000rpm、5000rpm的轉速各離心10分鐘，之后以14000 g的離心力離心I分鐘，以除去細胞及碎片，取離心后的上清再以14000g的離心力離心I小時，得到來自H22小鼠肝癌細胞凋亡所產生的囊泡，作為實驗組；[0056]按照相同方法對收集正常培養條件下培養的H22-2組細胞，作為對照組，雖然這組細胞沒有經紫外線處理，但由于正常細胞死亡也會釋放少量細胞囊泡，因此收集其作為對照組。
[0057]3、實驗結果
[0058]將來自上述實驗組的細胞囊泡和對照組的細胞囊泡使用0.9% (g/ml)的生理鹽水重懸后，分別涂片后在雙光子熒光顯微鏡下觀察，從圖1可以看出，作為對照組，來自沒有使用紫外線處理的H22小鼠肝癌細胞囊泡非常少，涂片后僅能觀察到極少綠色細胞囊泡(見圖1A)，作為實驗組，來自使用紫外線處理的H22小鼠肝癌細胞囊泡，涂片后觀察到大量綠色細胞囊泡(見圖1B),證實腫瘤細胞經紫外線處理后,釋放了細胞囊泡,大小在Ιμπι左右。
[0059]改變使腫瘤細胞凋亡的處理方法，可以得到同樣的結果。
[0060]實施例2:誘導腫瘤細胞產生的細胞囊泡可被樹突狀細胞攝取。
[0061]1、實驗材料和試劑
[0062]使用的Η22小鼠肝癌細胞以及紫外線裝置同實施例1，羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)(綠色熒光染料)，ΡΚΗ26 (紅色熒光染料)。
[0063]2、實驗步驟
[0064]I)按實施例1所述方法培養Η22小鼠肝癌細胞，使細胞量達到IXlO7 ;使用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂對上述Η22小鼠肝癌細胞進行染色，然后加入新鮮培養液，使用紫外線照射60分鐘，在紫外線照射后的48小時，Η22小鼠肝癌細胞出現明顯變小、暗淡的狀態，確認這些腫瘤細胞已經被紫外線誘導凋亡，按實施例1所述方法收集帶有綠色熒光的紫外線誘導產生的細胞 囊泡；
[0065]2)取小鼠骨髓細胞在培養液中進行培養，使細胞量達到106/ml，加入細胞因子GM-CSF和IL-4培養6天，骨髓細胞被誘導為樹突狀細胞，對樹突狀細胞使用紅色熒光染料PKH26進行染色。
[0066]3)將上述帶綠色熒光的紫外線誘導產生的細胞囊泡和帶紅色熒光的樹突狀細胞在37 °C條件下進行孵育。
[0067]3、實驗結果
[0068]將綠色熒光細胞囊泡和紅色熒光樹突狀細胞孵育4小時后，清洗樹突狀細胞3次，對細胞進行涂片，然后在熒光顯微鏡下觀察，可見經誘導腫瘤細胞產生的綠色熒光細胞囊泡能進入紅色熒光樹突狀細胞(見圖2)，表明上述紫外線照射誘導凋亡獲得的細胞囊泡能夠被樹突狀細胞攝取。
[0069]實施例3:樹突狀細胞攝取細胞囊泡后，上調表達共刺激信號分子。
[0070]1、實驗材料和試劑
[0071]使用的H22小鼠肝癌細胞同實施例1，樹突狀細胞同實施例2，熒光標記的抗小鼠CD80、CD86、MHC II 的抗體。
[0072]2、實驗步驟
[0073]I)樹突狀細胞的培養方法同實施例2 ；H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡通過實施例1方法制備，使樹突狀細胞攝取H22小鼠肝癌細胞的方法同實施例2。
[0074]2)將H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡和樹突狀細胞進行孵育48小時，將攝取了細胞囊泡的樹突狀細胞作為實驗組；同時，將單獨的樹突狀細胞孵育48小時，作為對照組。
[0075]3)收集實驗組和對照組樹突狀細胞，采用熒光標記的抗小鼠⑶80、⑶86、MHC II的抗體對兩組樹突狀細胞進行標記。
[0076]3、實驗結果
[0077]結果顯示，與對照組樹突狀細胞(沒有攝取腫瘤細胞囊泡的樹突狀細胞，即單獨DC)相比，攝取了腫瘤細胞囊泡的樹突狀細胞(囊泡/DC)顯著上調共刺激分子⑶80和⑶86以及MHC II類分子(見圖3)，證實本發明的細胞囊泡可以有效誘導樹突狀細胞成熟，上調表達共刺激信號分子。
[0078]實施例4:攝取了細胞囊泡的樹突狀細胞可誘導腫瘤特異性T細胞增殖、活化。
[0079]1、實驗材料和試劑
[0080]H22小鼠肝癌細胞同實施例1，小鼠骨髓細胞同實施例2，T細胞分離試劑盒、檢測T細胞活化性能的伽馬干擾素檢測試劑盒。
[0081]2、實驗步驟
[0082]I)使用實施例1方法獲得來自凋亡H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡；使用實施例2方法獲得樹突狀細胞；
[0083]2)在DMEM培養液 中培養H22小鼠肝癌細胞，將3X 105H22小鼠肝癌細胞皮下接種BALB/c小鼠，共6只，15天后，取小鼠脾臟，采用T細胞分離試劑盒從BALB/c小鼠脾臟中分離T細胞(其中含有肝癌特異性T細胞)，以下簡稱腫瘤特異性T細胞；
[0084]將2000個李斯特菌靜脈注射BALB/c小鼠，共6只，7天后，取小鼠脾臟，采用T細胞分離試劑盒從BALB/c小鼠脾臟中分離T細胞(其中含有李斯特菌特異性T細胞)，以下簡稱李斯特菌特異性T細胞。
[0085]3)將步驟I獲得的H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡與樹突狀細胞進行孵育48小時，將攝取了細胞囊泡的樹突狀細胞作為實驗組；同時，將單獨的樹突狀細胞孵育48小時，作為對照組。
[0086]4)將實驗組樹突狀細胞分為兩等份，分別與上述李斯特菌特異性T細胞和腫瘤特異性T細胞以1:10比例進行共培養72小時后，采用氚標記的胸腺嘧啶核苷法，利用氚標記胸腺嘧啶核苷方法檢測T細胞增殖；采用ELISA法，利用伽馬干擾素檢測試劑盒檢測培養上清中伽馬干擾素的水平；
[0087]同時將對照組樹突狀細胞為兩等份，分別與上述李斯特菌特異性T細胞和腫瘤特異性T細胞以1:10比例進行共培養72小時后，采用氚標記的胸腺嘧啶核苷法，利用氚標記胸腺嘧啶核苷方法檢測T細胞增殖；采用ELISA法，利用伽馬干擾素檢測試劑盒檢測培養上清中伽馬干擾素的水平。
[0088]3、實驗結果
[0089]由圖4A可以看出，沒有攝取細胞囊泡的樹突狀細胞(即單獨DC)對腫瘤特異性T細胞(即腫瘤T)增殖作用很小，攝取了細胞囊泡的樹突狀細胞(即囊泡/DC)能夠有效誘導腫瘤特異性T細胞增殖，二者之間的p〈0.001，表現出顯著的差異，即攝取了細胞囊泡的樹突狀細胞對誘導腫瘤特異性T細胞增殖的作用顯著高于沒有攝取細胞囊泡的樹突狀細胞，并且二者對李斯特菌特異性T細胞(即李斯特T)的增殖幾乎都沒有作用；圖48顯示，沒有攝取細胞囊泡的樹突狀細胞對誘導腫瘤特異性T細胞產生伽馬干擾素作用很小；攝取了細胞囊泡的樹突狀細胞能夠有效誘導腫瘤特異性T細胞產生伽馬干擾素，二者之間的p〈0.001，表現出顯著的差異，即攝取了細胞囊泡的樹突狀細胞對誘導腫瘤特異性T細胞產生伽馬干擾素的作用顯著高于沒有攝取細胞囊泡的樹突狀細胞，并且二者對李斯特菌特異性T細胞產生伽馬干擾素幾乎都沒有作用。
[0090]實施例5:活化的腫瘤特異性T細胞對腫瘤細胞進行殺傷。
[0091]1、實驗材料和試劑
[0092]使用的H22小鼠肝癌細胞來源的細胞囊泡、樹突狀細胞、腫瘤特異性T細胞同實施例4，T細胞對腫瘤細胞殺傷檢測試劑盒。
[0093]2、實驗步驟
[0094]I)在DMEM培養液中培養H22小鼠肝癌細胞，將3 X 105H22小鼠肝癌細胞皮下接種BALB/c小鼠，共6只，15天后，取小鼠脾臟，采用T細胞分離試劑盒從BALB/c小鼠脾臟中分離T細胞(其中含有肝癌特異性T細胞)，即獲得腫瘤特異性T細胞。
[0095]2)將H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡和樹突狀細胞進行孵育48小時，將攝取了細胞囊泡的樹突狀細胞作為實驗組；同時，將單獨的樹突狀細胞孵育48小時，作為對照組。
[0096]3)將上述腫瘤特異性T細胞分為兩等份，分別與實驗組的樹突狀細胞、對照組的樹突狀細胞以按10:1比例進行共培養7天后，收集分別經實驗組樹突狀細胞和對照組樹突狀細胞誘導后的腫瘤特異性T細胞，即效應細胞，分為實驗組效應細胞和對照組效應細胞。
[0097]4)以CFSE標記H22小鼠肝癌細胞作為靶細胞，分為等量兩組，將其中一組靶細胞與實驗組效應細胞按1: 5、1:25、1:50比例分別進行孵育，4小時后，收集細胞，通過T細胞對腫瘤細胞殺傷檢測試劑盒進行PE標記Annexin V染色,流式細胞術分析CFSE陽性細胞中Annexin V陽性細胞的比例， 即為腫瘤細胞的殺傷率；
[0098]同時將另一組靶細胞與對照組效應細胞按1:5、1:25、1:50例分別進行孵育，4小時后，收集細胞,通過T細胞對腫瘤細胞殺傷檢測試劑盒進行PE標記Annexin V染色，流式細胞術分析CFSE陽性細胞中Annexin V陽性細胞的比例，即為腫瘤細胞的殺傷率。
[0099]3、實驗結果
[0100]由圖5可以看出，當靶細胞與效應細胞比例為1:5時，實驗組效應細胞與對照組效應細胞對靶細胞的殺傷率沒有顯著不同；當靶細胞與效應細胞比例為1:25時，實驗組效應細胞與對照組效應細胞對靶細胞的殺傷率之間的P〈0.05，表現出顯著的差異，即相比于對照組效應細胞，實驗組效應細胞具有對腫瘤細胞顯著提高的殺傷能力；靶細胞與效應細胞比例為1:50時，實驗組效應細胞與對照組效應細胞對靶細胞的殺傷率之間的p〈0.01，表現出更加顯著的差異，即相比于對照組效應細胞，實驗組效應細胞具有對腫瘤細胞更加顯著提聞的殺傷能力。
[0101]實施例6:腫瘤細胞囊泡免疫小鼠，誘導小鼠產生強烈免疫反應。
[0102]1、實驗材料和試劑
[0103]使用的H22小鼠肝癌細胞同實施例1，實驗用BALB/c小鼠購自武漢大學醫學實驗動物中心，體重18克左右。
[0104]2、實驗步驟
[0105]I)通過實施例1方法獲得H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡；
[0106]2)將正常喂養的10只BALB/c小鼠分為等量兩組:[0107]其中一組作為實驗組，使用上述制備的細胞囊泡進行皮下免疫:具體為第一天免疫第一次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第二天免疫第二次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第七天免疫第三次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第八天，觀察小鼠胭窩淋巴結；
[0108]另一組BALB/c小鼠作為對照組，施用安慰劑:生理鹽水，具體為第一天施用第一次(施用0.05ml生理鹽水)，第二天施用第二次(施用0.05ml生理鹽水),第七天施用第三次(施用0.05ml生理鹽水)，第八天，觀察小鼠胭窩淋巴結。
[0109]3、實驗結果
[0110]由圖6可以看出，相比于對照組小鼠，經細胞囊泡皮下免疫后的實驗組小鼠，胭窩淋巴結明顯腫大，表明腫瘤細胞囊泡免疫小鼠，誘導小鼠產生強烈免疫反應。
[0111]實施例7:腫瘤細胞囊泡免疫小鼠，抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠的存活時間。
[0112]1、實驗材料和試劑
[0113]使用的H22小 鼠肝癌細胞來源同實施例1，實驗用BALB/c小鼠購自武漢大學醫學實驗動物中心，體重18克左右。
[0114]2、實驗步驟
[0115]I)通過實施例1方法獲得H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡；
[0116]2)將正常喂養的12只BALB/c小鼠分為等量兩組:
[0117]其中一組作為實驗組，使用上述制備的細胞囊泡進行右側腹皮下免疫:具體為第一天免疫第一次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第二天免疫第二次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第七天免疫第三次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第八天，在小鼠左側腹皮下接種3X 105H22腫瘤細胞，觀察腫瘤的生成和小鼠存活時間；
[0118]另一組BALB/c小鼠作為對照組，施用安慰劑:生理鹽水，具體為第一天施用第一次(施用0.05ml生理鹽水)，第二天施用第二次(施用0.05ml生理鹽水),第七天施用第三次(施用0.05ml生理鹽水)，第八天，在小鼠左側腹皮下接種3X 105H22腫瘤細胞，觀察腫瘤的生成和小鼠存活時間。
[0119]3、實驗結果
[0120]由圖7A和圖7B可以看出，相比于使用安慰劑處理的對照組小鼠，經細胞囊泡免疫的實驗組小鼠，能夠有效抑制腫瘤生成，使80%的小鼠無腫瘤生成，并顯著延長了小鼠荷瘤生存時間。
[0121]實施例8:細胞囊泡免疫小鼠,對肝腎功能無影響。
[0122]1、實驗材料和試劑
[0123]使用的H22小鼠肝癌細胞來源同實施例1，實驗用BALB/c小鼠購自武漢大學醫學實驗動物中心，體重18克左右。
[0124]2、實驗步驟
[0125]I)通過實施例1方法獲得H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡；
[0126]2)將正常喂養的16只BALB/c小鼠分為等量兩組:
[0127]其中一組作為實驗組，使用上述制備的細胞囊泡進行右側腹皮下免疫:具體為第一天免疫第一次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第二天免疫第二次(含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第七天免疫第三次(含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，之后每天正常喂養；
[0128]另一組BALB/c小鼠作為對照組，施用安慰劑:生理鹽水，具體為第一天施用第一次(0.05ml生理鹽水)，第二天施用第二次(0.05ml生理鹽水)，第七天施用第三次(0.05ml生理鹽水)，之后每天正常喂養。
[0129]3)在第八天從小鼠尾靜脈采血，檢測血中谷丙轉氨酶和肌酐含量。
[0130]3、實驗結果
[0131]由圖8可以看出，相比于使用安慰劑處理的對照組，經細胞囊泡免疫后的實驗組小鼠，血中谷丙轉氨酶和肌酐含量基本沒有改變，表明細胞囊泡免疫肝腎功能基本無影響。
[0132]實施例9腫瘤疫苗的抗瘤效應
[0133]1、實驗材料和試劑
[0134]使用的H22小鼠肝癌細胞來源同實施例1，實驗用BALB/c小鼠購自武漢大學醫學實驗動物中心，體重18克左右。
[0135]2、實驗步驟
[0136]I)通過實施例1方法獲得H22小鼠肝癌細胞的細胞囊泡；
[0137]2)將正常喂養的20只BALB/c小鼠分為等量兩組:
[0138]其中一組使用上述制備的細胞囊泡進行`右側腹皮下免疫，具體為第一天免疫第一次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第二天免疫第二次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第七天免疫第三次(施用含有5xl07細胞囊泡的0.05ml生理鹽水)，第八天，在小鼠左側腹皮下接種IX 106H22腫瘤細胞，觀察腫瘤的生成情況；
[0139]另一組則使用上述制備的細胞囊泡與和佐劑(例如鋁佐劑)混合后進行右側腹皮下免疫:具體為第一天免疫第一次(施用含有5xl07細胞囊泡和0.05mg鋁佐劑的0.05ml生理鹽水)，第二天免疫第二次(施用含有5xl07細胞囊泡和0.05mg鋁佐劑的0.05ml生理鹽水)，第七天免疫第三次(施用含有5xl07細胞囊泡和0.05mg鋁佐劑的0.05ml生理鹽水)，第八天，在小鼠左側腹皮下接種1X106H22腫瘤細胞，觀察皮下腫瘤結節的形成；
[0140]3、實驗結果
[0141]由圖9可以看出，施用細胞囊泡的腫瘤疫苗可使至少30%小鼠免于腫瘤形成，但是施用細胞囊泡聯合佐劑的腫瘤疫苗，可使70%小鼠免于腫瘤發生，二者p〈0.05，說明施用細胞囊泡聯合佐劑的腫瘤疫苗較施用單獨細胞囊泡的腫瘤疫苗，產生更好的抗腫瘤免疫效果O
[0142]實施例10本發明的方案對肝癌外的其它腫瘤類型同樣有效
[0143]1、實驗材料和試劑
[0144]不同腫瘤細胞系包括:小鼠黑色素瘤細胞系B16(C57BL/6遺傳背景)、小鼠乳腺癌細胞系4Tl(BALB/c遺傳背景)、小鼠結腸癌細胞系MC26(BALB/c遺傳背景);實驗用C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠購自武漢大學醫學實驗動物中心，體重18克左右。
[0145]2、實驗步驟
[0146]I)在DMEM培養液中分別培養上述腫瘤細胞系，使細胞量分別達到I X IO8 ;使用紫外線照射60分鐘，在紫外線照射后的48小時，各腫瘤細胞系細胞出現明顯變小、暗淡的狀態，確認這些腫瘤細胞已經被紫外線誘導凋亡，按實施例1所述方法收集來自各腫瘤細胞系凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡。
[0147]2)分別將來自各腫瘤細胞系的細胞囊泡、佐劑(例如鋁佐劑)與生理鹽水混合，制成針對各腫瘤的腫瘤疫苗。
[0148]3)檢測各腫瘤疫苗對荷有相應腫瘤的小鼠的抗瘤效應，下面以小鼠乳腺癌腫瘤疫苗(其中每毫升小鼠乳腺腫瘤疫苗含細胞囊泡5xl07，含鋁佐劑0.05mg)為例說明檢測方法:
[0149]將正常喂養的16只BALB/c小鼠分為等量兩組，其中一組作為實驗組，使用上述制備的小鼠乳腺癌腫瘤疫苗進行右側腹皮下免疫:具體為第一天免疫第一次(施用人乳腺癌腫瘤疫苗的使用量為0.05ml)，第二天免疫第二次(人乳腺癌腫瘤疫苗的使用量為
0.05ml)，第七天免疫第三次(人乳腺癌腫瘤疫苗的使用量為0.05ml)，第八天，在小鼠左側腹皮下接種3X 1054T1小鼠乳腺癌腫瘤細胞，觀察腫瘤的生成情況；
[0150]另一組BALB/c小鼠作為對照組，施用安慰劑:生理鹽水，具體為第一天施用第一次(0.05ml生理鹽水)，第二天施用第二次(0.05ml生理鹽水)，第七天施用第三次(0.05ml生理鹽水)，第八天，在小鼠左側腹皮下接種3 X 1054T1小鼠乳腺癌腫瘤細胞，觀察皮下腫瘤結節的生成情況。
[0151]3、實驗結果
[0152]由圖10以看出，針對小鼠黑色素瘤細胞系B 16 (C57BL/6遺傳背景)、小鼠乳腺癌細胞系4T1 (BALB/c遺傳背景)、小鼠結腸癌細胞系MC26 (BALB/c遺傳背景)的腫瘤細胞，相比于使用安慰劑處理的對照組小鼠，經各自腫瘤疫苗免疫后的實驗組小鼠，能夠顯著抑制腫瘤生成，各實驗組與 對照組之間的P〈0.05，由圖10可以看出，80%左右的小鼠未見任何可觸摸的瘤結節,顯示無腫瘤 生成。
【權利要求】
1.細胞囊泡在制備腫瘤疫苗中的應用，所述細胞囊泡為源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡。
2.根據權利要求1所述的應用，其中，所述細胞囊泡通過使用紫外線照射腫瘤細胞使腫瘤細胞凋亡后收集獲得。
3.根據權利要求1所述的應用，其中，所述細胞囊泡的粒徑為100-1000納米。
4.根據權利要求1所述的應用，其中，所述腫瘤疫苗為用于卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、白血病、或膠質瘤的腫瘤疫苗。
5.根據權利要求1-4任一項所述的應用，其中，所述腫瘤疫苗包括源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡和佐劑。
6.根據權利要求1-5任一項所述的應用，其中，所述腫瘤疫苗的劑型包括注射制劑。
7.一種腫瘤疫苗,包括源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡和佐劑。
8.根據權利要求7所述的腫瘤疫苗，所述佐劑為鋁佐劑。
9.根據權利要求7所述的腫瘤疫苗，所述腫瘤疫苗的劑型包括注射劑。
10.根據權利要求7所述的腫瘤疫苗，所述腫瘤細胞包括卵巢癌細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、白血病細胞或膠質瘤細胞。
11.根據權利要求7-10任一項所述腫瘤疫苗，其中，所述細胞囊泡是通過使用紫外線照射腫瘤細胞，使腫瘤細胞凋亡后收集獲得。`
12.權利要求7-11任一項所述的腫瘤疫苗的制備方法，包括:制取所述細胞囊泡，并與佐劑制成所述腫瘤疫苗的過程。
13.根據權利要求12所述的腫瘤疫苗的制備方法，還包括制成注射劑的過程。
【文檔編號】A61P35/00GK103446580SQ201210176820
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月31日 優先權日:2012年5月31日
【發明者】黃波 申請人:湖北盛齊安生物科技有限公司