專利名稱：一種鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于禽類用生物制品技術領域，涉及一種鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉及其制備方法。
背景技術：
鴨病毒性肝炎簡稱鴨肝炎，是危害雛鴨最嚴重的疫病之一，主要危害20日齡以內(nèi)的雛鴨，雛鴨日齡越小，死亡率越高，最高死亡率可達90%-95%，并且所有的抗菌素對本病無效。鴨病毒性肝炎早在1958年在我國發(fā)現(xiàn)，20世紀80年代初期起本病在我國再次流行， 此后，各地疫情此起彼伏，疫情能夠被鴨病毒性肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制；1997年以來，本病在某些地區(qū)出現(xiàn)較嚴重的流行，其疫情不能被標準鴨病毒性肝炎I型弱毒疫苗完全地控制，懷疑有I型鴨病毒性肝炎病毒變異株出現(xiàn)。鴨痕(Duckplape)又名鴨病毒性腸炎(Duck virus enteritis, DVE),是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病的特征是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率都高。早在1923年Baudet氏在荷蘭首次發(fā)現(xiàn)本病，直到1940年Bos氏首次提出鴨瘟的名稱，并確認是一種不同于雞瘟的新病毒病。鴨瘟在我國流行的正式報道是黃引賢1957年在廣東首先提出的，隨后武漢、上海、浙江、江蘇、廣西、湖南和福建等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，至80年代傳播到東北各省。1957年以來，本病廣泛流行于我國華南、華中、華東養(yǎng)鴨業(yè)較發(fā)達地區(qū)，造成很大的經(jīng)濟損失。鴨病毒性肝炎、鴨瘟病是養(yǎng)鴨業(yè)中常見的疾病，容易大范圍內(nèi)爆發(fā)，二者有時會混合感染，給治療增加了難度。主要防治方法包括抗病毒藥、中西藥及制劑、卵黃抗體及其他生物制劑等，其中卵黃抗體是最有效的治療鴨發(fā)生病毒病的方法。卵黃抗體IgY是的一種免疫球蛋白Ig，IgY在功能上相當于哺乳動物IgG，但結構上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空間構象。卵黃抗體具有很多優(yōu)越性。(I)由于鳥類與哺乳類動物種系發(fā)生學的差距，鳥類更適于生產(chǎn)抗哺乳動物抗原的特異性抗體。卵黃抗體不會激發(fā)補體系統(tǒng)，不與抗哺乳動物抗原的抗體發(fā)生反應，不與哺乳動物和細菌的Fe受體結合，這在免疫診斷中具有重要意義。(2)卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白，在貯存、生產(chǎn)、加工、攝食及消化過程中保證其穩(wěn)定性是非常關鍵的。多項試驗表明，IgY具有較好的穩(wěn)定性，耐酸、耐堿、耐熱。卵黃抗體較易保存，4°C條件下存放5年或室溫條件下存放6個月對抗體活性無明顯影響。(3)卵黃抗體量大，成本低，便于規(guī)?；a(chǎn)。卵黃中抗體濃度能長期維持在相當于甚至超過血清抗體濃度的水平上。I只產(chǎn)蛋(以平均每周產(chǎn)蛋5-6枚，平均每枚蛋蛋黃大約15mL計算)所產(chǎn)蛋生產(chǎn)的抗體量相當于90-100mL血清或180-200mL血液中抗體的量，例如I只兔子I個月可提取IgG約200mg，而I個月I只蛋可從蛋中提取IgY 2000mg以上。此外，在實際生產(chǎn)中，動物的采血不僅對動物本身是極大的應激，而且費時、費工，大規(guī)模生產(chǎn)是不切實際的，而利用蛋生產(chǎn)抗體要方便的多?？偟膩碇v，卵黃抗體對動物沒有毒副作用，用卵黃抗體治療動物疾病不但避免了血清價格昂貴、產(chǎn)量低的缺點，而且可以避免血清在治療過程中引起的副作用，是一種很有前途的新型免疫球蛋白制劑。因此，卵黃抗體在禽畜疾病診斷、治療和預防的應用越來越多。目前卵黃抗體的制備及生產(chǎn)工藝已經(jīng)成熟，可以保質(zhì)保量的生產(chǎn)。 市場上現(xiàn)有的產(chǎn)品一般都是按標準毒株生產(chǎn)的疫苗，用常見的水稀釋法結合硫酸銨鹽析法得到卵黃抗體產(chǎn)品，溶解度低、生產(chǎn)時抗體回收率低等缺點；而本發(fā)明在酸化水處理中加入冷熱技術，使本產(chǎn)品的純度提高，損失減少，溶解快，生物活性不受影響等優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉。本發(fā)明的目的同時在于提供一種鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉的制備方法。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是一種鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉，由以下重量百分數(shù)的各組分組成鴨瘟卵黃抗體33-60%、鴨病毒性肝炎卵黃抗體30-55%、甲醛0. 2-0. 3%、硫柳汞0. 01-0. 02%、4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。一種所述鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉的制備方法，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得蛋，將蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干得到鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉。所述的鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉的制備方法，具體步驟是I)分離毒株制備疫苗本次病毒樣品主要從江蘇南京和福建分別采集鴨病毒性肝炎樣品和鴨瘟樣品，經(jīng)過無菌采集臨床上發(fā)病癥狀明顯的病例，將采集的樣品研磨，經(jīng)過3次凍融，15000rpm/min高速離心留取上清液,將上清液接種于雞胚囊中傳代經(jīng)過62代的傳遞，根據(jù)傳代胚胎病變和人工致病試驗，驗證得弱毒株JSNJ62株；鴨瘟病毒株經(jīng)過上述的方式得到病毒株FJ株，根據(jù)GenBank登錄號為EF643557公布UL28基因序列設計引物，擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接至PMD18-T載體并轉化感受細胞DH5 a，測序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp,備用；2)免疫健康鴨群制得蛋免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗1.5mL (含毒103 2ELD50/0. IMl)和鴨瘟滅活疫苗I. 5mL (含毒102 8ELD5(l/0. lmL)，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔7天時間，以后免疫加I倍量，兩種疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后開始檢測抗體效價，使抗體效價達到I :256時，開始收集蛋，收集的蛋進行清理、消毒，晾干備用；3)水稀釋法酸化處理分離蛋卵黃，加入等體積的無菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白，得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60-65°C水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為4. 9-5. 2的、溫度為4-6°C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，靜置沉淀，取上清液，離心 20min, 15000rpm/min,留上清液；4)辛酸處理；向步驟3)上清液中加入辛酸，辛酸加入量為溶液體積的0. 8-1. 0%,混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心10min,20000rpm/min,留取上清液,靜置；5)用0. 45 y m的濾膜對步驟4)所得上清液過濾，截流分子量大于200KD大分子物持，再經(jīng)0. 01 i! m的濾膜孔徑進行超濾濃縮，使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2.5mL/500羽份為止；6)向步驟5)所得卵黃溶液加入甲醛、硫柳汞防腐，甲醛的加入量為0. 2-0. 3%，硫柳汞為 0. 01-0. 02% ；7)再加入輔料4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇；8)預凍采用一 80°C進行預凍，要充分凍徹底；9)預凍后進行凍干，凍干曲線程序是_40°C開始升華，2h后升到_35°C保持14h。本發(fā)明在酸化水處理中加入冷熱技術，使本產(chǎn)品的純度提高，損失減少，溶解快，生物活性不受影響等優(yōu)點。
具體實施例方式實施例I.本實施例鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉，由以下重量百分數(shù)的各組分組成鴨瘟卵黃抗體36. 68%、鴨病毒性肝炎卵黃抗體50%、甲醛0. 3%、硫柳汞
0.02%,5%葡萄糖、2%山梨醇、3%甘氨酸、3%甘露醇。本實施例鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉的制備方法，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得蛋，將蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干等得到鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉。本實施例鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉的制備方法，具體步驟為I)選擇自行分離毒株制備成疫苗本次病毒樣品主要從江蘇南京和福建分別采集鴨病毒性肝炎樣品和鴨瘟樣品，經(jīng)過無菌采集臨床上發(fā)病癥狀明顯的病例，將采集的樣品研磨，經(jīng)過3次凍融，15000rpm/min高速離心留取上清液,將上清液接種于雞胚囊中傳代經(jīng)過62代的傳遞，根據(jù)傳代胚胎病變和人工致病試驗，驗證得弱毒株JSNJ62株；鴨瘟病毒株經(jīng)過上述的方式得到病毒株FJ株，根據(jù)GenBank登錄號為EF643557公布UL28基因序列設計引物，擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接至PMD18-T載體并轉化感受細胞DH5 a，測序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp，由上述兩種病毒株制成疫苗，備用；2)免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗I. 5mL (含毒103 2ELD5(l/0. IMl)和鴨瘟滅活疫苗I. 5mL (含毒102_8ELD5tlA). lmL)，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔7天時間，以后免疫加I倍量，兩種疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后開始檢測抗體效價，使抗體效價達到I :256時,開始收集種蛋；3)收集蛋，將蛋經(jīng)過消毒、晾干，分離卵黃，打碎，加入等體積的無菌水，攪拌混勻，直到顏色發(fā)白為止，得到卵黃溶液；4)將上述的卵黃液放入60°C水浴鍋內(nèi)加熱30min，期間要間斷性的攪拌，使其受熱均勻；5)加熱后加入原卵黃液體積的6倍預冷pH為4. 8鹽酸水溶液，混勻，靜置，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液；6)將步驟5)得到的上清液中按體積加入0. 8%辛酸，混勻，靜置，棄除上浮雜質(zhì)，留取下清液，離心IOmin, 20000rpm/min,取上清液；
7)將步驟6)上清液經(jīng)過0. 45 y m濾膜過濾，得到濾液，經(jīng)過超濾裝置截流分子量大于50KD的物質(zhì)，采用循環(huán)方式濃縮，使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2. 5mL/500羽份為止；
8)濃縮液按體積加入甲醛量為0. 3%，硫柳汞量為0. 02% ；9)配制過程中，加入輔料為5%葡萄糖、2%山梨醇、3%甘氨酸、3%甘露醇等物質(zhì)；10)預冷，根據(jù)凍干曲線程序?qū)⑴渲坪玫臐饪s液放入_80°C進行預凍，這一步必須將產(chǎn)品凍的徹底；11)按照凍干曲線設定凍干程序。凍干曲線程序是_40°C開始升華，2h后升到_35°C保持14h。為了檢測卵黃抗體在常溫下的放置時抗體效價變化，以此來確定本產(chǎn)品的保質(zhì)期，做了以下試驗將本品保存在37°C培養(yǎng)箱中，保存24個月，分別I周、2周、I月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用瓊脂擴散(AGP)法，測定每個時間點取樣品的卵黃抗體效價變化，結果見表I。表I.常溫放置凍干粉不同時間段效價的變化
權利要求
1.一種鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉，其特征在于由以下重量百分數(shù)的各組分組成鴨瘟卵黃抗體33-60%、鴨病毒性肝炎卵黃抗體30-55%、甲醛0. 2-0. 3%、硫柳汞0.01-0. 02%,4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。
2.一種如權利要求I所述鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉的制備方法，其特征在于包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得蛋，將蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干得到鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉。
3.根據(jù)權利要求2所述的鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉的制備方法，其特征在于具體步驟是 1)免疫健康鴨群制得蛋免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗I.5mL (含毒103_2ELD5tlA). IMl)和鴨瘟滅活疫苗1.5 mL (含毒IO2 8 ELD5(l/0. I mL )，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔7天時間，以后免疫加I倍量，兩種疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后開始檢測抗體效價，使抗體效價達到I :256時，開始收集蛋，收集的蛋進行清理、消毒，晾干備用； 2)水稀釋法酸化處理分離蛋卵黃，加入等體積的無菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白，得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60-65°C水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為4. 9-5. 2的、溫度為4-6°C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，靜置沉淀，取上清液，離心 20min, 15000rpm/min,留上清液； 3)辛酸處理；向步驟3)上清液中加入辛酸，辛酸加入量為溶液體積的0.8-1. 0%，混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心10min，20000rpm/min，留取上清液，靜置； 4)用0.45mm的濾膜對步驟4)所得上清液過濾，截流分子量大于200KD的大分子物質(zhì)，再經(jīng)0. Olmm的濾膜孔徑進行超濾濃縮，使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2. 5 mL/500羽份為止； 5)向步驟4)所得卵黃溶液加入甲醛、硫柳汞防腐，甲醛的加入量為0.2-0. 3%，硫柳汞為 0. 01-0. 02% ； 6)再加入輔料4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇； 7)預凍在_80°C進行徹底的冷凍； 8)預凍后進行凍干，凍干曲線程序是_40°C開始升華，2h后升到-35°C保持14h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉，由以下重量百分數(shù)的各組分組成鴨瘟卵黃抗體30-60%、鴨病毒性肝炎卵黃抗體30-55%、甲醛0.2-0.3%、硫柳汞0.01-0.02%、4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。本發(fā)明同時公開了其制備方法，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得蛋，分離蛋卵黃后酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干得到鴨病毒性肝炎、鴨瘟二聯(lián)卵黃抗體凍干粉。本發(fā)明通過對發(fā)病率高的地區(qū)采樣分離病毒，篩選出覆蓋面較廣的病毒株，制備疫苗，并將卵黃溶液冷、熱酸化處理，減少抗體損失，得到的卵黃抗體凍干粉回收率高、純度高、溶解快、見效快、無臨床副作用。
文檔編號A61K9/19GK102772799SQ20121017570
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權日2012年5月31日
發(fā)明者吳紅云, 徐榮君, 徐進, 郭俊清 申請人:鄭州后羿制藥有限公司